羅慧英，鮑慧中，吳步梅，馬天玥，張文利，方彩霞，魏永波

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州 730101）（2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，隴藥產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新研究院，西北中藏藥省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，甘肅蘭州 730000）（3.蘭州市農(nóng)業(yè)科技研究推廣中心，甘肅蘭州 730010）（4.中國(guó)藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 211198）（5.皋蘭百璐通瓜果專業(yè)合作社，甘肅皋蘭 730200）

軟兒梨也叫凍梨、香水梨，是甘肅特色水果。軟兒梨每年深秋采摘，新鮮果品口味欠佳，果肉較硬而味酸，入口有噎嗓子的感覺，經(jīng)過西北寒冽氣候下40 多天的儲(chǔ)存糖化后，果皮變黑，果肉發(fā)酵軟化，果糖含量增加，此時(shí)食用不僅梨軟如泥，漿液充盈，味甜似蜜，還具有生津化痰、潤(rùn)燥止咳、清熱解毒、滋身祛疾之功效，是藥食兼?zhèn)涞拿钇穂1,2]。軟兒梨清甜的口感和豐富的營(yíng)養(yǎng)以及特殊的吃法，使其成為當(dāng)?shù)厝藗兌镜囊坏捞厣朗场?015 年被農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為“全國(guó)農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”。蘭州年產(chǎn)軟兒梨3 萬多t，但是由于技術(shù)原因，除直接食用和簡(jiǎn)單加工后制成果汁、果酒外，未見高附加值的下游產(chǎn)品，資源浪費(fèi)巨大，高值化、多品類的開發(fā)利用成為現(xiàn)今迫切需求。

冬季是呼吸道疾病的高發(fā)季節(jié)。中醫(yī)認(rèn)為“肺主宣發(fā)和肅降”，肺氣宣發(fā)通暢，則能主一身之氣而呼吸調(diào)勻，助血液循環(huán)而貫通百脈。但肺臟很容易受外邪侵襲，如果受到風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火六淫的侵襲，而造成肺失宣降，肺氣上逆，引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病。呼吸系統(tǒng)疾病的主要臨床癥狀一般為咳、痰、喘、炎。西醫(yī)認(rèn)為這四大癥狀往往同時(shí)存在，互為因果，其中炎癥是主導(dǎo)因素[3,4]。炎癥時(shí)會(huì)活化和釋放大量致炎因子，這些物質(zhì)可誘發(fā)和加重咳嗽，反復(fù)咳嗽對(duì)呼吸道是一種機(jī)械刺激，可引起粘膜充血，呼吸道分泌物增多，進(jìn)而增加痰液，痰液進(jìn)一步刺激呼吸道感受器，加重咳嗽和炎癥；同時(shí)劇烈咳嗽還可引起支氣管痙攣而誘發(fā)哮喘，增加呼吸困難；同時(shí)，支氣管痙攣會(huì)加劇呼吸阻力，使肺泡膨脹，刺激牽張感受器，使咳嗽加重；另外，大量痰液也可阻塞細(xì)小支氣管，誘發(fā)和加重哮喘[5-7]。因此，緩解和消除炎癥是治療呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)鍵?！侗静菥V目》記載軟兒梨有潤(rùn)肺、止咳、涼心消炎等多種功效，但其作用機(jī)制研究甚少。本研究旨在探討軟兒梨的抗炎抗氧化作用，以期為其用于止咳、化痰、平喘提供理論與試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑與儀器

軟兒梨凍梨，由甘肅皋蘭百璐通瓜果專業(yè)合作社提供，自然解凍后剝?nèi)ケ砥と≡? 000 mL（相當(dāng)于軟兒梨凍梨1 460.70 g），經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定，總酚含量為149.14 mg/kg、總黃酮含量為58.23 mg/kg[8]；SPF級(jí)昆明小鼠40 只，體質(zhì)量18～20 g，雌雄各半，雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量180～200 g，雌雄各半，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（甘）2015-0002；二甲苯，江陰歐辰化工有限公司；超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSH-Px）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、前列腺素E2（Prostaglandin E2，PGE2）檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為：20220312、20220410、20220322、20220401、20 220502；UV-5500 型紫外分光光度計(jì)、SUNRISE 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，瑞士TECAN 公司；TDL-5M 臺(tái)式大容量低溫離心機(jī)，上海精密儀器儀表有限公司；全自動(dòng)血球計(jì)數(shù)儀，南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.2 小鼠二甲苯耳腫脹試驗(yàn)

