李 淵 吳崢嶸 郝素英 何 明

（北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的特征是持續(xù)存在的氣流受限和相應(yīng)的呼吸系統(tǒng)癥狀。2018 年“中國成人肺部健康研究”調(diào)查結(jié)果顯示，我國20 歲及以上成人COPD患病率為8.6%，40歲以上人群患病率高達(dá)13.7%，估算我國COPD 患者數(shù)近1 億［1］，但我國COPD 知曉率、診斷率、治療率低［2］，故COPD 的防治是我國重要的公共衛(wèi)生問題。

COPD 的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，吸入煙草煙霧等有害顆粒或氣體可引起氣道氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及蛋白酶/抗蛋白酶失衡等，這些途徑參與了COPD 的發(fā)?。?］，其中氧化抗氧化失衡受到廣泛重視。Kelch 樣ECH 相關(guān)蛋白1（Keap1）-核因子紅系2 相關(guān)因子2（Nrf2）-抗氧化反應(yīng)元件（ARE）信號(hào)通路可調(diào)節(jié)多種抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄［3］。中醫(yī)藥在防治COPD 中顯示出較強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。本課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)［4-5］，健脾補(bǔ)腎益肺方能改COPD 患者的肺功能、6 min 步行試驗(yàn)，該方中多數(shù)中藥具有抗氧化應(yīng)激的作用。為進(jìn)一步研究健脾補(bǔ)腎益肺方對(duì)COPD 的作用機(jī)理，本研究擬觀察健脾補(bǔ)腎益肺方對(duì)COPD 小鼠Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)C57BL/6J 小鼠7 周齡雄性30只，購自北京維通利華生物有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)，室內(nèi)溫度20～25 ℃；相對(duì)濕度50%～70%。光照時(shí)間固定，每天晝夜各12 h，晝間照明時(shí)間為8∶00～20∶00。動(dòng)物飲用水及籠具經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌處理，飼料及墊料均經(jīng)輻照處理，水、食物自由攝取。小鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)動(dòng)物房。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥與儀器 健脾補(bǔ)腎益肺方（生黃芪30 g，太子參30 g，熟地黃15 g，黃精15 g，白果10 g，地龍15 g），中藥飲片購于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，水煎煮提取2 次，合并提取液，濃縮得浸膏；丙卡特羅25 μg/片，浙江大冢制藥有限公司。主要試劑和儀器：脂多糖（LPS，美國Sigma 公司）；大前門香煙（上海煙草公司，焦油量12 mg，煙氣煙堿量0.9 mg，煙氣一氧化碳量14 mg）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛（MAD）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；Nrf2一抗（PTG 16396-1-AP）；超氧化物歧化酶（SOD）一抗（PTG 10269-1-AP）；血紅素加氧酶1（HO-1）一抗（10701-1-AP）；醌氧化還原酶1（NQO1）一抗（67240-1-IG）；HRP 標(biāo)記山羊抗兔通用二抗（DAKO K5007）；免疫組化試劑盒DAB 顯色劑（DAKO K5007）。電子天平稱（萬特1002）；離心機(jī)（湖南平凡科技TG16W）；氣麻機(jī)（眾實(shí)科技ZS-MV）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司RM2016）；渦旋混合器（天悅電子TYXH-Ⅱ）；顯微鏡（CIC XSP-C204）；自制透明有機(jī)玻璃煙熏箱：100 cm×100 cm×60 cm 箱，分上、下2層，底部網(wǎng)眼結(jié)構(gòu)，上層放鼠，下層放煙。

1.3 分組與造模 將30 只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為5 組，正常組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組，每組6 只。模型制備：參照文獻(xiàn)［6］，采用煙霧暴露聯(lián)合LPS 氣道內(nèi)滴注造模。第1、14 日采用1.4%異氟烷吸入麻醉，4 號(hào)針頭穿刺氣管，滴注LPS 7.5 μg/50 μL。氣管滴注當(dāng)天不進(jìn)行煙熏。第2 至13 日，第15 至90 日將小鼠置入煙熏箱內(nèi)熏煙，每日2 次，上下午各1次，上下午間隔4 h，每次2 h（間隔換氣20 min），每小時(shí)10 支煙，每周煙熏6 d。中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組造模方法同模型組。正常組：不用煙熏，氣管內(nèi)滴注50 μL生理鹽水。

