張 偉

（銅陵市農(nóng)業(yè)技術(shù)管理服務(wù)中心，安徽 銅陵 244000）

簇毛麥（Haynaldia villosa），又名屬小麥族簇毛麥屬，是小麥的一個(gè)野生近緣種，不但抗小麥白粉病、銹病、全蝕病和眼斑病等多種病害[1-3]，而且具有分蘗力強(qiáng)、抗寒耐旱、密穗多花和籽粒蛋白質(zhì)含量高等特點(diǎn)[4-5]，是小麥遺傳改良的重要基因源。為了進(jìn)一步轉(zhuǎn)移和利用簇毛麥其他優(yōu)異基因，以硬粒小麥-簇毛麥雙倍體[6-7]為基礎(chǔ)材料，利用花粉輻射與有性雜交相結(jié)合，創(chuàng)制出大量的小麥-簇毛麥屬間染色體易位，用中國(guó)春對(duì)這些材料連續(xù)回交，已得到普通小麥背景中只包含單條簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異的一些單株。早期準(zhǔn)確鑒定這批單株中簇毛麥的身份，對(duì)于簇毛麥有益基因的定位及利用，都具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和應(yīng)用價(jià)值[8-10]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前報(bào)道的簇毛麥各類(lèi)標(biāo)記僅有43個(gè)[11-13]，且分布不均勻，利用這些標(biāo)記來(lái)鑒定大量的簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，大量涌現(xiàn)的表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed Sequence Tag，EST）序列為引物設(shè)計(jì)提供了便利[14-15]。EST 是對(duì)cDNA 文庫(kù)隨機(jī)挑取的克隆進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序獲得的一段cDNA 的5′或3′端序列，長(zhǎng)度一般為300～500 bp[16-18]。比較基因組研究結(jié)果表明，EST 的序列組成和染色體上的排列順序在禾本科物種間具有高度的共線(xiàn)性[19]。小麥及其近緣物種的EST 在理論上具有更高的共線(xiàn)性，定位于小麥染色體某一部分同源群的EST 也應(yīng)存在于近緣物種同一部分同源群染色體的對(duì)應(yīng)部位。由于EST 來(lái)自轉(zhuǎn)錄區(qū)，其保守性較高，在族和屬間的通用性比來(lái)源于非表達(dá)序列區(qū)的標(biāo)記更好，特別適用于遠(yuǎn)緣物種間的比較基因組研究，另外，利用EST序列開(kāi)發(fā)的各種標(biāo)記具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)并且高效的特點(diǎn)。本研究為了鑒定花粉輻射得到的結(jié)構(gòu)變異染色體中的簇毛麥身份，基于作物的共線(xiàn)性關(guān)系，利用小麥的EST 序列合成STS 引物，以及小麥、大麥和黑麥的SSR 引物，篩選能準(zhǔn)確鑒定簇毛麥各條染色體的特異標(biāo)記，為簇毛麥的進(jìn)一步研究和利用提供更便捷有效的工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

普通小麥中國(guó)春（Triticum aestivumvar.Chinese Spring，CS）、簇毛麥（由南京植物園從英國(guó)劍橋植物園引進(jìn)）、硬粒小麥（T.durum）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院引種組從國(guó)際玉米小麥改良中心引進(jìn)，編號(hào)“中引1286”）、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體（T.durum-H.villosa amphiploid，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所選育）、小麥-簇毛麥整套二體異附加系DA1V至DA7V和硬粒小麥-簇毛麥雙倍體花粉輻射回交后代均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳研究所保存。

1.2 引物

為篩選簇毛麥1V 至7V 各條染色體的特異標(biāo)記，根據(jù)小麥EST 序列合成了1 125 對(duì)STS 引物；另選用小麥SSR 引物227 對(duì)，大麥SSR 引物61 對(duì)和黑麥SSR 引物163 對(duì)（表1）。以上引物均由上海英駿生物公司合成。

表1 本研究用于篩選簇毛麥染色體特異標(biāo)記的引物類(lèi)型

1.3 基因組DNA提取

參照Sharp 等[20]的方法，用1×TE 溶解，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR反應(yīng)