SPF 級(jí)昆明種小鼠50 只，隨機(jī)分為5 組，分別為空白組、模型組、軟兒梨高中低劑量組[20、15、10 mL/(kg bw)]，空白組與模型組為生理鹽水；每天灌胃給藥1 次，連續(xù)10 d。于最后1 次給藥1 h 后，除空白組外，其他組每只小鼠右耳前后兩面涂抹質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%二甲苯300 μL 致炎，左耳對(duì)照。1 h 后所有動(dòng)物眼眶取血，枸櫞酸鈉抗凝，全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定外周血白細(xì)胞數(shù)量變化。處死小鼠，摘取胸腺和脾臟，計(jì)算胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。沿耳廓基線剪下雙耳，7 mm打孔器于雙耳同一位置打下圓形耳片，電子天平稱質(zhì)量后，按公式計(jì)算鼠耳腫脹度和腫脹抑制率。

式中：

B——臟器指數(shù)，%；

W1——臟器質(zhì)量，g；

W2——體質(zhì)量，g。

式中：

D——腫脹抑制率，%；

E0——對(duì)照組腫脹度；

E1——給藥組腫脹度。

1.3 大鼠蛋清足腫脹試驗(yàn)

SD 大鼠40 只，隨機(jī)分為5 組，分別為空白組、模型組、軟兒梨高中低劑量組[20、15、10 mL/(kg bw)]，空白組與模型組為生理鹽水；每天灌胃給藥1 次，連續(xù)10 d。于最后1 次給藥1 h 后，測(cè)定每只大鼠右足足容積作為致炎前值，隨后除空白組外，所有動(dòng)物右足足底掌內(nèi)注射新鮮蛋清0.05 mL，于注射結(jié)束2 h 和4 h 測(cè)量所有動(dòng)物右足足容積，計(jì)算腫脹度（致炎前后右足足容積之差）。大鼠最后一次足容積測(cè)定結(jié)束后，眼球取血，離心取血清，試劑盒測(cè)定SOD、GSH-Px 和CAT 活性及MDA 含量。處死大鼠，剪取右足，剝皮，剪碎，稱質(zhì)量。置于5 mL 生理鹽水中浸泡1 h，離心取上清1 mL，加入0.5 mol/L KOH 甲醇溶液50 ℃水浴反應(yīng)20 min 后，甲醇稀釋至20 mL，278 nm 處測(cè)吸光度值（A），以每克炎性組織的吸光度值代表PGE2 的含量。

1.4 體外自由基清除試驗(yàn)

軟兒梨原汁用雙蒸水分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.73、0.37、0.19、0.1、0.05、0.03 g/mL，采用水楊酸法根據(jù)公式（3）測(cè)定軟兒梨對(duì)羥基自由基（OH·）的清除能力。采用鄰苯三酚自氧化法根據(jù)公式（4）測(cè)定軟兒梨對(duì)超氧陰離子自由基（O2-·）的清除的能力。DPPH 自由基清除力測(cè)定方法簡(jiǎn)介如下：移取質(zhì)量濃度為0.13 mmol/L 的DPPH 溶液2.0 mL、乙醇2.0 mL 置入帶蓋試管中，避光室溫放置30 min，采用酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定對(duì)照液吸光度值（A0），然后以不同濃度軟兒梨溶液代替乙醇，重復(fù)操作，測(cè)定吸光度值（A1），以不同濃度軟兒梨溶液代替DPPH 溶液，重復(fù)操作，測(cè)定吸光度值（A2），Vc 作為陽性對(duì)照，按公式（3）計(jì)算DPPH 自由基清除率。采用ELISA Calc 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行四參數(shù)擬合，繪制擬合曲線，并計(jì)算半數(shù)清除濃度（IC50）。

式中：

C1——羥基自由基（OH·）和DPPH 自由基的清除力；

A0——對(duì)照液吸光度；

A1——水解液吸光度；

A2——參比液吸光度。

式中：

C2——超氧陰離子自由基（O2-·）清除力；

K0——對(duì)照組吸光度變化斜率；

K1——測(cè)定組吸光度變化斜率。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 20.0 軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 軟兒梨對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

