陸建橋,曹廣旭,李 芳*,高金莉

(1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬東方醫(yī)院婦產(chǎn)科,上海 200120;2.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院病理科,上海 200120)

宮頸癌是女性最常見(jiàn)的癌癥之一,是繼乳腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌之后的第4大常見(jiàn)的惡性腫瘤,也是女性癌癥死亡的第4大原因。影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展以及生存率的原因有很多,已經(jīng)證實(shí)持續(xù)的人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是宮頸癌的病因[1],其他病毒感染在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中的作用強(qiáng)度和作用機(jī)制的研究相對(duì)較少。

有研究表明,部分宮頸癌變組織中可同時(shí)檢出人類(lèi)皰疹病毒4(Epstein-Barr virus,EBV)和HPV[2-3],進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示宮頸EBV和高危HPV合并感染的女性其宮頸細(xì)胞學(xué)異常的風(fēng)險(xiǎn)比單純高危HPV陽(yáng)性的女性增加了約4倍[4],且隨疾病進(jìn)展病毒載量有增加的趨勢(shì)[5],提示EBV可能是宮頸癌進(jìn)展的促進(jìn)因素。但O’Leary等[6]、Aromseree等[7]、Seo[8]等報(bào)告在癌變細(xì)胞中未檢出EBV,并由此認(rèn)為EBV在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中無(wú)作用或只起到輔助作用。隨著宮頸癌病例中EBV檢測(cè)數(shù)據(jù)的不斷積累,再次回顧其感染與宮頸癌之間的相關(guān)性,有助于對(duì)EBV致病性及其與HPV協(xié)同作用的理解。

已往的研究表明,包括宮頸癌在內(nèi)的許多癌癥病患中,EBV感染率具有地域差異[9-10]。上海地區(qū)宮頸癌患者中的EBV感染率及其與HPV共感染對(duì)癌癥發(fā)生發(fā)展的影響尚不清楚,有必要對(duì)此開(kāi)展研究,為本地區(qū)宮頸疾病預(yù)防提供依據(jù)。本研究通過(guò)Meta分析和臨床研究,旨在明確EBV感染對(duì)宮頸癌,尤其對(duì)本地人群宮頸癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 資料與方法

1.1 Meta分析

1.1.1 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)提取 文獻(xiàn)資料從PubMed、Web of Science中檢索而得,使用了Herpesvirus 4 or Human or Burkitt Lymphoma Virus or Lymphoma Virus or HHV-4 or EBV和Uterine Cervical Neopla-sms or Cervical Neoplasm,Cervix or Cancer of the Uterine Cervix兩組檢索詞,檢索方式是在主題、篇名、關(guān)鍵詞和摘要中模糊檢索,設(shè)置的時(shí)間范圍為1990年9月1日—2022年9月1日。同時(shí),采用跟蹤檢索法對(duì)感興趣的文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)進(jìn)行篩選。文獻(xiàn)資料納入規(guī)則:標(biāo)題或摘要中至少有一個(gè)關(guān)鍵詞,并顯示了EBV和宮頸腫瘤之間的關(guān)系;病患年齡≥18歲。文獻(xiàn)資料排除規(guī)則:沒(méi)有明確采用某種方法檢測(cè)EBV;基于動(dòng)物或模型的實(shí)驗(yàn)報(bào)告;觀(guān)察性研究、評(píng)論、信件、社論、會(huì)議摘要、作者的回復(fù)和病例報(bào)告、非英文報(bào)告等。剔除重復(fù)的檢索結(jié)果。從文獻(xiàn)中提取以下信息:第一作者、出版年份、國(guó)家、患者總數(shù)、檢測(cè)方法、標(biāo)本類(lèi)型、病理結(jié)果等。所有關(guān)于數(shù)據(jù)提取的差異都通過(guò)與共同作者達(dá)成共識(shí)來(lái)解決。每項(xiàng)研究的質(zhì)量都由評(píng)審員用Cochrane偏倚風(fēng)險(xiǎn)工具獨(dú)立評(píng)估。

