郭 楓，張文俊，張俊霞，劉 彪，扶詠梅，胡紅偉

（1.河南城建學(xué)院河南省水體污染防治與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 平頂山 467036；2.華北水利水電大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，河南 鄭州 450011）

活性污泥法具有處理效率高和運(yùn)行成本低等優(yōu)勢(shì)，被廣泛用于污水處理［1］。微生物是活性污泥的重要組成部分，微生物群落驅(qū)動(dòng)著污染物的降解和轉(zhuǎn)化，直接影響污水處理廠的處理效率和穩(wěn)定性［2－3］。因此，研究污水處理廠中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能對(duì)深入了解污水生物凈化的機(jī)制具有重要意義。

近年來(lái)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)活性污泥微生物群落進(jìn)行研究，獲得了許多成果。Ibarbalz等［4］研究了8個(gè)污水處理廠好氧處理單元的活性污泥樣本，發(fā)現(xiàn)污水特征是驅(qū)動(dòng)微生物群落結(jié)構(gòu)組裝的決定因素。市政污水主要來(lái)源于日常生活產(chǎn)生的污水，其有機(jī)物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)、糖類(lèi)、纖維等［5］。研究表明，市政污水處理廠活性污泥微生物群落的優(yōu)勢(shì)種群主要為Proteobacteria和Bacteroidetes［6－8］。

工業(yè)廢水的特點(diǎn)與市政生活污水存在顯著的差異，不同類(lèi)型的工礦企業(yè)在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的廢水具有不同的特點(diǎn)，大多數(shù)工業(yè)廢水可生化性較差，需經(jīng)預(yù)處理提高其可生化性，再進(jìn)行生物處理。在生物處理過(guò)程中，微生物群落結(jié)構(gòu)與廢水的組成密切相關(guān)。Yang等［9］發(fā)現(xiàn)，在工業(yè)廢水活性污泥中Nitrospira較市政污水低，表明工業(yè)廢水的復(fù)雜性影響硝化和反硝化過(guò)程。在巧克力生產(chǎn)廢水中，F(xiàn)irmicutes是最為優(yōu)勢(shì)的微生物群落［10］，而在石化廢水中，以Proteobacteria為主導(dǎo)的微生物種群對(duì)復(fù)雜化合物具有良好的降解性能［11］。趙婷婷等［12］研究了淀粉廢水處理系統(tǒng)中微生物群落，發(fā)現(xiàn)最重要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群為Proteobacteria。可見(jiàn)，不同類(lèi)型污廢水中活性污泥微生物群落組成各有特點(diǎn)。

本研究通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，以16SrRNA基因的V4區(qū)為靶基因，對(duì)7個(gè)污水處理廠好氧生物處理單元中的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，其中5個(gè)來(lái)自市政污水處理廠，2個(gè)來(lái)自工業(yè)廢水處理廠（尼龍化工和氯堿化工）。研究結(jié)果將對(duì)市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠活性污泥微生物群落結(jié)構(gòu)差異的認(rèn)識(shí)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源

2019年1月對(duì)市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠的好氧生物處理單元進(jìn)行了采樣，采樣深度為10～30 cm，分別標(biāo)記樣本為BF、BY、PDS、YZA、YZB和LJ、LLY。采集后，樣本立即被置于無(wú)菌聚乙烯容器中，在低溫條件下保存，并在2～3 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。BF、BY和PDS生物處理工藝為奧貝爾氧化溝，YZA和YZB生物處理工藝為厭氧－缺氧－好氧聯(lián)合工藝（A2O）。LJ樣本來(lái)自氯堿化工廠，該廠主要生產(chǎn)燒堿和聚氯乙烯等化工原料，廢水在中期和后期采用接觸氧化法進(jìn)行處理。LLY樣本來(lái)自尼龍化工廠，該廠主要生產(chǎn)己內(nèi)酰胺、環(huán)己醇和環(huán)己酸，廢水經(jīng)氨肟化預(yù)處理后采用MSBR工藝進(jìn)行處理。