1.4 干預(yù)方法 中藥高劑量組、中藥低劑量組從造模第2 日開始，健脾補(bǔ)腎益肺膏方溶于生理鹽水灌胃給藥，中藥低劑量組給藥劑量為人臨床用量的等效劑量，合生藥量為14.95 g/（kg·d），中藥高劑量組合生藥量為29.9 g/（kg·d）。第14 日不灌服，給藥至第90 日，每周稱量體重，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。西藥組：從造模第2日開始，給予丙卡特羅［26 μg/（kg·d）］溶于同中藥組等體積生理鹽水灌胃，第14 日不灌服，給藥至第90 日，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。正常組：給予同中藥組等體積的生理鹽水灌胃。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1）各組小鼠肺功能指標(biāo)測(cè)定。第91 日行肺功能檢查并處死動(dòng)物留取肺組織，采用1.4%異氟烷吸入麻醉，仰臥固定于操作臺(tái)。于頸部正中剪開皮膚后逐層分離肌肉組織，暴露氣管，插入氣管插管，打結(jié)固定。將小鼠置入動(dòng)物肺功能分析儀中，待小鼠與肺功能儀完全協(xié)調(diào)后，開始測(cè)定肺通氣功能。測(cè)定小鼠用力肺活量（FVC）、第0.15 秒用力呼氣容積（FEV0.15）、0.15 s 呼出容積占用力肺活量之比（FEV0.15/FVC）、用力呼出50%肺活量時(shí)的最大瞬間呼氣流量（FEF50%）、用力呼出75%肺活量時(shí)的最大瞬間呼氣流量（FEF75%）。2）各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA 測(cè)定。肺功能測(cè)定完畢之后，迅速沿胸骨打開胸腔，止血鉗夾閉左主支氣管，用1 mL 注射器吸取0.5 mL PBS 后與氣管插管相連，緩慢推注射器，待PBS 在左肺停留約10 s 后再回抽，反復(fù)抽吸3 次，回收肺泡灌洗液。在4 ℃、800 r/min 的條件下離心10 min，分離上清液放于-80 ℃冰箱保存待測(cè)。按照ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)肺泡灌洗液中ROS、MDA 水平。3）各組小鼠肺組織病理學(xué)觀察。取各組小鼠右肺，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，根據(jù)HE 染色試劑盒說明書步驟HE 染色。每張切片任取5 個(gè)視野，以觀察肺部病理變化。4）各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1、Nrf2免疫組織化學(xué)檢測(cè)。將石蠟切片脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，在切片上滴加一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜。滴加免疫組化試劑盒內(nèi)與一抗相應(yīng)種屬的二抗（HRP 標(biāo)記）覆蓋組織。滴加新鮮配制的DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。復(fù)染細(xì)胞核，脫水封片。顯微鏡鏡檢，采集圖像。采用圖像分析軟件Image-pro pus 6.0對(duì)圖像進(jìn)行分析，以平均光密度值為指標(biāo)對(duì)各組免疫組化染色進(jìn)行定量分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用Oneway ANOVA分析，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠肺功能比較 見表1。與正常組相比，模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%均顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%顯著增高（P＜0.01），中藥低劑量組、西藥組FEV0.15/FVC%顯著增高（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%均顯著降低（P＜0.01）。

表1 各組小鼠肺功能比較（±s）

表1 各組小鼠肺功能比較（±s）

注：與正常組比較，*P ＜0.01；與模型組比較，△P ＜0.01；與中藥高劑量組比較，▲P ＜0.01。下同。

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 FEV0.15/FVC%85.83±3.51 55.29±2.93*74.25±2.44*△62.41±1.02*△▲62.57±4.64*△▲FEF50%（mL/s）6.74±0.22 3.90±0.61*5.47±0.24*△4.15±0.14*▲4.11±0.49*▲FEF75%（mL/s）4.82±0.30 2.40±0.67*3.49±0.35*△2.35±0.22*▲2.37±0.42*▲

2.2 各組小鼠肺組織病理改變 見圖1。正常組：小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常，小氣道支氣管壁正常。模型組：小鼠肺泡結(jié)構(gòu)不完整，部分肺泡壁增厚，可見大量炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁斷裂，肺泡腔擴(kuò)大，小氣道支氣管壁增厚，氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤。中藥高劑量組：小鼠肺組織病理改變相對(duì)模型組改善較為明顯，絕大多數(shù)肺泡結(jié)構(gòu)趨向正常。中藥低劑量組：小鼠肺組織病理改變相對(duì)模型組有所改善，部分肺泡壁增厚，可見炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁斷裂，小氣道支氣管壁增厚。西藥組：小鼠肺組織病理改變相對(duì)模型略有所改善，部分肺泡壁增厚，較多炎性細(xì)胞浸潤，部分肺泡壁斷裂。

圖1 各組小鼠肺組織病理改變（HE染色，20倍）

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA含量比較 見表2。與正常組相比，模型組、中藥低劑量組、西藥組ROS、MDA 均顯著增高（P＜0.01），中藥高劑量組ROS顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組ROS、MDA 以及中藥低劑量組ROS 顯著減少（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組ROS、MDA均顯著增多（P＜0.01）；與中藥低劑量組相比，西藥組ROS顯著增多（P＜0.05）。

