韋 唯，譚冰燕，朱 禹，萬(wàn) 李，吳賢波△

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)（貴陽(yáng) 550001）；2.成都體育學(xué)院（成都 610041）

過(guò)敏煎出自《祝諶予經(jīng)驗(yàn)集》的經(jīng)驗(yàn)方，用于治療蕁麻疹、支氣管哮喘、過(guò)敏性鼻炎、濕疹等過(guò)敏性疾病[1]?！耙云ぶ纹ぁ痹从谥嗅t(yī)“取象比類(lèi)”的思想，以動(dòng)植物的皮部入藥治療皮膚病，是中醫(yī)藥治療皮膚病的一大特色，歐陽(yáng)恒[2]、艾儒棣[3]、韓世榮[4]等教授運(yùn)用此法治療各類(lèi)皮膚病并取得了良好的療效。加味過(guò)敏煎是吳賢波教授在“以皮治皮”理論指導(dǎo)下，于過(guò)敏煎基礎(chǔ)上加白鮮皮、蟬蛻組成，主要用于治療各種過(guò)敏性疾病。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分，是通過(guò)系統(tǒng)研究新陳代謝動(dòng)態(tài)過(guò)程中代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，從而揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)[5]，主要分為靶向、非靶向代謝組學(xué)。其中，非靶向分析模式能夠?qū)⑸矬w內(nèi)代謝水平的擾動(dòng)情況最大程度反映出來(lái)，側(cè)重于系統(tǒng)性和整體性分析。

課題組前期研究[6]發(fā)現(xiàn)，臨床上加味過(guò)敏煎改善瘙癢癥狀等方面優(yōu)于過(guò)敏煎（P＜0.05）；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7]也證實(shí)，加味過(guò)敏煎改善特應(yīng)性皮炎小鼠模型瘙癢、皮損等方面作用明顯優(yōu)于過(guò)敏煎（P＜0.05）。研究結(jié)果提示，在“以皮治皮”理論指導(dǎo)下，加味過(guò)敏煎治療過(guò)敏性皮膚病瘙癢癥狀的效果優(yōu)于過(guò)敏煎。本文擬在前期研究基礎(chǔ)上，通過(guò)非靶向代謝組的方法研究過(guò)敏煎、加味過(guò)敏煎大鼠灌胃后其血清的差異代謝物，采用生物信息學(xué)方法分析差異代謝物的種類(lèi)、調(diào)控機(jī)制及功能作用等，為進(jìn)一步研究加味過(guò)敏煎緩解瘙癢癥狀的機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Vanquish超高效液相、Orbitrap Exploris 120高分辨質(zhì)譜、Heraeus Fresco17離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，美國(guó)）；BSA124S-CW天平（Sartorius，德國(guó)）；JXFSTPRP-24研磨儀（上海凈信科技有限公司）；明澈 D24 UV純水儀（Merck Millipore，德國(guó)）；YM-080S超聲儀（深圳市方奧微電子有限公司）；色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）（沃特斯公司，美國(guó)）。

1.2 材料

甲醇 （色譜純，CNW Technologies，德國(guó)，批號(hào) 67-56-1）；乙腈（色譜純，CNW Technologies，德國(guó)，批號(hào) 75-05-8）；甲酸（色譜純，Sigma，美國(guó)，批號(hào) 64-18-6）；L-2-氯苯丙氨酸（上海恒柏生物科技有限公司，批號(hào)103616-89-3）。

過(guò)敏煎、加味過(guò)敏煎處方所需的藥材飲片均符合2020 版《中國(guó)藥典》質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。防風(fēng)（安國(guó)祁安藥業(yè)有限公司，批號(hào)：201204）；烏梅[北京本草方源（亳州）藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)：220701]；銀柴胡[北京本草方源（亳州）藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)：210401]；五味子（河北楚風(fēng)中藥飲片有限公司，批號(hào)：B22060702-01）；甘草[北京本草方源（亳州）藥業(yè)科技有限公司，批號(hào)：220501]；蟬蛻（黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：D22020101）；白鮮皮（北京仟草中藥飲片有限公司，批號(hào)：211005001）。備齊處方中所需的藥材，委托福州凍干粉制備實(shí)驗(yàn)室完成凍干粉制備。

1.3 動(dòng)物

健康的雄性SD大鼠，SPF級(jí)，體重（200±10）g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（川）2020-030。實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）（沃特斯公司，美國(guó)），進(jìn)樣量：2 μL；分析柱保持在30 ℃，進(jìn)樣器樣品盤(pán)15 ℃，用0.1%（v/v）甲酸水溶液（溶劑B）和乙腈（溶劑A）進(jìn)行梯度洗脫。