1.2 理化指標(biāo)測(cè)定

采用便攜式測(cè)量?jī)x（Hanna HI98130，意大利）測(cè)定pH值，采用重鉻酸鹽法測(cè)定化學(xué)需氧量（Chemical Oxygen Demand，COD），采用納氏試劑法測(cè)定氨氮（NH4－N），采用酚二磺酸法測(cè)定硝酸鹽氮（NO3－N），采用N－（1－萘基）－乙二胺分光光度法測(cè)定亞硝酸鹽氮（NO2－N），采用堿性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法測(cè)定總氮（Total Nitrogen，TN）。上述測(cè)定均使用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（普析T6，北京）。

1.3 高通量測(cè)序分析

采用0.2μm孔徑的混合纖維濾膜進(jìn)行生物樣本收集。使用DNA試劑盒（OMEGA E.Z.N.ATMMag－Bind DNA Kit，US）從7個(gè)污水處理廠的活性污泥中提取微生物DNA。使用Qubit2.0DNA定量系統(tǒng)（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）測(cè)量DNA濃度。微生物多樣性鑒定區(qū)域?yàn)?6S rRNA基因的V4區(qū)，使用引物515F：5′－GTGCCAGCMGCCGCGGTAA－3′和806R：5′－GGACTACHVGGGTWTCTAAT－3′。經(jīng)PCR擴(kuò)增和純化，使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序由生工生物技術(shù)（上海）有限公司完成。原始數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后按照序列相似性大于97%聚類(lèi)為一個(gè)OTU（Operational Taxonomic Unit）。原始測(cè)序數(shù)據(jù)已存入NCBI序列讀取檔案（SRA）數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為：SRP332584。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用R（版本4.2.1）中的vegan包計(jì)算樣本α多樣性指數(shù)［13］。使用SPSS 25.0進(jìn)行環(huán)境因子與α多樣性指數(shù)之間的Pearson相關(guān)性分析。使用冗余分析（Redundancy Analysis，RDA）方法分析微生物對(duì)環(huán)境因子的響應(yīng)關(guān)系［14］，數(shù)據(jù)處理及可視化使用R語(yǔ)言中的vegan、plyr和ggplot2包。使用主坐標(biāo)分析（Principal Co－ordinates Analysis，PCoA）方法分析各樣本的β多樣性差異［15］，數(shù)據(jù)處理及可視化使用R語(yǔ)言vegan、ape和ggplot2包。使用PICRUSt2基于測(cè)序數(shù)據(jù)和直系同源集簇（Clusters of Orthologous Groups，COG）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各樣本微生物群落進(jìn)行功能注釋?zhuān)?6］。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子分析

本研究中所獲得的樣本環(huán)境因子數(shù)據(jù)如表1所示，7個(gè)樣本的pH值均大于7，其中LJ的pH值最大。NH4－N、NO3－N和NO2－N的范圍分別為1.41～12.60 mg·L－1、0.28～5.24 mg·L－1和0.02～2.55 mg·L－1。COD的范圍為100.00～420.00 mg·L－1，其中LJ的COD值為340 mg·L－1，LLY的COD值為420 mg·L－1。工業(yè)廢水處理廠樣本COD和pH值均高于市政污水處理廠。此外，PDS的TN濃度最低為11.48 mg·L－1，LJ的TN濃度最高達(dá)到109.33 mg·L－1。

表1 污水處理廠好氧處理單元水樣環(huán)境因子

2.2 微生物多樣性和相關(guān)性分析

各樣本微生物α多樣性指數(shù)如表2所示。

表2 活性污泥微生物α多樣性

由表2可知，市政污水的香農(nóng)指數(shù)均大于5，而工業(yè)廢水香農(nóng)指數(shù)則均小于3。工業(yè)廢水中的辛普森指數(shù)均大于0.1，而市政污水中的辛普森指數(shù)為0.01。市政污水處理廠的ACE指數(shù)均在2 100以上，而工業(yè)廢水的ACE指數(shù)均在500以下，其中LLY的ACE指數(shù)最低，僅為346.07。市政污水的Chao1指數(shù)均超過(guò)2 000，而工業(yè)廢水的Chao1指數(shù)均低于500。總體而言，工業(yè)廢水處理廠樣本微生物群落多樣性低于市政污水處理廠。環(huán)境因子與微生物α多樣性指數(shù)的皮爾遜相關(guān)性分析表明，pH和COD濃度與微生物多樣性呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05）（見(jiàn)表3）。