1.1.2 統(tǒng)計(jì)分析 用Stata 12和Review Manager(RevMan 5.4版)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。先計(jì)算每項(xiàng)研究的EBV感染率和置信區(qū)間(Confidence Interval,CI),再進(jìn)行Meta分析以評(píng)估總體EBV感染率,最后進(jìn)行亞組分析,包括病理組織學(xué)類(lèi)型及標(biāo)本類(lèi)型2類(lèi)亞組。統(tǒng)計(jì)學(xué)異質(zhì)性用χ2檢驗(yàn)和I2統(tǒng)計(jì)評(píng)估,χ2檢驗(yàn)中P<0.05為存在顯著性,I2在50%以上定義為異質(zhì)性顯著。當(dāng)研究間的異質(zhì)性不顯著時(shí),采用固定效應(yīng)模型;當(dāng)異質(zhì)性顯著時(shí),采用隨機(jī)模型。效應(yīng)量分別選擇影響大小(effect size,ES)[95%CI]和累積風(fēng)險(xiǎn)比(risk ratio,RR)[95%CI],ES的百分率視為感染率。所有的測(cè)試都是雙邊的。

1.2 臨床研究

在獲得每位患者的知情同意的前提下,收集同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院2021—2022年門(mén)診及住院且經(jīng)HPV篩查的患者所有就診信息,選擇其中可用的宮頸癌(squamous carcinoma of the cervix,SCC)及宮頸上皮內(nèi)病變(squamous intraepi-thelial lesion,SIL)的石蠟包埋組織塊,對(duì)組織樣本行原位雜交免疫組織化學(xué)染色法檢查EBV編碼的小RNA(epstein-Barr encoded RNA,EBER)。常規(guī)待測(cè)石蠟組織切片3 μm,貼片于帶陽(yáng)性對(duì)照的防脫片上,于65 ℃烤箱烤60 min,在已設(shè)置好染色程序的自動(dòng)免疫組化儀(北京中杉金橋Ultra PATH)上進(jìn)行染色。試劑盒為北京中杉金橋EBER地高辛染色液試劑盒ISH-7001UM。收集我院行手術(shù)治療且病理類(lèi)型明確的宮頸疾病患者就診信息,采集空腹血2 mL,用淋巴細(xì)胞分離液分離沉淀白細(xì)胞,采用新產(chǎn)業(yè)生物科技公司生產(chǎn)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀及其配套試劑盒檢測(cè)EBV 4項(xiàng)抗體:衣殼抗原(VCA)-IgM、VCA-IgG、早期抗原(EA)-IgG、核抗原(NA)-IgG。以EA-IgG抗體陽(yáng)性作為反映近期有EBV感染,且病毒活躍增殖的指標(biāo),以VCA-IgM判斷現(xiàn)癥感染率,以NA-IgG判斷既往感染率[11]。同時(shí)根據(jù)4項(xiàng)抗體陽(yáng)性概貌,參照文獻(xiàn)[12-13]的方法,對(duì)EBV感染狀態(tài)進(jìn)行聯(lián)合判斷。

2 結(jié) 果

2.1 Meta分析結(jié)果

2.1.1 文獻(xiàn)篩選流程和結(jié)果 從PubMed和Web of Science中初步檢索出4 663篇文獻(xiàn),剔除重復(fù)和不相關(guān)的文獻(xiàn)后,共入選796篇,文獻(xiàn)篩選流程見(jiàn)圖1。在對(duì)標(biāo)題和摘要進(jìn)行篩選后,共入選28篇文獻(xiàn)。對(duì)28篇文獻(xiàn)進(jìn)行全文審查,最終共有16篇文獻(xiàn)納入本研究。納入的文獻(xiàn)發(fā)表于1997—2021年,包括了2 199例患者,單純HPV陽(yáng)性共616例,單純EBV陽(yáng)性共288例,雙陽(yáng)性356例,雙陰性936例?；颊咧杏?39例SIL,264例SCC,其中兩項(xiàng)研究中的60例宮頸鱗狀上皮內(nèi)病變未明確劃分高級(jí)別和低級(jí)別,亞組分析時(shí)未納入統(tǒng)計(jì)范圍。經(jīng)評(píng)估,無(wú)偏倚風(fēng)險(xiǎn),見(jiàn)圖2。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程圖