1.4.2 質(zhì)樸條件 正離子模式：電噴霧電離（electrosprayionization，ESI）；離源霧電壓：3 800 V；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；掃描范圍：70～1 000 m/z；分步碰撞能量的強(qiáng)度取值：3；分步碰撞能量：20、40、60 eV；掃描速率均為7 Hz。負(fù)離子模式：ESI；離源霧電壓：-3 100 V；毛細(xì)管溫度：320 ℃；鞘氣流速：45 Arb；輔助氣流速：15 Arb；掃描范圍：70～1 000 m/z；分步碰撞能量的強(qiáng)度取值：3；分步碰撞能量：20、40、60 eV；掃描速率均為7 Hz。在兩種離子模式下，均進(jìn)行一級(jí)（分辨率：70 000）、二級(jí)（分辨率：17 500）質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，獲取代謝原始數(shù)據(jù)。

1.4.3 血清樣品采集 取SD大鼠6只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為過(guò)敏煎組、加味過(guò)敏煎組，每組3 只。過(guò)敏煎組以生藥量72.38 g/kg作為給藥劑量進(jìn)行灌胃給藥，加味過(guò)敏煎組以生藥量81.00 g/kg作為給藥劑量進(jìn)行灌胃給藥。早、中、晚各給藥1次，連續(xù)給藥3 d，末次給藥前12 h禁食不禁水。分別于末次給藥后60 min從大鼠腹主動(dòng)脈采集血樣，常溫放置血樣1 h，待其凝固分層后，在室溫下以轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心半徑 8.6 cm，離心10 min，取上清液，4 ℃以轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心10 min，再次取上清，分裝于1.5 mL離心管中，每管0.2 mL，凍存于-80 ℃冰箱中。

1.4.4 血清樣品處理 將40 μL鹽酸（2 mol/L）加入400 μL的血清樣本中，進(jìn)行1 min的渦旋混合，于4 ℃環(huán)境下靜置15 min，重復(fù)該步驟4 次；隨后注入1.6 mL的乙腈，進(jìn)行5 min的渦旋混合，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心5 min，取上清1 800 μL，氮吹干燥；加入150 μL 80%甲醇（內(nèi)標(biāo)濃度為10 mg/L）復(fù)溶，渦旋5 min，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min，離心半徑8.6 cm，離心5 min；吸取120 μL上清液，放入進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。1.4.5 數(shù)據(jù)分析 采集過(guò)敏煎血清和加味過(guò)敏煎血清在“1.4.1”項(xiàng)、“1.4.2”項(xiàng)條件下的數(shù)據(jù)。使用XCMS網(wǎng)站（https：//xcmsonline.scripps.edu），將質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入并處理。處理過(guò)程包括保留時(shí)間矯正、峰識(shí)別、峰提取、峰積分、峰對(duì)齊等。在鑒定含有二級(jí)碎片離子信息數(shù)據(jù)的峰的化合物時(shí)，利用上海百趣生物醫(yī)學(xué)科技有限公司提供的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)和相應(yīng)裂解規(guī)律匹配方法。

2 結(jié)果

2.1 主成分分析

對(duì)過(guò)敏煎含藥血清和加味過(guò)敏煎含藥血清進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）。圖中的1 個(gè)點(diǎn)代表1 個(gè)樣本，藍(lán)色點(diǎn)代表過(guò)敏煎含藥血清，黃色點(diǎn)代表加味過(guò)敏煎含藥血清。從圖中可以看出，兩組的樣本分別有一定的聚集成群趨勢(shì)，這說(shuō)明過(guò)敏煎含藥血清和加味過(guò)敏煎含藥血清的代謝物存在明顯差異。本次數(shù)據(jù)質(zhì)量高，檢測(cè)性好，所采集的數(shù)據(jù)可以進(jìn)行下一步分析（圖1）。

表1 差異代謝物差異倍數(shù)Top20 鑒定結(jié)果

圖1 過(guò)敏煎和加味過(guò)敏煎的PCA得分圖

2.2 正交偏最小二乘法-判別分析

通過(guò)SIMCA （V16.0.2，Sartorius Stedim Data Analytics AB，瑞典）軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理。首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，以及數(shù)據(jù)中心化后除以列變量標(biāo)準(zhǔn)差；然后用正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA）建模，對(duì)第一主成分進(jìn)行分析，再用7折交叉驗(yàn)證檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷馁|(zhì)量；利用交叉驗(yàn)證得到R2Y（模型對(duì)分類(lèi)變量Y的可解釋性）和Q2（模型的可預(yù)測(cè)性），然后用R2Y和Q2對(duì)模型的有效性進(jìn)行評(píng)判；最后通過(guò)置換檢驗(yàn)得到不同的隨機(jī)Q2值，從而對(duì)模型的有效性做進(jìn)一步檢驗(yàn)。正離子、負(fù)離子模式下，樣本在空間位置上聚類(lèi)明顯，分成兩組，表明OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠，組間有明顯差異。置換檢驗(yàn)結(jié)果顯示，置換保留度與隨機(jī)模型的R2、Q2呈正比，說(shuō)明模型穩(wěn)健性良好，不存在過(guò)擬合現(xiàn)象（圖2～3）。

