王 佩 許文婧 馬理海 張 浩 孟令占

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

目前，放射治療是治療胸部腫瘤的主要方法之一，但放療后急性放射性肺炎（ARP）的發(fā)病率高達5%～20%［1］。ARP 患者會出現(xiàn)發(fā)熱、呼吸困難、咳嗽等癥狀，甚至死亡［2］。強大的電離輻射穿過肺組織時，可直接導致DNA 雙鏈斷裂，細胞死亡，最終引發(fā)患者的免疫反應(yīng)［3］。巨噬細胞通過M1和M2極化參與宿主的免疫應(yīng)答，其中M1 極化放大炎癥免疫應(yīng)答，而M2 極化減輕炎癥免疫應(yīng)答［4］。氧化應(yīng)激也在ARP的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用［5］。因此，平衡M1/M2 極化和氧化應(yīng)激來控制ARP的發(fā)展是非常有必要的。

ARP治療常用的預防性藥物是兩性霉素等細胞保護劑，可減弱放療對正常肺組織的細胞毒害作用［6］；常用的治療藥物是皮質(zhì)類固醇，輔以抗生素預防繼發(fā)感染［7］。然而，皮質(zhì)類固醇藥物治療可能產(chǎn)生一些副作用，如高血壓、脂肪重排和骨質(zhì)疏松癥。補肺清肝化瘀方是重慶市中醫(yī)院院內(nèi)制劑，由16 種中藥組成，具有抗炎、抗氧化作用。補肺清肝化瘀方在臨床上用于ARP治療已取得顯著療效［8］，但其分子機制尚不清楚。本研究擬通過X 射線照射誘導建立ARP 大鼠模型，觀察補肺清肝化瘀方對ARP 大鼠氧化應(yīng)激和自噬的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18 只SPF 級健康成熟7～8 周齡雄性SD 大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自四川成都達碩生物有限公司，動物使用許可證號：SYXK（川）2019-189，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（川）2019-031。所有實驗程序均經(jīng)重慶市中醫(yī)院倫理委員會（倫理審查編號：2020-DWSY-WP）批準，并參照《實驗動物護理和使用指南》執(zhí)行。

1.2 藥物

補肺清肝化瘀方，組方：太子參30 g，麥冬15 g，百合15 g，地龍10 g，桃仁10 g，紅花10 g，赤芍12 g，川芎12 g，青黛3 g，杏仁12 g，莪術(shù)12 g，當歸15 g，夏枯草15 g，浙貝母15 g，地骨皮15 g，桑白皮15 g。藥材購自河北嘉恒冷背藥業(yè)有限公司，經(jīng)重慶市中醫(yī)院王懷碧教授鑒定為正品。水煎取汁200 mL，真空分裝。根據(jù)人-動物體表面積換算公式確定給藥劑量。

1.3 試劑與儀器

蘇木素伊紅染色試劑盒（貨號C0105S）、RIPA 裂解液（貨號P0013B）、Bradford 蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0006）、BeyoECL Plus 試劑盒（貨號P0018S）、Rat IL-1β ELISA Kit（貨號PI303）、Rat IL-6 ELISA Kit（貨號PI328）、Rat IL-10 ELISA Kit（貨號PI525）、Rat TNFα ELISA Kit（貨號PT516）、Rat IL-4 ELISA Kit（貨號PI615）、Rat TGF-β ELISA Kit（貨號PT878）、MDA 檢測試劑盒（貨號S0131S）、Reactive Oxygen Assay Kit（貨號S0033S）均購自碧云天公司；Masson 三色染色試劑盒（BC-DL-002，Biochannel 公司）；8-OHdG-ELISA 酶聯(lián)免疫試劑盒（貨號E02H0007，上海藍基生物科技有限公司）；anti-p62-antibody（ab109012）、anti-LC3-antibody（ab192890）購自abcam 公司；FITC Anti-rat CD68（貨號MA5-28262，Thermo Scientific 公司）；PE anti-rat CD86（200307）、PE anti-rat CD206（貨號141705）均購自美國Biolegend 公司。SYNERGY HI 型酶聯(lián)免疫檢測儀（美國伯騰儀器有限公司），F(xiàn)ACSCalibur 型流式細胞儀（美國BD 公司），WD-9423B 型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一生物科技有限公司）。