圖2 文獻(xiàn)質(zhì)量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

16項(xiàng)研究中有6項(xiàng)在亞洲[5,7,14-17],3項(xiàng)在歐洲[2,18-19],5項(xiàng)在美洲[4,20-23],2項(xiàng)在非洲[3,24]?？紤]到組織樣本的來(lái)源可能影響病毒的檢出率,本研究對(duì)樣本來(lái)源進(jìn)行了分類(lèi):3項(xiàng)研究樣本來(lái)源為宮頸拭子,5項(xiàng)為活檢組織樣本,6項(xiàng)為細(xì)胞學(xué)樣本,2項(xiàng)為冷凍樣本。所有文獻(xiàn)都使用了PCR技術(shù)檢測(cè)EBV,只有1項(xiàng)同時(shí)使用了ISH技術(shù)[16,19]。

納入文獻(xiàn)及提取的基本信息見(jiàn)表1。

表1 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)信息表

圖3 不同類(lèi)型患者單純EBV感染率

圖4 不同類(lèi)型患者EBV和HPV共感染率

圖5 不同類(lèi)型患者EBV和HPV合并感染率與HPV單純感染風(fēng)險(xiǎn)比

2.2 臨床樣本檢測(cè)結(jié)果

共收集到40例患者的組織塊行EBER檢測(cè),包括10例宮頸癌患者,30例HSIL,均為高危型HPV感染。EBER檢測(cè)結(jié)果表明,所有樣本均為EBER陰性。

30例臨床病例類(lèi)型及EBV抗體的檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。病例中包括4例SCC患者、24例HSIL、2例LSIL患者。24例患者的EA-IgG,陽(yáng)率性為12%(3/24),均屬于HSIL患者。26例患者的VCA IgG,陽(yáng)性率為92%(24/26),4例為SCC患者,20例為HSIL患者。30例患者中有7例VCA-IgM陽(yáng)性(暗示現(xiàn)癥感染),陽(yáng)性率為23%(7/30),其中6例為HSIL患者,即HSIL中陽(yáng)性率為25%(6/24)。LSIL患者中VCA-IgM陽(yáng)性率為50%(1/2),SCC患者陽(yáng)性率為0(0/4)。27例患者中NA-IgG陽(yáng)性的24例,占89%(24/27),SCC、HSIL和LSIL患者中陽(yáng)性率分別為100%(4/4)、86%(18/21)和100%(2/2)。

表2 臨床樣本EBV抗體檢測(cè)結(jié)果及由此判斷的感染狀態(tài)

20例患者的4項(xiàng)抗體檢測(cè)數(shù)據(jù)齊全,包括4例SCC患者,16例HSIL患者。沒(méi)有患者4種抗體均為陽(yáng)性。由4項(xiàng)抗體聯(lián)合判斷,可推測(cè)患者主要是EBV既往感染。在數(shù)據(jù)不全的患者中可推測(cè)有3例HSIL和1例LSIL為現(xiàn)癥感染者。

3 討 論

3.1 EBV單獨(dú)感染的致病風(fēng)險(xiǎn)

3.2 EBV和HPV共感染的致病風(fēng)險(xiǎn)

Cameron等[4]的研究結(jié)果顯示,宮頸EBV和高危HPV合并感染的女性宮頸細(xì)胞學(xué)異常的風(fēng)險(xiǎn)比單純高危HPV檢測(cè)陽(yáng)性的女性增加了約4倍。Joharinia等[5]報(bào)告HSIL中EBV感染的頻率高于LSIL,同時(shí)共感染患者的HPV載量升高,提示EBV可能是疾病進(jìn)展的促進(jìn)因素。在本研究Meta分析結(jié)果顯示,疾病分期越高,合并感染的ES值也越高,合并感染對(duì)LSIL、HSIL、SCC的致病風(fēng)險(xiǎn)分別是HPV單純感染的0.77、1.25、1.49倍。上述結(jié)果表明EBV與HPV共感染可促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。值得一提的是,對(duì)于LSIL患者而言,合并感染致病風(fēng)險(xiǎn)僅為HPV單純感染的0.77倍,這可能是由于合并感染后疾病快速向高級(jí)別轉(zhuǎn)化的結(jié)果。由于EBV單純感染與疾病進(jìn)展相關(guān)性不大,與HPV合并感染后RR值隨疾病進(jìn)展而升高的現(xiàn)象也可能是由于HPV感染后造成對(duì)EBV的易感性。