圖2 過(guò)敏煎和加味過(guò)敏煎的PCA得分圖

圖3 過(guò)敏煎和加味過(guò)敏煎的置換檢驗(yàn)圖

2.3 差異代謝物篩選

將差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）＞1.2 或＜0.83，變量投影重要度（variable mportance in the projection，VIP）＞1 且P＜0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，篩選所得的差異代謝物為過(guò)敏煎含藥血清與加味過(guò)敏煎含藥血清的差異性代謝物。將樣本中正、負(fù)離子模式所得到的數(shù)據(jù)合并分析后，一共篩選出差異代謝物173 個(gè)（圖4）。其中，屬于生物堿類(lèi)代謝物的22 個(gè)，屬于芳香族化合物類(lèi)代謝物的4 個(gè)，屬于苯丙素類(lèi)代謝物的31 個(gè)，屬于黃酮類(lèi)代謝物的26 個(gè)，屬于醌類(lèi)代謝物的3 個(gè)，屬于氨基酸衍生物類(lèi)代謝物的2 個(gè)，屬于酚類(lèi)代謝物的6 個(gè)，屬于脂質(zhì)類(lèi)代謝物的2 個(gè)，屬于脂肪酰類(lèi)代謝物的2 個(gè)，屬于脂肪酸類(lèi)代謝物的1 個(gè)，屬于萜類(lèi)代謝物的26 個(gè)。和過(guò)敏煎含藥血清相比，有86 個(gè)上調(diào)和87 個(gè)下調(diào)代謝物存在于加味過(guò)敏煎含藥血清中。通過(guò)人類(lèi)代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索這173 個(gè)差異代謝物，從而獲取生物學(xué)特性數(shù)據(jù)，并呈現(xiàn)前20 位差異倍數(shù)的代謝物（表1）。

圖4 過(guò)敏煎和加味過(guò)敏煎的差異代謝物火山圖

2.4 代謝通路分析

將鑒定出來(lái)的173 個(gè)差異代謝物提交至MetaboAnalyst 5.0 進(jìn)行通路分析，將過(guò)敏煎含藥血清與加味過(guò)敏煎含藥血清樣本中顯著性的差異代謝物注釋到10條代謝通路中（表2、圖5）。圖中橫軸表示通路的拓?fù)浞治?，縱軸表示通路的富集分析（P），節(jié)點(diǎn)顏色越深表示P值越小，節(jié)點(diǎn)半徑越大表示impact越大。根據(jù)P＜0.05且impact＞0，最后共篩選出2條通路：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成通路以及維生素B6 的代謝通路。酪氨酸為富集在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路上的差異氨基酸，吡哆醇為富集在維生素B6代謝通路上的差異生物堿（表3）。

表2 差異性代謝物涉及的代謝通路

表3 2 條代謝通路所匹配的差異代謝物

圖5 差異代謝物的相關(guān)代謝通路

3 討論

過(guò)敏煎由防風(fēng)、烏梅、五味子、銀柴胡、甘草組成。防風(fēng)辛溫，解表散風(fēng)勝濕強(qiáng)，善行皮毛與經(jīng)脈之氣；烏梅酸收性平，既可收斂肺氣，亦可溫養(yǎng)肌膚；銀柴胡味甘辛涼，疏風(fēng)散邪，清邪壅郁熱，透熱涼血；五味子酸甘而溫，益氣斂肺，補(bǔ)腎養(yǎng)陰。藥理學(xué)研究[8]表明，防風(fēng)、烏梅、五味子、銀柴胡4 味單藥均具有抗過(guò)敏的作用[7]；甘草性平，一可補(bǔ)脾益氣，二能調(diào)和諸藥。五味藥共奏祛風(fēng)解表，扶正祛邪之功。加味過(guò)敏煎在過(guò)敏煎的基礎(chǔ)上增加了白鮮皮、蟬蛻，白鮮皮為蕓香科植物白鮮的干燥根皮，能夠清熱解毒、祛風(fēng)除濕止癢，藥理學(xué)研究[9]表明其有抗菌、抗炎與抗變態(tài)反應(yīng)等作用。蟬蛻是蟬科昆蟲(chóng)蚱蟬羽化時(shí)蛻下的殼，其體輕浮，善走皮腠，可疏散風(fēng)熱、透疹、祛風(fēng)止痙、治癮疹，藥理研究[10]表明，蟬蛻具有抗驚厥、抗炎、免疫抑制及抗過(guò)敏等作用。二者均為動(dòng)植物的皮部藥，二皮共用意在“以皮治皮”，增強(qiáng)祛風(fēng)止癢之效。加味過(guò)敏煎的7 味藥共奏祛風(fēng)止癢除濕、養(yǎng)陰潤(rùn)燥生津之功。

