李紫薇，李洪超，王曉楠，趙越，曹焜，王盼，朱浩，肖湘

(黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶 163316)

工業(yè)大麻(CannabissativaL.)是大麻科、大麻屬(CannabisL.)一年生直立草本植物，其四氫大麻酚(Tetrahydrocannabinol，THC)含量小于0.3%，不具有毒品利用價(jià)值，可進(jìn)行種植加工及利用[1]。工業(yè)大麻作為最早種植的經(jīng)濟(jì)作物之一，在中國(guó)已有六千多年的栽種歷史[2]，根據(jù)其用途，可將大麻分為纖用、籽用、藥用、籽纖兼用和纖藥兼用等類(lèi)型[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上由大麻衍生出的產(chǎn)品達(dá)2 萬(wàn)多種，涉及紡織、造紙、食品、醫(yī)藥及復(fù)合材料等領(lǐng)域，如:麻皮可制成服裝、紙張、繩索等，其葉、花、根可以入藥，也可以用作土壤肥料；莖稈可制成密度板等新型復(fù)合材料，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[4]。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA－Seq)，是指將高通量測(cè)序方法應(yīng)用到由mRNA 逆轉(zhuǎn)錄生成的cDNA上，能夠迅速準(zhǔn)確獲得特定物種組織或器官在特定生理狀態(tài)下幾乎所有轉(zhuǎn)錄本序列信息和表達(dá)信息[5]，該技術(shù)具有速度快、準(zhǔn)確度高、操作成本低等優(yōu)勢(shì)[6]。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在工業(yè)大麻的基因轉(zhuǎn)錄組、新基因挖掘、抗脅迫機(jī)制、分子育種及其纖維發(fā)育調(diào)控等研究領(lǐng)域獲得重大突破，在缺少參考基因組的條件下，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)不僅能獲得樣本中的序列信息，還能對(duì)序列的表達(dá)量進(jìn)行定量分析，研究差異基因的表達(dá)情況[7－8]。由于工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展以及創(chuàng)新性應(yīng)用如火如荼，當(dāng)下產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)種質(zhì)資源提出更高的要求，同時(shí)工業(yè)大麻種植也逐步由耕地向條件惡劣的非種植地?cái)U(kuò)大轉(zhuǎn)移，這使培育多功能、抗逆性強(qiáng)工業(yè)大麻品種迫在眉睫[9]，因此精準(zhǔn)鑒定、深度發(fā)掘優(yōu)異基因和特色品種資源并解析其分子機(jī)理，對(duì)工業(yè)大麻品種遺傳改良及產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新發(fā)展至關(guān)重要。伴隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和生物信息的迅速發(fā)展以及測(cè)序成本的減少，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在工業(yè)大麻中廣泛應(yīng)用。因此，本文闡述了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在工業(yè)大麻上的研究現(xiàn)狀，并展望了其在工業(yè)大麻中的應(yīng)用前景。

1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析相關(guān)概念

轉(zhuǎn)錄組的概念最早于1995年由Velculescu 提出，廣義上指特定生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，主要包括mRNA 和非編碼RNA，狹義上指所有編碼蛋白質(zhì)的mRNA 的總和[10]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在有參考基因的條件下，可以進(jìn)行序列可變剪切的調(diào)控[11－13]、轉(zhuǎn)錄圖譜的繪制[14－15]、基因家族篩選及驗(yàn)證分析[16]；在沒(méi)有參考基因組的條件下，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序也可以進(jìn)行新基因的深度挖掘[17－19]、代謝途徑的確定[20]和低豐度轉(zhuǎn)錄本的發(fā)掘[21－22]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究涉及的方法多樣，如雜交技術(shù)、cDNA 芯片、高通量測(cè)序等。現(xiàn)階段轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究主要使用高通量測(cè)序技術(shù)，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)反映某一物種的mRNA 特定情況和時(shí)間點(diǎn)下基因的表達(dá)情況[8]。

