余德發(fā)，孫新琪，于肖輝,3，何春嬌，郭夢(mèng)月，駱驕陽，楊美華

1.江西康恩貝中藥有限公司，江西 上饒 334400；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，藥用植物研究所，中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.江西康恩貝天施康藥業(yè)有限公司，江西 鷹潭 335000

腸炎寧片是常見的胃腸道用藥，該制劑中包含的中藥分別為：金毛耳草、地錦草、楓樹葉、香薷和樟樹根。金毛耳草性涼味苦，能夠清熱，收斂止瀉；地錦草、楓樹葉的功效為清熱、解毒，能夠最大限度地使金毛耳草發(fā)揮其藥效；而香薷、樟樹根則是一種輔助性的藥材，具有祛風(fēng)、止痛、祛濕的特性［1］。腸炎寧片是一種多功能的復(fù)合物，能夠消除炎癥，改善腸道功能。它可以治療腸炎，包括急性胃腸炎、慢性胃腸炎、消化不良等［2］。腸炎寧片在臨床上應(yīng)用廣泛，使其在種植、運(yùn)輸與加工生產(chǎn)過程中，對(duì)其原料藥的質(zhì)量和安全控制顯得更加重要。近年來，為了有效地控制和預(yù)防疾病和害蟲，中藥材種植過程中常常使用農(nóng)藥［3］?！吨袊?guó)藥典》2020 年版通則0212［4］對(duì)33 種禁用農(nóng)藥作出了嚴(yán)格的限制，其含量必須低于定量限。禁用農(nóng)藥的殘留可能導(dǎo)致人和動(dòng)物嚴(yán)重的健康問題，主要損害心腦血管、肝腎等部位，甚至?xí)禄?、致癌、致突變?］。因此，建立對(duì)腸炎寧片及其主要原料藥的禁用農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法是十分必要的。

本研究選取《中國(guó)藥典》2020 年版四部［4］中2341 第四法農(nóng)藥多殘留量測(cè)定法項(xiàng)下氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS/MS）中的31 個(gè)農(nóng)藥化合物（20種禁用農(nóng)藥）在腸炎寧片及其主要原料藥材金毛耳草和地錦草中進(jìn)行檢測(cè)。金毛耳草的主要成分是雞矢藤苷甲酯、蘆丁、烏索酸等［6］，地錦草主要成分為黃酮類化合物（槲角素、山柰素等）和有機(jī)酸類（沒食子酸等）［7］。這兩種藥材都是復(fù)雜基質(zhì)，干擾較大，增加了檢測(cè)農(nóng)藥殘留的難度。Quick（快速）-Easy（容易）-Cheap（便宜）-Effective（有效）-Rugged（穩(wěn)定）and Safe（可靠）（QuEChERS）法是一種基于固相萃取的技術(shù)，能夠有效防止由于液-液分配所帶來的乳化問題，并且具備節(jié)省有機(jī)溶劑的使用以及縮短前處理用時(shí)的特點(diǎn)［8］。QuEChERS 法由萃取和凈化2 個(gè)階段組成。在萃取階段，使用無水硫酸鎂協(xié)助提取，使用氯化鈉或無水乙酸鈉來提取“對(duì)堿敏感的化合物”［5］。凈化階段，去除藥材中有機(jī)酸和極性色素效果較好的為N-丙基乙二胺（PSA）［9］；亦可搭配十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）一起使用，目的為除去多余的脂類和甾醇［10］，或使用石墨化炭黑（GCB）來降低色素等干擾物的存在［11］。由于金毛耳草、地錦草基質(zhì)復(fù)雜，干擾較大，本研究采用改良后QuEChERS 法對(duì)腸炎寧片、金毛耳草、地錦草中31 個(gè)禁用農(nóng)藥進(jìn)行了GC-MS/MS檢測(cè)，為企業(yè)和相關(guān)部門對(duì)于此類方法的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