本實(shí)驗(yàn)基于非靶代謝組學(xué)技術(shù)分析大鼠灌胃過(guò)敏煎、加味過(guò)敏煎復(fù)方后，其血清中代謝物的變化，采用PCA、OPLS-DA、聚類(lèi)分析等方法識(shí)別大鼠血清樣本數(shù)據(jù)變化模式。根據(jù)PCA和OPLS-DA結(jié)果可知，不同處理樣本點(diǎn)分布明顯分離，表明過(guò)敏煎和加味過(guò)敏煎含藥血清中的代謝物存在明顯差異。根據(jù)FC＞1.2 或＜0.83，VIP＞1 且P＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)篩選出差異代謝物173個(gè)，將這173個(gè)差異代謝物用MetaboAnalyst 5.0進(jìn)行通路富集分析，分析結(jié)果顯示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成與維生素B6代謝這兩條通路可作為加味過(guò)敏煎治療效果區(qū)別于過(guò)敏煎的主要代謝通路，酪氨酸、吡哆醇分別為這兩條通路所匹配的代謝物。

酪氨酸為氨基酸的衍生物，其與苯丙氨酸、色氨酸一同屬于芳香族氨基酸。芳香族氨基酸是人體內(nèi)許多重要生物化合物的前體，其中，酪氨酸與神經(jīng)元的傳遞關(guān)系密切，是一種神經(jīng)遞質(zhì)前體[11]。除了作為神經(jīng)遞質(zhì)的前體，酪氨酸還可被專(zhuān)門(mén)的蛋白激酶磷酸化[12]。酪氨酸磷酸化是調(diào)節(jié)酶活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要步驟。研究[13]指出，酪氨酸和FcεRIβ之間的相互作用對(duì)于肥大細(xì)胞活化至關(guān)重要；研究[14]提出，酪氨酸與小鼠模型中嚴(yán)重的過(guò)敏性哮喘有關(guān)，并且是高表達(dá)的血液嗜酸性粒細(xì)胞的關(guān)鍵分子；而研究[15]提出，酪氨酸的微生物代謝可防止氣道過(guò)敏性炎癥。以上研究說(shuō)明酪氨酸對(duì)信號(hào)通路可能具有雙向調(diào)節(jié)作用。

映射在維生素B6 代謝通路上的差異代謝物有1 個(gè)，即吡哆醇。吡哆醇是具有維生素B6 作用的物質(zhì)之一，在維持表皮功能方面起著重要作用，目前多用于治療痤瘡和皮膚粗糙。特應(yīng)性皮炎與角質(zhì)形成細(xì)胞的異常相關(guān)，角質(zhì)形成細(xì)胞的異?？墒菇z聚蛋白的表達(dá)下降，進(jìn)而影響表皮的分化、角化、破壞皮膚屏障功能，促進(jìn)特應(yīng)性皮炎的產(chǎn)生[16]。調(diào)節(jié)絲聚蛋白的表達(dá)被認(rèn)為是治療和預(yù)防特應(yīng)性皮炎的一種前瞻性策略。研究[17]發(fā)現(xiàn)，吡哆醇可增加正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中絲聚蛋白的表達(dá)和產(chǎn)生，這表明吡哆醇是一種有益的化合物，有利于防止特應(yīng)性皮炎的惡化和復(fù)發(fā)。

綜上所述，本研究從過(guò)敏煎、加味過(guò)敏煎的含藥血清中發(fā)現(xiàn)酪氨酸和吡哆醇2 個(gè)差異代謝物。結(jié)合課題組的前期研究分析，加味過(guò)敏煎在臨床改善瘙癢癥狀等方面、在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中改善特應(yīng)性皮炎小鼠模型瘙癢、皮損等方面作用明顯優(yōu)于過(guò)敏煎，可能與差異代謝物酪氨酸和吡哆醇有關(guān)，具體機(jī)制還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。