表2 各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA含量比較（±s）

表2 各組小鼠肺泡灌洗液ROS、MDA含量比較（±s）

注：與中藥低劑量組比較，★P ＜0.05。下同。

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 ROS（U/mL）5.17±1.00 17.47±1.34*8.40±1.14*△14.38±1.63*△▲16.52±2.49*▲★MDA（μmol/L）2.38±0.54 4.47±0.95*2.57±0.56△4.33±0.84*▲4.03±0.94*▲

2.4 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1 平均光密度值比較 見表3、圖2。與正常組相比，模型組、西藥組SOD 均顯著減少（P＜0.01），中藥高劑量組SOD 顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組及中藥低劑量組SOD 均顯著增多（P＜0.01 或P＜0.05）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組SOD 均顯著減少（P＜0.01）。與正常組相比，中藥高劑量組HO-1、NQO1顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組HO-1、NQO1 顯著增多（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組HO-1、NQO1 顯著減少（P＜0.01）；與中藥低劑量組相比，西藥組HO-1顯著減少（P＜0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1、Nrf2表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，20倍）

表3 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1平均光密度值比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織SOD、HO-1、NQO1平均光密度值比較（±s）

注：與模型組比較，△△P ＜0.05。

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 SOD 0.003 9±0.001 00 0.001 4±0.000 53*0.006 0±0.000 80*△0.002 7±0.000 82△△▲0.002 0±0.000 78*▲HO-1 0.002 3±0.000 80 0.002 4±0.001 50 0.006 4±0.001 10*△0.003 3±0.000 80▲0.002 1±0.000 85▲★NQO1 0.004 0±0.000 79 0.003 2±0.000 98 0.009 5±0.003 14*△0.004 2±0.000 70▲0.003 3±0.000 85▲

2.5 各組小鼠肺組織Nrf2 平均光密度值比較 見表4、圖2。與正常組相比，中藥高劑量組Nrf2 顯著增多（P＜0.01）；與模型組相比，中藥高劑量組Nrf2 顯著增多（P＜0.01）；與中藥高劑量組相比，中藥低劑量組、西藥組Nrf2顯著減少（P＜0.01）。

表4 各組小鼠肺組織Nrf2平均光密度值比較（±s）

表4 各組小鼠肺組織Nrf2平均光密度值比較（±s）

組 別正常組模型組中藥高劑量組中藥低劑量組西藥組n66666 Nrf2 0.002 4±0.000 94 0.002 1±0.000 88 0.0102±0.00484*△0.0020±0.00081▲0.0028±0.00101▲

3 討 論

該研究表明，健脾補(bǔ)腎益肺方可改善COPD 小鼠的肺功能，改善小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激程度，通過調(diào)控Keap1-Nrf2-AER 信號(hào)通路，增強(qiáng)抗氧化劑的表達(dá)，從而減輕小鼠氧化應(yīng)激，保護(hù)小鼠的肺功能，減輕肺氣腫程度，減少小氣道壁的炎性浸潤。COPD 發(fā)病中氧化應(yīng)激機(jī)制是目前的研究熱點(diǎn)，有關(guān)中藥復(fù)方對(duì)COPD 小鼠氧化應(yīng)激機(jī)制以及相關(guān)通路影響的研究目前還尚未深入，本研究揭示了健脾補(bǔ)腎益肺方可能通過調(diào)節(jié)COPD 小鼠Keap1-Nrf2-AER 信號(hào)通路從而減輕氧化應(yīng)激程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，健脾補(bǔ)腎益肺方能顯著提高COPD小鼠的FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%，提示該方可改善COPD 小鼠的肺功能。前期臨床研究［4-5］發(fā)現(xiàn)，健脾補(bǔ)腎益肺方治療組患者的FEV1%、FEV1/FVC%顯著高于正常組，提示該方可改善患者的肺功能。該方的臨床療效在動(dòng)物模型上得到了驗(yàn)證。健脾補(bǔ)腎益肺方是何明教授在多年的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上總結(jié)提煉而成的，方中太子參、黃芪補(bǔ)益肺氣，健脾助運(yùn)，熟地黃、黃精補(bǔ)腎益精，白果、地龍斂肺平喘。該方主要藥物黃芪、太子參、熟地黃、黃精具有抗氧化作用［7-10］，故筆者進(jìn)一步探討健脾補(bǔ)腎益肺方對(duì)氧化應(yīng)激以及相關(guān)抗氧化通路的影響，從而揭示其抗氧化的機(jī)制，為指導(dǎo)中醫(yī)藥治療COPD提供更多的證據(jù)。