炎癥（Inflammation）是機(jī)體對(duì)于刺激的一種防御性反應(yīng)，是損傷、抗損傷和修復(fù)的動(dòng)態(tài)過程，主要表現(xiàn)有紅、腫、熱、痛和功能障礙。炎癥時(shí)大量炎性介質(zhì)的釋放使血管擴(kuò)張、液體滲出增加形成水腫，白細(xì)胞增多，單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)細(xì)胞增生等。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二甲苯刺激后模型組小鼠外周血中白細(xì)胞總數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量以及單核細(xì)胞數(shù)量明顯升高，分別達(dá)到4.11、0.71、1.45、0.031 K/μL（見圖1），胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（見表1），提示炎癥形成，右耳出現(xiàn)明顯腫脹，與左耳比較，腫脹率達(dá)97.31%（見表2）。與模型組比較，軟兒梨可明顯降低白細(xì)胞總數(shù)量、中性粒細(xì)胞數(shù)量、淋巴細(xì)胞數(shù)量以及單核細(xì)胞數(shù)量，降低胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，且作用呈劑量依賴性（P＜0.05）；軟兒梨組小鼠右耳的腫脹情況明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.05），腫脹率明顯降低，高劑量組腫脹抑制率達(dá)36.16%（P＜0.05），提示軟兒梨可能通過抑制白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞的產(chǎn)生與募集緩解二甲苯所致小鼠的耳腫脹。

表1 軟兒梨對(duì)二甲苯致炎小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of Ruanerli on viscera index in xylene-induced inflammation mice (,n=10)

表1 軟兒梨對(duì)二甲苯致炎小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of Ruanerli on viscera index in xylene-induced inflammation mice (,n=10)

注：與模型組比較，P*＜0.05，P**＜0.01；下同。

表2 軟兒梨對(duì)二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響Table 2 Effect of Ruanerli on ear swelling in xylene-induced inflammation mice (,n=10)

表2 軟兒梨對(duì)二甲苯致炎小鼠耳腫脹的影響Table 2 Effect of Ruanerli on ear swelling in xylene-induced inflammation mice (,n=10)

圖1 軟兒梨對(duì)二甲苯致炎小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.1 Effect of Ruanerli on the number of leukocytes in xylene-induced inflammation mice (,n=10)

2.2 軟兒梨對(duì)蛋清致大鼠足腫脹的影響

研究表明，體內(nèi)氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡對(duì)于機(jī)體維持正常生理功能至關(guān)重要。人體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)主要包括兩類：（1）抗氧化酶系統(tǒng)，主要有CAT、GSH-Px、SOD 等[9,10]。其中SOD 起著不可忽視作用。在機(jī)體內(nèi)SOD 主要以兩種形式存在：含有銅鋅的CuZn-SOD 和含錳的Mn-SOD。CuZn-SOD 主要存在于細(xì)胞液，Cu 是組成酶分子活性中心結(jié)構(gòu)的最重要成分，參與傳遞電子；Zn 不參與催化，但對(duì)此酶分子的催化起支持作用。Mn-SOD 主要存在于線粒體內(nèi)，在抗氧化酶中起至關(guān)重要的作用[11-13]。CAT 及其他過氧化物酶都是含有鐵元素的酶，主要作用都是不斷清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的氧化代謝產(chǎn)物，阻止氧化性更強(qiáng)產(chǎn)物的產(chǎn)生[14]。GSH-Px 是體內(nèi)廣泛存在的一種酶，硒是此酶的主要活性成分，能把GSH 催化成GSSG，把有毒的過氧化物還原成了無毒的羥基化合物[15]，同時(shí)促進(jìn)H2O2的分解，保護(hù)了細(xì)胞膜免受自由基損害[16]。（2）非酶抗氧化系統(tǒng)，主要由具有抗氧化活性的營(yíng)養(yǎng)素構(gòu)成，如麥角硫因、維生素C、維生素E、谷胱甘肽等[17,18]。兩類抗氧化系統(tǒng)之間相互依存、相互補(bǔ)充、相互協(xié)調(diào)，共同構(gòu)成了機(jī)體的抗氧化防御體系，維持機(jī)體各項(xiàng)生理機(jī)能的平衡。當(dāng)內(nèi)外環(huán)境刺激強(qiáng)度增加，活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）等的產(chǎn)生速度和產(chǎn)生量不斷增加，同時(shí)因氧化應(yīng)激的影響，機(jī)體清除氧自由基及其他自由基的能力不斷減弱，此時(shí)氧化程度大于氧化物的清除速度，體內(nèi)氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡，引起大量ROS 等的堆積，誘發(fā)一系列的氧化應(yīng)激損傷，導(dǎo)致機(jī)能的病理學(xué)改變。增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶的活性，可有效清除過多的自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而減輕炎癥[14]。在本研究中，經(jīng)注射蛋清2 h 后空白組大鼠右足出現(xiàn)明顯腫脹，4 h 后腫脹雖稍有緩解，但致炎因子PGE2的水平仍然很高，達(dá)0.76 μg/L（見表3）。與空白組比較，軟兒梨組小鼠右足的腫脹情況明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.05），致炎因子PGE2 的水平有所降低，作用與劑量呈正相關(guān)。血清生化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，注射蛋清4 h，與空白組比較，模型組大鼠血清中抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低（分別是：3.26、3.89、0.16 mkat/mL），MDA 含量顯著增加，達(dá)到2.89 nmol/L（P＜0.05）。軟兒梨組血清中抗氧化酶活性明顯高于空白組（P＜0.05），氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA 的含量也相對(duì)較低（P＜0.05），作用與劑量正相關(guān)（圖2），提示軟兒梨可能通過增加大鼠體內(nèi)抗氧化物酶活性、減少致炎因子產(chǎn)生、清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物等作用緩解蛋清所致大鼠的足腫脹。