1.4 模型制備

采用直線加速器6MV-X 線行全胸單次照射，在相對較短時間建立ARP 模型。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（36 mg/kg）麻醉，仰臥位固定在與肺臟在同一水平面上，用膠帶將四肢固定在自制的照射板上，下墊10 cm 厚等效物，上覆2 cm 厚等效膜，充分暴露胸部，鉛板遮擋保護頭部和腰部，放于照射臺上，模擬機下定位；調(diào)整照射野，上至大鼠前肢兩腋窩中點連線，下至劍突水平，照射野2 cm×3 cm，進行全肺單照射（照距SSD 為100 cm，200 cGy/min），總照射劑量為18 Gy。照射前用紫外線消毒。

1.5 分組與給藥

將大鼠分為對照組、模型組、中藥組，每組6 只。于造模7 d 前，中藥組灌胃1 mL/100 g 補肺清肝化瘀方濃縮液，對照組和模型組灌胃等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)21 d。每3 天記錄1 次大鼠體質(zhì)量，最后1 天計算肺系數(shù)（肺系數(shù)=肺濕重÷末次體質(zhì)量）。照射14 d后處死大鼠，取肺組織保存-80 ℃冰箱用于后續(xù)實驗。

1.6 檢測指標

1.6.1 肺組織病理學檢測 取肺組織樣本，在10%甲醛液中充分浸泡，室溫下固定48 h，常規(guī)脫水和石蠟包埋后，進行組織病理學切片（4 μm），然后根據(jù)說明書進行HE 染色和Masson 染色，于顯微鏡下觀察肺組織病理損傷。

1.6.2 ELISA 法 收集支氣管肺泡灌洗液，3 000×g，4 ℃下離心4 min，根據(jù)說明書檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）水平。取肺組織樣本，將其轉(zhuǎn)移到玻璃勻漿器中，加入10 mL 預冷PBS，低溫快速研磨成勻漿，3 000×g，4 ℃下離心4 min，取上清，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法分析丙二醛（MDA）、8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量。

1.6.3 流式細胞術(shù) 將肺組織研磨并收集沉積物，用PBS 溶解并沖洗。250×g離心5 min，收集細胞，用PBS重懸。加入FITC 抗大鼠CD68，室溫孵育20 min。再次離心重懸細胞懸液，加入PE 抗大鼠CD86和CD206，4 ℃孵育20 min。流式細胞儀檢測CD68+、CD86+和CD206+的表面水平，并使用CytExpert 軟件進行分析。利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧（ROS）檢測，流式細胞儀分析熒光信號強度即ROS水平。

1.6.4 Western blotting 檢測 取肺組織樣本，低溫快速研磨成勻漿，RIPA 裂解緩沖液提取蛋白，收集組織裂解液于離心管中，12 000×g4 ℃離心15 min，收集上清，并通過Bradford 蛋白濃度測定試劑盒進行定量檢測。提取的蛋白通過SDS-PAGE 電泳分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，再用Tris-buffer 稀釋的5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后，滴加50 μL 的一抗，4 ℃孵育過夜，PBS 洗膜，滴加二抗［山羊抗兔IgG（HRP）抗體］，室溫下與膜孵育1 h。最后，采用BeyoECL Plus 試劑盒顯影目的條帶，β-actin被用作內(nèi)參。采用Image J軟件計算目的蛋白的灰度值。

1.6.5 免疫熒光雙染色法 收集肺組織，冷凍切片，8 μm，在冷甲醇/丙酮（1∶1）中固定10 min。PBS 洗滌3次，切片用3%牛血清白蛋白在25 ℃下封閉60 min。PBS 洗滌3 次，避光滴加抗體（抗LC3B 抗體作為第一抗體，抗CD68 抗體作為第二抗體），PBS 再次洗滌，滴加Alexa Fluor 488 偶聯(lián)二抗在25 ℃避光孵育2 h。DAPI染色細胞核，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表達情況。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量比較

見表1、表2。與對照組相比，模型組體質(zhì)量第9天開始下降（P＜0.05）；補肺清肝化瘀方治療可逆轉(zhuǎn)大鼠體重下降（P＜0.05），第12 天是體質(zhì)量上調(diào)的轉(zhuǎn)折點。與對照組相比，模型組大鼠肺系數(shù)升高（P＜0.001），補肺清肝化瘀方治療后肺系數(shù)降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量比較（g，±s）