COPD 小鼠存在氧化-抗氧化失衡。ROS、MDA 為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物，ROS包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過氧化氫等，當(dāng)ROS 生成過多時(shí)，可導(dǎo)致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 過氧化，MDA 是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物［11］。SOD、HO-1、NQO1則為重要的抗氧化劑［12］。此外HO-1 被報(bào)道是肺中的抗氧化劑，在保護(hù)肺細(xì)胞免受氧化應(yīng)激及炎癥損傷方面具有重要意義［13］。研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠ROS、MDA 比正常組均顯著增高，而模型組小鼠SOD 比正常組顯著減少，兩組HO-1、NQO1 無顯著差異，說明模型組小鼠比正常組氧化應(yīng)激生物標(biāo)志物明顯增多，而抗氧化劑卻減少或與正常組無差異，證實(shí)模型組小鼠存在氧化-抗氧化失衡。

健脾補(bǔ)腎益方可減輕COPD 小鼠的氧化應(yīng)激程度。健脾補(bǔ)腎益肺方高、低劑量組比模型組ROS 均顯著減少，健脾補(bǔ)腎益肺方高劑量組MDA 比模型組顯著減少，以上數(shù)據(jù)表明該方可減輕COPD 小鼠的氧化應(yīng)激程度。本研究進(jìn)一步探討了健脾補(bǔ)腎益肺方減輕COPD 小鼠氧化應(yīng)激水平的機(jī)理。Keap1-Nrf2-ARE是近年來抗氧化通路中的研究熱點(diǎn)。在非應(yīng)激條件下，Nrf2 的天然抑制劑Keap1 將Nrf2 隔離在細(xì)胞質(zhì)中，并促進(jìn)26S 蛋白酶體對(duì)Nrf2 的降解；在應(yīng)激條件下［12，14-16］，Nrf2 與keap1 分離，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，激活A(yù)RE 依賴的一系列抗氧化蛋白基因的表達(dá)，包括HO-1、NQO1、SOD 等，即HO-1、NQO1、SOD 是Keap1-Nrf2- ARE 信號(hào)通路的下游產(chǎn)物。老年吸煙者和COPD 患者巨噬細(xì)胞Nrf2 表達(dá)降低［17］。Nrf2 系統(tǒng)的激活被認(rèn)為是一種強(qiáng)大的細(xì)胞保護(hù)策略［18］。本研究表明，健脾補(bǔ)腎益肺方高、低劑量組SOD 均比模型組顯著增多，健脾補(bǔ)腎益肺方高劑量組HO-1、NQO1 比模型組顯著增多，說明該方具有增強(qiáng)COPD 小鼠抗氧化的作用。健脾補(bǔ)腎益肺方高劑量組Nrf2比模型組顯著增多，說明該方可能通過激活Keap1-Nrf2-ARE 通路，上調(diào)Nrf2 的表達(dá)從而上調(diào)SOD、HO-1、NQO1 在肺組織中的表達(dá)。另外也有一些研究顯示出了中藥復(fù)方或單體對(duì)COPD 氧化失衡的作用。如補(bǔ)肺益腎方可提高COPD 大鼠Nrf2、HO-1 等的表達(dá)，降低血清過氧化物表達(dá)。紅景天苷對(duì)COPD 小鼠肺損傷具有保護(hù)作用，對(duì)COPD 體外細(xì)胞模型也具有一定的保護(hù)作用，與其抗氧化應(yīng)激作用密切相關(guān)［19-21］。

健脾補(bǔ)腎益肺方高劑量組比低劑量組Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 顯著增多，該方在調(diào)節(jié)Nrf2 與SOD、HO-1、NQO1 方面呈現(xiàn)出了量效關(guān)系。這與氧化應(yīng)激水平的生物標(biāo)記物ROS、MDA 在兩組間的變化趨勢(shì)相反，高劑量組比低劑量組ROS、MDA 顯著減少；與肺功能在兩組間的變化趨勢(shì)一致，高劑量組比低劑量組FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%顯著增高。中藥高劑量組比西藥組Nrf2、SOD、HO-1、NQO1 均顯著增多，另外在降低COPD 小鼠ROS、MDA和提高肺功能方面，中藥復(fù)方比西藥組也顯示出了優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，COPD 小鼠存在氧化和抗氧化失衡，健脾補(bǔ)腎益肺方可能通過激活COPD 小鼠Keap1-Nrf2-ARE 通路，上調(diào)Nrf2 的表達(dá)而增加該通路下游抗氧化劑的產(chǎn)生，從而減輕氧化應(yīng)激程度，保護(hù)小鼠肺功能。