7890B-7010 氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent 公司)；NV-15G 氮吹儀(美國(guó)Agela 公司)；電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)；Eppendorf 移液槍(德國(guó)Eppendorf 公司)；SF-TGL-20A 高速離心機(jī)(中國(guó)上海菲恰爾分析儀器有限公司)。乙腈（色譜純）由美國(guó)Fisher Scientific 公司供應(yīng)。31 種禁用農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL）由天津阿爾塔科技有限公司提供。無水硫酸鎂（MgSO4）、無水乙酸鈉（CH3COONa）、冰醋酸、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、石墨化碳黑（GCB）和硅膠由中國(guó)天津艾杰爾公司提供。純凈水由杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司提供。微孔濾膜（0.22 μm）購(gòu)買于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。腸炎寧片（江西康恩貝中藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z36020518，規(guī)格：420 mg）5 批。3 批金毛耳草產(chǎn)自江西省撫州市南豐縣（批號(hào)分別為YZ002-190908、YZ002-200902、YZ002-200908）。2 批地錦草產(chǎn)自湖南省衡陽市（批號(hào)分別為YZ001-181208、YZ001-190403）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用DB-5MS 柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）進(jìn)行分離分析。進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，溶劑延遲時(shí)間4 min。使用高純氦氣（He）為載氣。進(jìn)樣口模式為恒壓，柱前壓力為146 kPa。程序升溫：保持初始溫度60 ℃ 1min，以30 ℃/min 的速度升至120 ℃，以10 ℃/min 的速度升溫至160 ℃，再以20℃/min 的速度升溫至230 ℃，最后以15 ℃/min 的速度升溫至300 ℃，并維持6 min。

2.2 質(zhì)譜條件

采用三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；離子源為電子轟擊源（EI），離子源溫度為230 ℃，電壓為70 eV。碰撞氣為氮?dú)?，質(zhì)譜傳輸接口溫度250 ℃。質(zhì)譜監(jiān)測(cè)模式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版的規(guī)定來設(shè)置監(jiān)測(cè)離子對(duì)和碰撞電壓（CE）。

2.3 農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

所購(gòu)買的31 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液濃度為100.0 μg/mL。取10 μL 用乙腈將其稀釋至10 mL，混合均勻，即得中間標(biāo)準(zhǔn)品溶液（100 ng/mL），通過中間標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備濃度為50 ng/mL 的工作溶液，并在-20 ℃的環(huán)境下進(jìn)行保存。

2.4 供試品溶液的制備

將過三號(hào)篩的1.0 g 藥材樣品粉末放入50 mL聚苯乙烯具塞離心管內(nèi)。加入1%冰醋酸10.0 mL，充分渦旋，使藥材粉末完全浸潤(rùn)于溶液中，在室溫環(huán)境中靜置30 min。加入20.0 mL 乙腈，渦旋混合均勻，在振蕩器上振蕩5 min。加入7.5 g 按照4∶1的比例配制的無水MgSO4與無水CH3COONa 混合物，立即搖散，將其放于振蕩器上振蕩5 min，以8 000 r/min 的速度離心處理5 min。將9 mL 上清液加入凈化劑（無水MgSO4：900 mg、PSA：300 mg、C18：300 mg、硅膠：300 mg、GCB：100 mg）中，充分渦旋，使之完全混合，放置于振蕩器上，振蕩5 min，再以8 000 r/min 的速度離心處理5 min。取5 mL 上清液放入10 mL 離心管內(nèi)，置于NV-15G 氮吹儀上，在40 ℃水浴的條件下將其濃縮至約0.5 mL，并用乙腈定容至1 mL，渦旋混勻，使得溶劑通過微孔濾膜（0.22 μm），即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜條件與質(zhì)譜條件優(yōu)化

根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版四部［4］中2341 農(nóng)藥殘留檢測(cè)法項(xiàng)下的信息，選用與藥典極性相同的色譜柱?；衔锏某龇鍟r(shí)間和峰形會(huì)受到具體色譜柱型號(hào)和儀器狀態(tài)的影響，因此需要對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和確定，詳見表1。31 個(gè)禁用農(nóng)藥在乙腈溶劑中的總色譜流圖如圖1 所示。

圖1 31個(gè)禁用農(nóng)藥的GC-MS/MS總離子流圖（50 ng/mL）

3.2 前處理方法考察

QuEChERS 法是本研究采用的前處理方法。在農(nóng)藥分析中，選擇使用的溶劑應(yīng)盡可能提取出所測(cè)定的全部目標(biāo)分析物，而不提取出或少量提取出樣品基質(zhì)中的其他成分及干擾物。QuEChERS 技術(shù)可以使用多種不同的提取溶劑，如乙腈、乙酸乙酯、甲醇和丙酮等。其中，乙腈能有效地提取具有較大極性范圍的農(nóng)藥，而且在處理過程中，可以有效地減少雜質(zhì)的提?。?2］。本研究根據(jù)31 個(gè)禁用農(nóng)藥的溶解性和穩(wěn)定性，選擇的提取溶劑為乙腈，對(duì)比了分別加入10 mL 和20 mL 乙腈提取溶液顏色的變化（圖2）。結(jié)果表明，加入20 mL 乙腈提取制備的溶液澄清無渾濁，符合上機(jī)要求；而加入10 mL 乙腈提取制備的溶液色素殘留嚴(yán)重，上機(jī)檢測(cè)可能會(huì)增加色譜柱污染的概率。因此，選擇20 mL 乙腈進(jìn)行提取。