表3 軟兒梨對(duì)蛋清致炎大鼠足腫脹的影響Table 3 Effect of Ruanerli on foot swelling in egg white-induced inflammation rats (,n=10)

表3 軟兒梨對(duì)蛋清致炎大鼠足腫脹的影響Table 3 Effect of Ruanerli on foot swelling in egg white-induced inflammation rats (,n=10)

圖2 軟兒梨對(duì)蛋清致炎大鼠血清抗氧化酶的影響Fig.2 Effect of Ruanerli on serum antioxidant enzymes in egg white-induced inflammatory rats (,n=10)

2.3 軟兒梨體外自由基清除作用結(jié)果

當(dāng)機(jī)體遇到有害刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生一系列的反應(yīng)，即氧化應(yīng)激反應(yīng)，以適應(yīng)、減少或逃避損害，如產(chǎn)生活性氧自由基（Reactive Oxygen Species，ROS）、活性氮自由基（Reactive Nitrogen Species，RNS）等。ROS主要包括超氧陰離子自由基（O2-·）、羥自由基（OH·）、和過氧化氫（H2O2）等[19,20]。這些自由基可以與細(xì)胞膜上的脂類成分結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性；攻擊細(xì)胞內(nèi)生物酶及活性組分，使其失去功能；自由基代謝產(chǎn)物中的醛類可與細(xì)胞內(nèi)含氮物質(zhì)（蛋白質(zhì)、核酸、腦磷脂）發(fā)生交聯(lián)，使其失去活性。這些統(tǒng)稱為氧化應(yīng)激損傷[21-23]。氧化應(yīng)激產(chǎn)物如白三烯、血栓素等均為促炎物質(zhì)，會(huì)使血管擴(kuò)張，并促進(jìn)白細(xì)胞游走，誘發(fā)炎癥[24]。減少自由基的產(chǎn)生或加快其清除，不但可減輕自由基所致氧化應(yīng)激損傷，維持細(xì)胞功能，還可以緩解炎癥。本研究發(fā)現(xiàn)，在檢測(cè)濃度范圍內(nèi)，軟兒梨對(duì)DPPH 自由基、OH 自由基和O2-自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用，且隨著濃度的升高，清除能力逐漸升高。根據(jù)ELISA Calc 軟件得到DPPH 自由基清除作用四參數(shù) Logistic 曲線擬合方程 ：y=(35.36-0.38)/[1+(x/0.26)-2.36]+0.38，r2=1.00，半數(shù)清除質(zhì)量濃度（IC50）為0.26 g/mL。OH 自由基清除作用四參數(shù)Logistic曲線擬合方程：y=(48.54-0.02)/[1+(x/0.23)-1.57]+0.02，r2=1.00，IC50為0.23 g/mL。O2-自由基清除作用四參數(shù)Logistic 曲線擬合方程：y=(57.97-5.28)/[1+(x/0.27)-1.29]+5.28，r2=1.00，IC50為0.27 g/mL，結(jié)果見圖3。

圖3 軟兒梨對(duì)自由基的清除作用Fig.3 Scavenging effect of Ruanerli on free radicals (n=3)

3 結(jié)論

本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明軟兒梨可以明顯抑制二甲苯所致小鼠的耳腫脹，降低蛋清致炎大鼠腫脹足掌中PGE2 含量和血清中MDA 含量，降低蛋清致炎大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增強(qiáng)蛋清致炎大鼠血清中抗氧化物酶SOD、CAT 和GSH-Px 活性。體外自由基清除試驗(yàn)證明，軟兒梨對(duì)DPPH 自由基、OH 自由基和O2-自由基均表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除作用，且作用呈劑量依賴性，提示軟兒梨可能通過增強(qiáng)抗氧化酶活性，清除過多自由基，減輕氧化應(yīng)激損傷，減少致炎因子的釋放來發(fā)揮抗炎作用。