PCR體積為10 μL，包含約20～30 ng模板DNA，1×buffer，1.5 mmol/L MgCl2，200 mmol/L dNTP，引物終濃度各為0.2 mol/L，0.5 UTaqDNA 聚合酶（以上試劑均來(lái)自Promega 公司）。PCR 程序?yàn)?4 ℃變性3 min；94℃30 s、55～60 ℃（依引物而定）50 s、72 ℃1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.5 產(chǎn)物檢測(cè)

參照Tixier 等[21]的方法檢測(cè)產(chǎn)物，其中所用Marker 為DL2000（Promega）。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物中加入聚丙烯酰胺凝膠電泳專(zhuān)用的Loading buffer 2 μL 混勻，取3 μL 樣液用8%聚丙烯酰胺凝膠（39∶1）電泳檢測(cè)結(jié)果。電泳時(shí)總電壓為180 V，電泳1.5 h 左右，銀染后將膠放在凝膠成像儀上觀(guān)察照相[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選簇毛麥各條染色體特異分子標(biāo)記

在檢測(cè)的1 125對(duì)小麥EST引物中，有597對(duì)引物可以在中國(guó)春與簇毛麥間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，占小麥EST引物的53.1%；在檢測(cè)的227對(duì)小麥SSR引物中，有93對(duì)引物可以在中國(guó)春與簇毛麥間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，占小麥SSR 引物的41.0%；在檢測(cè)的61 對(duì)大麥和163 對(duì)黑麥的SSR 引物中，分別有13 對(duì)和52 對(duì)引物可以在中國(guó)春和簇毛麥間擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，分別占大麥SSR 引物的21.3%和黑麥SSR引物的31.9%?？梢钥闯?，利用小麥EST 序列設(shè)計(jì)的引物和小麥的SSR 引物在親本間有較高的多態(tài)性，而大麥和黑麥的SSR 引物在親本間的多態(tài)性較低。用這些多態(tài)性引物對(duì)親本及普通小麥-簇毛麥1V-7V 二體附加系進(jìn)行擴(kuò)增分析，篩選到簇毛麥特異條帶只出現(xiàn)在1個(gè)異附加系中并且?guī)Ъy穩(wěn)定清晰的引物共89對(duì)，其中，1V標(biāo)記2個(gè)、2V標(biāo)記14個(gè)、3V標(biāo)記8個(gè)、4V標(biāo)記8個(gè)、5V標(biāo)記41個(gè)、6V標(biāo)記2個(gè)和7V標(biāo)記14個(gè)，如表2所示。

表2 所篩選的簇毛麥染色體特異分子標(biāo)記

位于小麥第一群的SSR引物Xbarc210在簇毛麥、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體以及1V附加系中均擴(kuò)增出相同的220 bp，而中國(guó)春及其他附加系則無(wú)此帶（圖1a），表明Xbarc210-220可作為簇毛麥1V染色體的特異標(biāo)記。同樣，引物CINAU186、CINAU200、CINAU206、CINAU211、CINAU250和CINAU255在分別涉及簇毛麥2V、3V、4V、5V、6V和7V染色體異附加系中均可擴(kuò)增出與簇毛麥、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體相同的特異帶，因此可分別作為簇毛麥2V、3V、4V、5V、6V和7V染色體的特異標(biāo)記（圖1b-g）。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，定位于第五和第七群的EST序列所涉及的引物可以特異追蹤簇毛麥的7V和4V染色體，這一結(jié)果符合小麥在進(jìn)化過(guò)程中第四、第五和第七群之間發(fā)生了復(fù)雜的易位和倒位。如根據(jù)第五群EST序列設(shè)計(jì)的引物CINAU259（5AL 0.59-0.78）可以追蹤簇毛麥的7V 染色體，而根據(jù)第七群EST 序列設(shè)計(jì)的引物CINAU206 （7AS 0.89-1.00，7DS 0.61-1.00） 、CINAU207 （7AS 0.89-1.00，7DS 0.61-1.00） 、CINAU208 （7AS 0.89-1.00，7BS 0.27-1.00） 和CINAU209（7DS 0.61-1.00）可以特異追蹤簇毛麥的4V染色體。