圖2 優(yōu)化前、優(yōu)化后凈化處理效果對(duì)比圖：A.金毛耳草；B.地錦草；C.腸炎寧片

中草藥提取物中常含有大量色素、天然樹脂、大分子脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等其他物質(zhì)。這些物質(zhì)可能在GC-MS/MS 分析過程中污染進(jìn)樣口和色譜柱，從而影響色譜分離，使色譜柱壽命縮短［13］。為了解決該問題，本研究加入了一些去除這些基質(zhì)化合物的凈化劑。C18 可有效去除油性基質(zhì)化合物［14］。PSA 可以去除有機(jī)酸、脂肪酸、糖和其他可形成氫鍵的成分［9］。GCB 具有很強(qiáng)的去除色素的能力，如葉綠素和類胡蘿卜素［15］。根據(jù)腸炎寧片、金毛耳草和地錦草藥材可能存在的成分，本研究采用的凈化劑為300 mg PSA、300 mg C18、100 mg GCB、300 mg 硅膠和900 mg 無水MgSO4。相比藥典中的QuEChERS方法增加了10 mg GCB，以達(dá)到更好的凈化效果。

3.3 方法學(xué)考察

《中國(guó)藥典》2020 年版四部2341 項(xiàng)下，規(guī)定了GC-MS/MS 檢測(cè)禁用農(nóng)藥時(shí)所使用的計(jì)算方法是內(nèi)標(biāo)定量法。本研究選擇磷酸三苯酯為內(nèi)標(biāo)，分別配制質(zhì)量濃度為1、2、5、10、25、50、100 ng/mL 的31個(gè)農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在優(yōu)化條件下測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為目標(biāo)化合物濃度/內(nèi)標(biāo)化合物濃度，縱坐標(biāo)為目標(biāo)化合物峰面積/內(nèi)標(biāo)化合物峰面積。雖然采用內(nèi)標(biāo)法引入了加入內(nèi)標(biāo)可能存在的誤差，但這些誤差相比于批間差異所造成的誤差而言是較小的。定量限可依據(jù)信噪比來判斷，定量限（LOQ）為信噪比大于等于10 時(shí)的農(nóng)藥濃度，檢出限（LOD）為信噪比大于等于3 時(shí)的農(nóng)藥濃度，表2 為線性、LOD、LOQ 等結(jié)果。結(jié)果表明，31 個(gè)農(nóng)藥的線性范圍為1～100 ng/mL，LOD 為0.3～7.0 μg/kg，LOQ 為1.0～25.0 μg/kg。回收實(shí)驗(yàn)按照向空白藥材基質(zhì)中加標(biāo)50 μg/kg 的濃度進(jìn)行，6 次平行測(cè)定。通過測(cè)定量與添加量的比較，對(duì)每一種農(nóng)藥的回收率進(jìn)行計(jì)算。回收率為72.0%～113.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值在2.4%～17.8%之間（圖3），回收率合格，精密度、重復(fù)性良好，均符合《中國(guó)藥典》對(duì)禁用農(nóng)藥檢測(cè)的要求。

表2 31個(gè)禁用農(nóng)藥在腸炎寧片、金毛耳草和地錦草中的LOD、LOQ和線性關(guān)系

圖3 31個(gè)禁用農(nóng)藥的回收率

3.4 樣品及藥材檢測(cè)結(jié)果

針對(duì)腸炎寧片及其原藥材進(jìn)行檢測(cè)，共檢測(cè)腸炎寧片5 批、金毛耳草3 批、地錦草2 批，結(jié)果31 個(gè)禁用農(nóng)藥均未檢出，符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。通過原藥材產(chǎn)地調(diào)查得知，金毛耳草、地錦草多為野生藥材，僅有少量栽培。栽培過程中嚴(yán)格把控質(zhì)量要求，避免禁用農(nóng)藥等有毒、高殘留農(nóng)藥的噴施，保障藥材和成藥腸炎寧片的安全性。

4 結(jié)論

本研究采用GC-MS/MS 結(jié)合改良后QuEChERS法建立了31 個(gè)禁用農(nóng)藥的檢測(cè)方法，對(duì)腸炎寧片及其原藥材金毛耳草和地錦草進(jìn)行檢測(cè)，方法學(xué)考察均合格，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，可用于腸炎寧片的安全性監(jiān)測(cè)。