高通量測(cè)序技術(shù)(High－throughput sequencing)又稱(chēng)為“下一代測(cè)序技術(shù)”，指能夠一次同時(shí)對(duì)大量核酸分子進(jìn)行平行序列測(cè)定的技術(shù)[23]。自1953年沃森、克里克通過(guò)雙螺旋結(jié)構(gòu)認(rèn)識(shí)核酸的空間結(jié)構(gòu)后，人們開(kāi)始探究其序列信息，測(cè)序技術(shù)發(fā)展也由此拉開(kāi)序幕。1977年生物化學(xué)家Sanger 發(fā)明了鏈終止測(cè)序法，至今仍被人們認(rèn)為是第一代測(cè)序技術(shù)。隨著測(cè)序需求日益增多，第一代測(cè)序法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高，已不能滿(mǎn)足人們的需求，因此開(kāi)發(fā)出第二代測(cè)序技術(shù)。第二代測(cè)序技術(shù)以更低的成本實(shí)現(xiàn)了高通量和自動(dòng)化，同時(shí)還提升了測(cè)序的分辨率，優(yōu)化了RNA 剪切修飾功能[24]。目前，在二代測(cè)序平臺(tái)中，454 測(cè)序技術(shù)平臺(tái)最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[25－26]。但存在的問(wèn)題是，第二代測(cè)序技術(shù)需要從頭組裝并且拼接過(guò)程比較復(fù)雜，且只能對(duì)基因的局部結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，具有一定的局限性[27]，因此，第三代代表性測(cè)序技術(shù)中的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)，其通量高且測(cè)序讀數(shù)長(zhǎng)，測(cè)序過(guò)程無(wú)須進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和打斷，能直接獲得完整的轉(zhuǎn)錄本，但正因?yàn)樵跍y(cè)序時(shí)沒(méi)有經(jīng)過(guò)模板擴(kuò)增，其測(cè)序信號(hào)的檢測(cè)與邊合成邊測(cè)序的二代測(cè)序技術(shù)相比較弱，易在堿基識(shí)別時(shí)產(chǎn)生隨機(jī)錯(cuò)誤[28]，因此第三代測(cè)序準(zhǔn)確度比前兩代低，且測(cè)序成本較高，目前更多研究還是以二代測(cè)序技術(shù)為主[29]。

現(xiàn)如今，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已發(fā)展成為重要的分子生物學(xué)分析方法，被廣泛應(yīng)用于各研究領(lǐng)域。近年，工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序是比較活躍的領(lǐng)域，了解其基因表達(dá)、分析其功能和調(diào)控機(jī)制、挖掘功能基因以及開(kāi)展次生代謝產(chǎn)物途徑等研究，有助于在其遺傳育種理論與技術(shù)途徑領(lǐng)域獲得新突破，為育種研究提供有益指導(dǎo)。

2 工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究進(jìn)展

2.1 工業(yè)大麻基因組及關(guān)鍵活性成分研究

從2011年工業(yè)大麻基因組草圖發(fā)表到2020年5月公安部物證鑒定中心發(fā)表了一個(gè)高質(zhì)量染色體水平的野生大麻參考基因組，標(biāo)志著工業(yè)大麻逐步進(jìn)入了基因組時(shí)代[30]。Van 等[31]利用轉(zhuǎn)錄組和基因測(cè)序技術(shù)對(duì)高含量四氫大麻酚酸(Tetrahydrocannabidiol acid THCA)的大麻品種Purple Kush(PK)及低含量THCA 品種“Finola”和“USO－31”進(jìn)行對(duì)比分析，得到一個(gè)534 Mb 的PK 基因組草圖，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)THCA 合成酶(Tetrahydrocannabinol synthase THCAS)在大麻素合成通路顯著上調(diào)，且在PK 中表達(dá)遠(yuǎn)高于Finola 品種，該研究不僅進(jìn)一步明確了大麻轉(zhuǎn)錄組的特征，同時(shí)也為后續(xù)培育具有大麻素特征的品種及揭示工業(yè)大麻基因型和化學(xué)型的遺傳關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。

大麻素類(lèi)化合物作為工業(yè)大麻活性成分具有多種功效，目前已從大麻中分離鑒定150 余種，其中大麻酚(Cannabinol，CBN)、大麻二酚(Cannabidiol，CBD)和THC 在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[32]。CBD具有抗菌、消炎以及抗腫瘤等多種價(jià)值。為了探究通過(guò)栽培手段合成CBD 的環(huán)境影響機(jī)制，嚴(yán)江濤[33]利用RNA－Seq 對(duì)室外和室內(nèi)兩種培育環(huán)境下工業(yè)大麻品系C4 的CBD 合成分子機(jī)制進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在室外培育條件下，BDAS、CYP86B1和ALDH2C4這些基因表達(dá)量比室內(nèi)條件明顯增加，也發(fā)現(xiàn)苯丙酸生物合成途徑主要調(diào)控CBD 的合成，該研究明確了調(diào)控CBD 合成的主要代謝通路，并推測(cè)BDAS、CYP86B1和ALDH2C4這些基因參與CBD 的合成，同時(shí)除了培養(yǎng)環(huán)境對(duì)工業(yè)大麻CBD合成有影響，施加外源激素對(duì)CBD 合成機(jī)制也有一定作用。吳珊[34]利用20 mg/L 激動(dòng)素(KT)對(duì)工業(yè)大麻材料DMG227 噴施處理30 d 并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與無(wú)外源激素處理比較分析，發(fā)現(xiàn)KT 噴施處理可調(diào)控大麻植物體內(nèi)的次生代謝途徑，從而使植株的CBD 與THC 含量明顯升高，同時(shí)倍半萜和三萜生物合成次生代謝途徑富集到許多萜烯合酶基因家族，且這些萜烯合酶基因顯著表達(dá)。因此猜測(cè)，CBD 和THC 含量增加與KT 處理調(diào)控萜烯合酶的表達(dá)有關(guān)。為進(jìn)一步探究大麻素生物合成途徑中基因的表達(dá)水平，Braich 等[35]利用雌性工業(yè)大麻的根、莖、花等組織構(gòu)建和注釋了基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組圖譜，并與雄性工業(yè)大麻營(yíng)養(yǎng)組織和生殖組織進(jìn)行基因差異比較分析，挖掘出大量與大麻素合成相關(guān)的候選基因CsTPS5FN、CsTPS9FN和CsTPS12PK。