表1 各組大鼠不同時期體質(zhì)量比較（g，±s）

注：與對照組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001；與模型組比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01，△△△P ＜0.001。下同。

組 別對照組模型組中藥組n666 0 d 190.26±5.70 191.78±2.55 192.30±3.01 3 d 200.60±2.51 199.80±2.83 198.18±1.53 6 d 228.56±3.46 228.30±4.88 226.22±2.46 9 d 240.48±5.80 216.38±5.23*211.04±2.81 12 d 257.32±5.53 203.88±6.86*197.34±3.69 15 d 270.14±5.53 197.42±4.20*212.70±6.24△18 d 281.94±4.48 187.86±3.35*229.00±5.27△21 d 295.16±2.81 176.80±3.24*239.76±5.05△

表2 各組大鼠肺系數(shù)、膠原容積分數(shù)、巨噬細胞M2/M1比值比較（±s）

表2 各組大鼠肺系數(shù)、膠原容積分數(shù)、巨噬細胞M2/M1比值比較（±s）

組 別對照組模型組中藥組n666肺系數(shù)（mg/g）2.82±0.13 3.33±0.22***3.06±0.11△膠原容積分數(shù)（%）0.26±0.03 7.89±1.36***3.62±0.50△△△M2/M1比值3.80±0.42 0.27±0.07***1.18±0.71△

2.2 各組大鼠肺組織病理變化

見圖1、表2。HE 染色結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)嚴重破壞，肺泡數(shù)量減少，肺泡間隔增厚，血管充血，淋巴細胞浸潤；補肺清肝化瘀方治療顯著改善病理損傷。Masson 染色結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組大鼠膠原沉積增加（P＜0.001），補肺清肝化瘀方治療可降低膠原沉積（P＜0.001）。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化

2.3 各組大鼠炎癥因子水平的比較

見表3。與對照組相比，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β 水平增加（P＜0.01），TGF-β、IL-10、IL-4 水平降低（P＜0.01）。補肺清肝化瘀方治療后，TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.05 或P＜0.01），TGF-β、IL-10、IL-4水平增加（P＜0.05）。

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠炎癥因子水平比較（pg/mL，±s）

組別對照組模型組中藥組n666 TNF-α 19.88±2.33 37.96±4.58**28.12±3.16△IL-6 12.14±1.19 19.16±1.13**13.88±1.94△△IL-1β 5.33±0.44 8.33±0.62**6.59±0.71△IL-4 10.74±0.74 6.78±0.89**9.12±1.14△IL-10 17.33±2.79 8.90±1.30**14.74±1.61△TGF-β 16.77±1.62 6.95±2.33**12.37±2.03△

2.4 各組大鼠巨噬細胞極化水平比較

見圖2、表2。流式細胞術(shù)量化M2/M1 比值，CD68標記巨噬細胞，CD86 標記M1 巨噬細胞，CD206 標記M2 巨噬細胞。結(jié)果所示，與對照組相比，模型組M2/M1 比值降低（P＜0.001），補肺清肝化瘀方治療后，M2/M1比值升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠巨噬細胞極化

2.5 各組大鼠線粒體氧化應(yīng)激水平比較

見圖3、表4。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組ROS、MDA 和8-OHdG 水平增加（P＜0.001）；補肺清肝化瘀方治療后，ROS、MDA、8-OHdG 水平降低（P＜0.05或P＜0.001）。

圖3 各組大鼠肺組織ROS水平

表4 各組大鼠線粒體氧化應(yīng)激水平比較（±s）

表4 各組大鼠線粒體氧化應(yīng)激水平比較（±s）

組 別對照組模型組中藥組n666 ROS 18 240.43±2 643.17 62 607.03±3 209.22***49 487.58±3 692.30△△△MDA（nmol/mL）0.48±0.03 0.66±0.03***0.61±0.03△8-OHdG（ng/mL）5.70±0.40 7.67±0.27***6.84±0.57△

2.6 各組大鼠巨噬細胞自噬激活情況比較

見圖4、圖5、表5。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組CD68/LC3B 共表達和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低，p62表達增加（P＜0.001）。補肺清肝化瘀方治療后，LC3B/CD68 共表達（P＜0.01）和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值（P＜0.05）增加，p62表達降低（P＜0.001）。