圖1 引物對(duì)親本及小麥-簇毛麥異附加系DNA的擴(kuò)增

2.2 簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體鑒定

從中國(guó)春/硬粒小麥-簇毛麥（60Co-γ 射線(xiàn)照射花粉）//中國(guó)春BC3～BC4代中，選用經(jīng)GISH 鑒定在普通小麥背景中只含單條簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異的110 份材料，用本研究得到的和已有的146 個(gè)簇毛麥特異引物擴(kuò)增親本和110 份材料的DNA，鑒定所涉及的簇毛麥染色體身份。圖2 是利用定位于簇毛麥1V 染色體短臂標(biāo)記Xcinau27-620和長(zhǎng)臂標(biāo)記Xcinau32-300在親本和部分簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體單株中的擴(kuò)增結(jié)果。CINAU27 在簇毛麥、硬粒小麥-簇毛麥雙倍體、1V 附加系、1VS·W、TV54-4-1（泳道14）、TV288-4（泳道15）、TV277-7（泳道16）和TV281-6（泳道18）中擴(kuò)增出約620 bp的特異帶，而中國(guó)春和其他結(jié)構(gòu)變異體均未擴(kuò)增出此帶（圖2a）；CINAU32 分別在TV322-22（泳道17）、TV281-6（泳道18）和TV279-2（泳道19）中擴(kuò)增出與簇毛麥相同的300 bp 的特異帶，而中國(guó)春和其他變異體均未擴(kuò)增出此帶（圖2b），表明這些材料中涉及的外源染色體片段均為1V 染色體片段。

圖2 特異引物CINAU27（a）和CINAU32（b）對(duì)簇毛麥結(jié)構(gòu)變異染色體系DNA的擴(kuò)增

3 結(jié)論與討論

對(duì)導(dǎo)入小麥背景中簇毛麥染色體的準(zhǔn)確鑒定是利用其優(yōu)異基因的前提，鑒定方法有多種，如形態(tài)學(xué)標(biāo)記、C-分帶和生化標(biāo)記等，但這些方法都有各自的局限性。建立在DNA 水平上的分子標(biāo)記所揭示的多態(tài)性直接反映基因組DNA 間的差異，不受發(fā)育階段和環(huán)境的影響[12]，因此是鑒定小麥背景中簇毛麥染色體“身份”、易位染色體斷點(diǎn)位置和片段長(zhǎng)度的有效工具。課題組一直致力于簇毛麥各條染色體特異分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)開(kāi)發(fā)的基于PCR 的簇毛麥各條染色體特異分子標(biāo)記共有43 個(gè)（表3），分布不均勻，其中3V、5V 和7V 染色體標(biāo)記較少，只有2～3 個(gè)。可見(jiàn)，要想鑒定花粉輻射得到的一大批簇毛麥染色體結(jié)構(gòu)變異體，各類(lèi)標(biāo)記的密度遠(yuǎn)未達(dá)到令人滿(mǎn)意的程度。本研究針對(duì)這一現(xiàn)狀，利用EST-STS 通用性好、穩(wěn)定性高的特點(diǎn)，篩選到84 對(duì)分布于1V—7V 染色體的STS 標(biāo)記，另外還篩選到5 對(duì)SSR 標(biāo)記，對(duì)已開(kāi)發(fā)或篩選的簇毛麥分子標(biāo)記起到有益補(bǔ)充。因已得到的4V和6V染色體標(biāo)記較多，本研究未對(duì)其作針對(duì)性篩選。

表3 開(kāi)發(fā)的簇毛麥各條染色體基于PCR的特異分子標(biāo)記

續(xù)表3 開(kāi)發(fā)的簇毛麥各條染色體基于PCR的特異分子標(biāo)記

續(xù)表3 開(kāi)發(fā)的簇毛麥各條染色體基于PCR的特異分子標(biāo)記