表3 環(huán)境因子與微生物α多樣性指數(shù)的皮爾遜相關(guān)性

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)及樣本聚類(lèi)分析

在門(mén)水平上（見(jiàn)圖1（a）），市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠的微生物群落相對(duì)豐度存在差異，其主要的微生物門(mén)類(lèi)包括Proteobacteria、Bacteroidetes、Acidobacteria、Planctomycetes、Chloroflexi、Actinobacteria和Deinococcus－Thermus。在7個(gè)樣本中，Proteobacteria是最具優(yōu)勢(shì)的微生物，在市政污水處理廠樣本中占比31.40%～43.97%，在工業(yè)廢水處理廠LJ和LLY分別占86.78%和58.77%。在LLY 中，Deinococcus－Thermus的相對(duì)豐度為20.57%，在其他6個(gè)樣本中的相對(duì)豐度均低于0.1%，顯示出LLY具有獨(dú)特的微生物群落。

圖1 微生物群落結(jié)構(gòu)及樣本聚類(lèi)分析

在屬水平上（見(jiàn)圖1（b）），市政污水中優(yōu)勢(shì)菌屬主要包括Ferruginibacter、Zavarzinella和Hyphomicrobium，LJ和LLY的微生物群落組成與市政污水存在較大差異。在LJ中，最優(yōu)勢(shì)的微生物菌屬包括Acinetobacter、Novosphingobium和Polynucleobacter，其中Acinetobacter在LJ的相對(duì)豐度最高，而在其他樣本中均低于2%。在LLY中，最優(yōu)勢(shì)的微生物菌屬包括Meiothermus、Hyphomicrobium和Comamonas，其中Meiothermus在LLY中的相對(duì)豐度為19.72%，而在其他樣本中未檢測(cè)到。

基于Bray－Curtis距離的PCoA分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1（c）），市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠的活性污泥在樣本聚類(lèi)上相互分離，兩個(gè)工業(yè)廢水廠樣本均遠(yuǎn)離市政污水廠樣本?；贠TU水平的RDA分析結(jié)果顯示（見(jiàn)圖1（d）），pH對(duì)微生物群落分布有顯著的影響（p＜0.05）。

2.4 功能基因多樣性及豐度

基于COG的功能基因分析表明，市政污水處理廠和工業(yè)廢水處理廠樣本在功能基因的多樣性上差異較?。ㄒ?jiàn)圖2（a）），但在聚類(lèi)（見(jiàn)圖2（b））及其豐度分布（見(jiàn)圖2（c））上存在較大差異。市政污水處理廠樣本形成聚類(lèi)，而工業(yè)廢水處理廠樣本則與其有較大的分離。功能基因豐度熱圖則揭示了在污水處理中，能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換（Energy production and conversion）、氨基酸運(yùn)輸與代謝（Amino acid transport and metabolism）、碳水化合物運(yùn)輸與代謝（Carbohydrate transport and metabolism）、細(xì)胞壁／膜／包被生物發(fā)生（Cell wall／membrane／envelope biogenesis）以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Signal transduction mechanisms）等類(lèi)別的功能基因至關(guān)重要。特別是，LJ中這些功能基因的豐度普遍低于其他樣本，而LLY中這些功能基因的豐度則普遍高于其他樣本。市政污水處理廠樣本之間在功能基因豐度上的差異相對(duì)較小。