圖4 各組大鼠巨噬細胞自噬免疫熒光雙染色檢測

圖5 各組大鼠肺組織LC3和p62蛋白表達

表5 各組大鼠巨噬細胞自噬激活情況比較（±s）

表5 各組大鼠巨噬細胞自噬激活情況比較（±s）

組 別對照組模型組中藥組n666 LC3B/CD68 27.83±1.84 15.06±1.70***21.54±2.18△△p62 1.00±0.06 3.08±0.23***2.24±0.31△△△LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.02±0.22 0.12±0.01***0.43±0.16△

3 討 論

補肺清肝化瘀法臨床治療ARP 的中醫(yī)證候療效顯著，然而其作用機制還不清楚，還沒有相關(guān)研究。巨噬細胞極化是炎癥調(diào)節(jié)的先決條件，其結(jié)果是促炎和抗炎的雙重作用。因此，本研究擬探討補肺清肝化瘀方對ARP大鼠巨噬細胞極化的影響。

巨噬細胞主要分化為M1 表型和M2 表型。其中，M1表型通常分泌促炎細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-23［9］。M2 表型通常由抗炎細胞因子誘導，如IL-4、IL-10、IL-13 和TGF-β［10］。有研究發(fā)現(xiàn)，新風膠囊可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞極化改善類風濕關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)炎癥［11］。本研究結(jié)果顯示，補肺清肝化瘀方治療明顯逆轉(zhuǎn)了ARP 誘導的巨噬細胞浸潤，促進了M2 極化，細胞因子的分泌也與之一致。這表明抑制M1極化可能是ARP 的治療靶點。已有研究證實，巨噬細胞極化通過促進ROS的產(chǎn)生有助于氧化應(yīng)激的發(fā)生［12］。羅哌卡因通過抑制M1 型巨噬細胞極化緩解腦缺血再灌注損傷大鼠引起的免疫紊亂和組織氧化應(yīng)激損傷［13］。TNF-α、TGF-β 和IL-6 等細胞因子誘導ROS/NO 的過表達，進而促進生成酶COX-2、iNOS和NADPH p67phox的生成，進一步導致ROS 生成和氧化應(yīng)激［14］。此外，MDA 和8-OHdG 也是氧化應(yīng)激的經(jīng)典生物標志物。本研究表明ARP 模型誘導高水平的氧化損傷，表現(xiàn)為ROS、MDA 和8-OHdG 水平顯著增加。近期研究表明M2 極化可緩解氧化應(yīng)激損傷。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)，補肺清肝化瘀方治療可以緩解炎性M1 巨噬細胞向抗炎M2巨噬細胞轉(zhuǎn)化時的氧化應(yīng)激。

在本研究中，ARP模型大鼠巨噬細胞自噬被抑制。一方面，正如之前的報道所描述的，自噬激活可以保護組織免受氧化應(yīng)激引起的持續(xù)損傷［15］。另一方面，自噬激活有助于減輕肺纖維化，使患者恢復正常的肺功能。柴胡皂苷d 可改善TGF-β1 誘導的Ⅱ型肺泡上皮細胞纖維化改變，其機制可能是通過抑制mTOR 通路激活誘導細胞自噬發(fā)揮作用［16］。因此，激活自噬對治療ARP 至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，補肺清肝化瘀方治療可以激活肺組織的自噬，尤其是巨噬細胞的自噬。

綜上所述，巨噬細胞極化和氧化應(yīng)激在調(diào)節(jié)自噬激活過程中起重要作用。補肺清肝化瘀方通過抑制M1極化，緩解氧化應(yīng)激，激活ARP大鼠自噬。然而，本研究沒有探討補肺清肝化瘀方調(diào)控ARP 大鼠巨噬細胞自噬活化的機制；AMPK 能抑制mTOR 的活化而促進ULK1 活化從誘導自噬的產(chǎn)生，是調(diào)節(jié)自噬的一個重要信號。在后續(xù)的研究中，探討補肺清肝化瘀方對ARP 大鼠AMPK 介導的自噬信號活化的影響，分析抑制AMPK介導的自噬促進M1巨噬細胞向M2型巨噬細胞的極化，從而抑制炎癥和氧化應(yīng)激損傷。