梁 陽(yáng)，鄧一林，吳佩玲，毛 俐△，汪廣杰

1.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 病理科（成都 610083）；2.成都醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院（成都 610500）；3.中國(guó)人民解放軍西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 腫瘤科（成都 610083）

近年來(lái)，甲狀腺癌已經(jīng)成為我國(guó)常見(jiàn)的惡性?xún)?nèi)分泌腫瘤，約70%～80%甲狀腺癌屬于甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）[1]。PTC易局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，因此尋找新的預(yù)后診斷標(biāo)志物，對(duì)PTC患者臨床預(yù)后有重要意義。miRNA是一類(lèi)非編碼短鏈RNA的總稱(chēng)，多數(shù)情況下通過(guò)結(jié)合靶基因mRNA 3'-非翻譯區(qū)，導(dǎo)致mRNA降解或翻譯沉默[2-3]。文獻(xiàn)研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，miR-221-3p在多種腫瘤中異常表達(dá)，并影響腫瘤患者臨床預(yù)后。目前研究[6]僅發(fā)現(xiàn)BRAF V600E基因在PTC中異常表達(dá)，且對(duì)PTC預(yù)后研究甚少。本研究旨在探討miR-221-3p在PTC組織中的表達(dá)水平及其與患者臨床病理特征和預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2020 年10 月至2021 年7 月西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的PTC患者26 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：1）首次診治，術(shù)前未接受任何治療；2）均經(jīng)甲狀腺全切或次全切手術(shù)后病理學(xué)確診為PTC；3）臨床病例資料完整，年齡≥18 歲；4）簽訂知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：1）合并甲狀腺其他疾病或其他部位惡性腫瘤者；2）有精神疾病者。PTC患者中，男7 例，女19 例；年齡26～84（46.23±12.67）歲；腫瘤最大直徑（1.55±1.34）cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9 例。另選取經(jīng)超聲穿刺病理活檢明確為健康者23 例作為對(duì)照組，其中，男6 例，女17 例；年齡26～60（41.89±10.31）歲。組間性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本試驗(yàn)研究經(jīng)成都醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：CMCEC-2022 No.18），所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 冰凍免疫組織化學(xué)染色 對(duì)臨床切除的甲狀腺組織行局部解剖術(shù)，區(qū)分正常甲狀腺組織及PTC組織，分別切取PTC組織及甲狀腺組織行冰凍切片檢查，連續(xù)切片3 張，切片厚度為5 μm，行蘇木素-伊紅染色。另分別切片行冰凍免疫組織化學(xué)染色，選取抗體為CK19，試劑盒由上海賽諾特生物技術(shù)有限公司提供。免疫組織化學(xué)染色具體步驟為：1）將冰凍切片粘附載玻片上，中性福爾馬林固定5 s，PBS沖洗10 s；2）用封閉劑封閉2 min，PBS沖洗20 s；3）滴加一抗CK19 10 μL，37 ℃溫箱孵育3 min，PBS沖洗3 次；4） 滴加二抗10 μL，37 ℃溫箱孵育3 min，PBS沖洗3 次；5）高敏DAB顯色，觀察顯色情況，用自來(lái)水沖洗，終止顯色；6）用蘇木精復(fù)染15 s，流水沖洗，封片。CK19 陰陽(yáng)性判讀標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞胞漿出現(xiàn)棕黃色判讀為陽(yáng)性，反之則為陰性。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）測(cè)定受試者甲狀腺組織miR-221-3p表達(dá)水平。收集PTC和正常甲狀腺新鮮組織，液氮凍存，稱(chēng)取80 g PTC組織和正常甲狀腺組織，Trizol試劑盒（Life Technologies，美國(guó)）提取組織中總RNA，測(cè)定RNA純度和濃度。取1 μg RNA 經(jīng)miRNA First Strand Synthesis Kit試劑盒（大連寶生物工程有限公司，中國(guó)）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用SYBR green染料法，內(nèi)參基因U6，經(jīng)miR-X miRNA qRT-PCR TB Green Kit試劑盒（大連寶生物工程有限公司）定量檢測(cè)miR-221-3p表達(dá)水平，每例樣本均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，95 ℃ qRT-PCR 5 s，60 ℃延伸20 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-221-3p相對(duì)表達(dá)水平。引物序列由上海生工生物有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PTC 組織與正常甲狀腺組織CK 19 表達(dá)情況

本研究中，26 例PTC組織及23 例正常甲狀腺組織均行術(shù)中冰凍免疫組織化學(xué)染色，所選免疫標(biāo)記為CK19，26 例PTC組織CK19 表達(dá)均為陽(yáng)性，23 例正常甲狀腺組織CK19 表達(dá)均為陰性（圖1）。