在繼利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘工業(yè)大麻活性成分合成酶及關(guān)鍵基因后，Varaerg 等[36]基于來(lái)自不同譜系的69 個(gè)大麻品種的全基因組序列，通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝及從頭測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)大麻素合成途徑編碼CBDA/THCA 合成酶基因在基因拷貝數(shù)(CN)上存在差異，并獲得多個(gè)CBDA/THCA合成酶基因家族的同源基因，該研究驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果，并從基因組水平上解釋了大麻素含量變化的調(diào)控機(jī)理。同時(shí)，Zager 等[37]通過(guò)對(duì)9 個(gè)不同品種工業(yè)大麻的腺毛進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析，利用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析方法揭示了一個(gè)與大麻素和萜類(lèi)化合物生物合成相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，鑒定出之前未曾報(bào)道過(guò)的基因:編碼橙花醇的TPS18VF、編碼芳樟醇合成酶的TPS19BL、編碼大根香葉烯B 合酶的TPS16CC和編碼四甲基環(huán)癸二烯甲醇合酶的TPS20CT(表2)[38]。這些研究為進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘工業(yè)大麻活性成分關(guān)鍵基因，提取次級(jí)代謝產(chǎn)物以及聯(lián)合多組學(xué)數(shù)據(jù)闡述大麻素合成機(jī)制提供了參考。

2.2 工業(yè)大麻纖維相關(guān)轉(zhuǎn)錄組研究

2.2.1 工業(yè)大麻纖維發(fā)育轉(zhuǎn)錄組研究

“國(guó)紡源頭，萬(wàn)年衣祖”，工業(yè)大麻纖維強(qiáng)度高，耐磨性好，具有天然抑菌和防紫外線(xiàn)等特性，因此以工業(yè)大麻韌皮纖維為原材料的食藥、日化、紡織、新材料等產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，其產(chǎn)品廣受人們追捧[39]。

工業(yè)大麻下胚軸韌皮纖維存在由伸長(zhǎng)到增厚的過(guò)渡階段，因此工業(yè)大麻是研究二次生長(zhǎng)過(guò)程的最佳模型[40]。在纖維發(fā)育方面，Guerriero 等[41]對(duì)雌雄同株工業(yè)大麻的3 個(gè)不同韌皮部位進(jìn)行RNA－Seq 分析，通過(guò)對(duì)不同纖維發(fā)育時(shí)期基因富集轉(zhuǎn)錄本的分析，發(fā)現(xiàn)每個(gè)莖區(qū)的纖維具有特定的轉(zhuǎn)錄組特征，細(xì)胞壁沉積等相關(guān)過(guò)程主要發(fā)生在莖折斷點(diǎn)的節(jié)間，還發(fā)現(xiàn)了調(diào)控細(xì)胞周期和光合反應(yīng)的相關(guān)基因如CAB1(葉綠素結(jié)合蛋白1)、LHCB4和LHCA5(光合復(fù)合物)，以及與次生代謝物即萜類(lèi)化合物、類(lèi)黃酮生物合成相關(guān)的基因，如CYP76C1(編碼細(xì)胞色素P450s)和C2(參與花芳樟醇代謝)，這些基因?qū)g皮纖維發(fā)育發(fā)揮重要作用，同時(shí)在較老的莖節(jié)部發(fā)現(xiàn)植物激素生物合成的相關(guān)基因(如GA20OX2和GA3OX1編碼赤霉素合成酶)、次級(jí)細(xì)胞壁沉積和與木質(zhì)素生物合成相關(guān)的基因(如PAL1、CesA8、EXPA8、EXPA10、EXPA11、EXPA12)表達(dá)量均較高。該研究應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)不僅確定了細(xì)胞壁沉積發(fā)生的部位，還挖掘出參與纖維發(fā)育和激素合成的基因，更深入地探究了工業(yè)大麻纖維發(fā)育分子機(jī)制。