本研究中采用EBER檢測(cè)了宮頸組織中的EBV,出乎意料的是,包括異常增生細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的所有樣本中均未發(fā)現(xiàn)EBER陽(yáng)性。Al-Thawadi等[27]報(bào)告在大多數(shù)情況下,EBV的潛伏膜蛋白1(LMP1)與高危HPV的E6同源蛋白共同存在于HSIL癌細(xì)胞中,偶爾也存在于基質(zhì)以及腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中。但Aromseree等[7]、Shoji等[28]、O’Leary等[6]未在癌細(xì)胞中檢出EBER陽(yáng)性,與本研究結(jié)果一致。在EBV致病機(jī)制上,一種觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為,EBV的LMP1和HPV16 E6蛋白結(jié)合,可增加致癌信號(hào)通路的傳導(dǎo),抑制P53等抑癌通路[29-30],促進(jìn)疾病進(jìn)展[27,31]。還有一種觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為EBV可能通過(guò)感染B淋巴細(xì)胞而浸潤(rùn)宮頸上皮組織,進(jìn)一步產(chǎn)生部分作用導(dǎo)致疾病進(jìn)展[32-33]。本研究結(jié)果更傾向支持后者,提示EBV可能不是通過(guò)直接攻擊本地患者宮頸上皮細(xì)胞致病的。

3.3 樣本類(lèi)型對(duì)EBV檢出率的影響

本次Meta分析結(jié)果表明,樣本類(lèi)型不同,EBV檢出率差異較大。采用宮頸拭子和細(xì)胞刷采集的樣本EBV陽(yáng)性率分別為23.8%和36.9%,提示細(xì)胞刷法采集的樣本可能具有更高的EBV檢出率。其他研究也證明細(xì)胞刷取樣的敏感性較高,例如,金紅霞等[34]報(bào)告,對(duì)普查的3 567例育齡婦女進(jìn)行傳統(tǒng)宮頸刮片取樣,同期隨機(jī)抽取1 068例行細(xì)胞刷法采樣,并對(duì)臨床診斷可疑者或細(xì)胞學(xué)診斷陽(yáng)性者進(jìn)行組織病理檢查或者陰道鏡檢查,結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞刷法真陽(yáng)性率為92.96%,而刮片僅為33.33%。本研究結(jié)果提示,EBV篩查時(shí)采用細(xì)胞刷采樣可能比宮頸拭子更合適。

本次Meta分析結(jié)果表明EBV與HPV共感染會(huì)增加宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn),支持原假說(shuō)。但臨床病例和Meta分析結(jié)果一致表明單純EBV感染與疾病進(jìn)展的相關(guān)性不明顯甚至負(fù)相關(guān),究其原因,除了樣本量不夠大以外,也不排除EBV在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中作用確實(shí)較小的可能性。此外,臨床樣本EBER檢測(cè)結(jié)果提示EBV可能不是通過(guò)直接攻擊患者宮頸上皮細(xì)胞致病的。本研究結(jié)果還提示在EBV檢樣采集中,細(xì)胞刷法敏感性高于宮頸拭子。

本研究的優(yōu)點(diǎn)是:(1) 本研究首次報(bào)告了本地宮頸癌患者血液中EBV抗體概貌,指出本地患者EBV現(xiàn)癥感染率與宮頸癌進(jìn)展無(wú)明顯相關(guān)性。(2) 首次報(bào)告本地患者病理組織中EBER全陰性,并由此推測(cè)EBV可能并非通過(guò)直接攻擊本地患者宮頸上皮細(xì)胞致病。

本研究也存在一些不足:(1) 本研究用于EBV的EBER檢測(cè)的樣本40例,用于EBV抗體檢測(cè)的樣本30例,樣本量不夠大。(2) 本研究中用于Meta分析的文獻(xiàn)量不夠大,涉及病例2 199例,有必要繼續(xù)收集文獻(xiàn)資料。