圖1 CK19 在PTC組織和正常甲狀腺組織中的表達(dá)情況

2.2 PTC 組織與正常甲狀腺組織中miR-221-3p 相對(duì)表達(dá)量比較

PTC組織中miR-221-3p相對(duì)表達(dá)量高于正常甲狀腺組織（P＜0.05）（表2）。

表2 PTC組織與正常甲狀腺組織中miR-221-3p相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 不同臨床病理特征PTC 患者miR-221-3p 表達(dá)水平比較

比較不同性別、年齡、腫瘤直徑和腫瘤病灶數(shù)的PTC患者miRNA-221-3p表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的PTC患者腫瘤組織中miR-221-3p 表達(dá)水平高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC患者（P＜0.05）（表3）。

表3 不同臨床病理特征PTC患者miR-221-3p表達(dá)水平比較

2.4 PTC 患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素分析

多因素Logistic回歸分析，采用向前似然比法，引入變量標(biāo)準(zhǔn)為α入=0.05，剔除標(biāo)準(zhǔn)為α出=0.10。以PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況為因變量，結(jié)果顯示，miR-221-3p自變量的OR值22.761，說(shuō)明PTC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中miR-221-3p高表達(dá)優(yōu)勢(shì)比是低表達(dá)的22.761 倍，為危險(xiǎn)因素；病灶數(shù)目和年齡雖優(yōu)勢(shì)比OR＞1，但陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生的條件概率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這可能因病例樣本量偏少引起。由此可見(jiàn)，miR-221-3p高表達(dá)為PTC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的主要危險(xiǎn)因素（表4）。

表4 PTC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移危險(xiǎn)因素分析

3 討論

PTC是一種起源于甲狀腺濾泡細(xì)胞的惡性腫瘤，近年來(lái)發(fā)病率持續(xù)增高，女性發(fā)病率遠(yuǎn)高于男性，且在疾病早期約有10%～15%的患者可以發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[7]。是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是PTC手術(shù)治療及預(yù)后的重要判斷依據(jù)之一。雖然現(xiàn)代超聲影像技術(shù)、細(xì)胞病理技術(shù)高度發(fā)展，但超聲TI-RADS分級(jí)診斷系統(tǒng)對(duì)4 級(jí)以上結(jié)節(jié)的惡性可能性評(píng)估范圍跨度較大（5%～100%）[8]，細(xì)針穿刺細(xì)胞活檢也依然存在因大小、部位、距體表距離而造成淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移證據(jù)漏診或不精準(zhǔn)的情況[9]。所以，尋找新型分子標(biāo)志物用于診斷、術(shù)前評(píng)估和預(yù)后治療顯得尤為重要。術(shù)中冰凍免疫組織化學(xué)染色技術(shù)應(yīng)用于術(shù)中冰凍腫瘤標(biāo)本，基于抗原抗體相結(jié)合的原理而出現(xiàn)快速高效的染色方法，已經(jīng)成為病理輔助診斷較為常用的染色方式，再結(jié)合蘇木素-伊紅染色可大大提高病理學(xué)對(duì)腫瘤性質(zhì)、類(lèi)型、來(lái)源等快速診斷的能力[10-11]。CK19 是上皮細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，分子量為40 kDa，免疫組織化學(xué)染色中主要用來(lái)標(biāo)記單層上皮，在鑒別甲狀腺各種腫瘤類(lèi)型方面具有較高的靈敏度和特異性[12-15]，尤其是結(jié)合蘇木素-伊紅染色技術(shù)后對(duì)PTC診斷更為精準(zhǔn)，為本研究選擇術(shù)中免疫組織化學(xué)染色抗體提供了理論依據(jù)。

miRNAs是一種長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸、無(wú)蛋白編碼能力的調(diào)節(jié)分子，其介導(dǎo)的調(diào)控是真核生物中最廣泛的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制之一，可能調(diào)控超過(guò)30%的哺乳動(dòng)物基因產(chǎn)物，參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡甚至器官形成等重要生命活動(dòng)[16-17]。miR-221-3p 編碼基因位于Xp11.3 染色體，并且在宮頸癌、肝癌、結(jié)腸癌、鼻咽癌等多種惡性腫瘤中異常上調(diào)表達(dá)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTC組織中miR-221-3p表達(dá)高于正常甲狀腺組織，提示PTC患者miR-221-3p高表達(dá)，進(jìn)一步納入臨床病例特征，通過(guò)Logistic多因素分析得出，miR-221-3p高表達(dá)為PTC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，本研究根據(jù)PTC具有發(fā)病率高、早期易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，采用術(shù)中冰凍診斷結(jié)合冰凍免疫組織化學(xué)染色的方法，極大提高了術(shù)中診斷PTC的準(zhǔn)確性，避免患者因診斷不清再次手術(shù)所帶來(lái)的創(chuàng)傷。術(shù)后通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測(cè)確定了PTC轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，對(duì)患者的預(yù)后評(píng)估及治療均提供了有效的檢測(cè)手段。