圖2 基于COG的功能基因分析

3 討論

微生物群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間存在密切關(guān)系，但特定廢水組成對(duì)微生物群落的影響較為復(fù)雜。污廢水處理過(guò)程中，微生物受到有機(jī)負(fù)荷、pH、溫度、溶解氧等多種因素的影響。本研究中，LJ的高pH與燒堿等產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中排放的廢水性質(zhì)密切相關(guān)，而LLY的高COD濃度與己內(nèi)酰胺、環(huán)己醇生產(chǎn)過(guò)程中排放的碳源相關(guān)。同時(shí)，工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中活性污泥微生物群落具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，且pH和COD對(duì)活性污泥微生物群落的形成有較大影響，該結(jié)果與Xu等［17］的研究結(jié)果相似。COD與廢水中有機(jī)質(zhì)的種類(lèi)和濃度相關(guān)，而pH與微生物的代謝環(huán)境相關(guān)，二者的共同作用導(dǎo)致了其獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)。已有研究表明，廢水的類(lèi)型被認(rèn)為是引起活性污泥系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)差異最重要的原因［18］，與本研究的結(jié)果相符。

本研究中，7個(gè)污水處理廠樣本微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異。市政污水處理廠樣本在門(mén)水平上的微生物群落組成與之前的研究相似［8，19］。工業(yè)廢水處理廠樣本則表現(xiàn)出獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，與市政污水處理廠中常見(jiàn)的微生物群落組成有較大差異［20］。此外，工業(yè)廢水處理廠樣本微生物群落α多樣性較低，與Yang等［9］研究結(jié)果一致。特別是在LJ中，優(yōu)勢(shì)菌屬Acinetobacter和Novosphingobium具備降解多環(huán)芳烴的能力［21－22］，Polynucleobacter在降解有機(jī)物方面具有優(yōu)勢(shì)［23］，這與其廢水特點(diǎn)具有密切的關(guān)聯(lián)。同時(shí)，LLY中特有菌屬M(fèi)eiothermus是造紙廠廢水處理系統(tǒng)中常見(jiàn)的微生物［24］，并在陸地?zé)崛斜话l(fā)現(xiàn)［25］。己內(nèi)酰胺生產(chǎn)過(guò)程中有大量有機(jī)物和溫廢水的排放，原因可能是存在大量的Meiothermus。

微生物群落的基因功能主要集中在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞壁／膜／包膜生物發(fā)生、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)換以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制等方面，這些功能與廢水的特性存在關(guān)聯(lián)，如參與碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂質(zhì)代謝等。盡管不同污水處理廠樣本的功能基因多樣性指數(shù)相接近，但功能豐度存在差異。在LJ中，優(yōu)勢(shì)功能基因的豐度低于其他樣本，這可能是單一的廢水結(jié)構(gòu)造成的。而在LLY中，氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝以及能源生產(chǎn)與轉(zhuǎn)化功能基因均高于其他樣本，這表明在工業(yè)廢水的影響下相關(guān)的代謝功能得到了增強(qiáng)。此外，以往研究表明，在高鹽環(huán)境的脅迫下，微生物群落可發(fā)展出特定的代謝模式以維持細(xì)胞活性［26］，這也可能是造成工業(yè)廢水處理廠微生物功能差異的潛在原因。

4 結(jié)論

（1）工業(yè)廢水處理系統(tǒng)中微生物群落多樣性和豐富度均低于市政污水處理廠。本研究中，微生物群落α多樣性指數(shù)與pH和COD呈顯著負(fù)相關(guān)。

（2）來(lái)自市政污水處理系統(tǒng)的5個(gè)樣本，優(yōu)勢(shì)菌屬均為Ferruginibacter、Zavarzinella和Hyphomicrobium。工業(yè)廢水處理系統(tǒng)則存在差異，在LJ中，Acinetobacter、Novosphingobium和Polynucleobacter為優(yōu)勢(shì)菌屬，在LLY中，Meiothermus、Hyphomicrobium和Comamonas為優(yōu)勢(shì)菌屬。

（3）基于COG數(shù)據(jù)庫(kù)的功能基因預(yù)測(cè)顯示，工業(yè)廢水處理廠和市政污水處理廠樣本在功能基因多樣性上差異性較小，但在優(yōu)勢(shì)功能基因的豐度上存在較大差異。這種差異是由工業(yè)廢水和市政污水特性所導(dǎo)致的。