植物激素作為重要的信號(hào)分子，對(duì)調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和環(huán)境應(yīng)答具有十分重要的作用。通過(guò)對(duì)植物進(jìn)行外源激素處理，可調(diào)節(jié)植物的次生代謝物合成，不同濃度外源激素對(duì)工業(yè)大麻組織發(fā)育皆有一定程度的影響。Guerriero 等[42]對(duì)播種后16、17、18、20 d 的幼苗噴灑茉莉酸(JA)，利用RT－qPCR 對(duì)其下胚軸進(jìn)行基因表達(dá)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，JA 對(duì)下胚軸的木質(zhì)素含量具有積極作用，可通過(guò)JA 對(duì)下胚軸直徑的影響程度來(lái)反映其對(duì)次生生長(zhǎng)的影響，下胚軸直徑的增加會(huì)導(dǎo)致次生韌皮部纖維數(shù)量增多。同時(shí)，內(nèi)源激素的積累對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育也發(fā)揮著重要作用，Marc 等[40]選擇工業(yè)大麻4 個(gè)具有代表性的發(fā)育階段進(jìn)行了植物激素的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和定量分析，結(jié)果顯示，次生生長(zhǎng)開(kāi)始有植物激素(生長(zhǎng)素、JA 及細(xì)胞分裂素等)參與調(diào)控，尤其是JA，其含量在發(fā)育的15 d 達(dá)到峰值，而細(xì)胞分裂素則起到調(diào)節(jié)次生組織中木質(zhì)素沉積的作用，這些植物激素對(duì)細(xì)胞壁生物合成都至關(guān)重要。該研究結(jié)合生理與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果探究了大麻下胚軸從初級(jí)生長(zhǎng)向次級(jí)生長(zhǎng)過(guò)渡的分子機(jī)制，最終不僅證明了內(nèi)源激素密切參與次生生長(zhǎng)和細(xì)胞壁沉積，也證明了JA 和生長(zhǎng)素調(diào)節(jié)節(jié)間部分次級(jí)細(xì)胞壁相關(guān)基因表達(dá)。在此研究基礎(chǔ)上，Behr 等[43]通過(guò)對(duì)工業(yè)大麻莖節(jié)點(diǎn)3 個(gè)不同部位進(jìn)行RT－PCR 分析，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻節(jié)點(diǎn)處存在從纖維伸長(zhǎng)到纖維增厚的轉(zhuǎn)變，還發(fā)現(xiàn)了與細(xì)胞壁沉積相關(guān)的基因(如CesA6、FLA2和FLA6)，同時(shí)在節(jié)點(diǎn)內(nèi)、外部存在差異表達(dá)如:NST1 調(diào)節(jié)纖維分化因子，MYB46－1作為參與細(xì)胞壁生物合成和木聚糖生物合成的轉(zhuǎn)錄因子在節(jié)點(diǎn)內(nèi)部高表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞壁沉積的FLA3和WAT1在外部組織中高表達(dá)，因此，可推測(cè)工業(yè)大麻不同部位在纖維發(fā)育過(guò)程中存在生理和分子水平上的差異。同時(shí)，Van 等[44]利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)兩個(gè)不同品種的工業(yè)大麻Chameleon 和Felina 34 在不同發(fā)育階段的不同組織進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)其差異基因木質(zhì)素生物合成基因(THF)和甲基化循環(huán)編碼酶(CCoAOMT、COMT)在稈芯組織中高表達(dá)，并調(diào)控木質(zhì)素的合成，同時(shí)在工業(yè)大麻伸長(zhǎng)期的莖韌皮組織中，也發(fā)現(xiàn)了與苯丙素生物合成和次級(jí)細(xì)胞壁纖維素合成酶相關(guān)的基因顯著表達(dá)[39]。這些研究為逐步揭示工業(yè)大麻纖維發(fā)育的轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)理、挖掘功能性基因以及生物合成代謝途徑提供了重要信息。

2.2.2 工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量品質(zhì)轉(zhuǎn)錄組研究

工業(yè)大麻纖維產(chǎn)量的差異是內(nèi)因(基因型、生理)和外因(環(huán)境、農(nóng)藝措施)共同作用的結(jié)果。品種的產(chǎn)量和品質(zhì)差異是不同環(huán)境和栽培手段的最終體現(xiàn)[45－46]。關(guān)于不同品種纖維產(chǎn)量和品質(zhì)差異，Musio 等[47]將傳統(tǒng)的綠莖品種與黃莖品種在兩個(gè)收獲時(shí)期(花期和工藝成熟期)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黃莖品種的纖維提取效率均比綠莖品種的高，該研究為挑選高纖維工業(yè)大麻品種提供了思路。即使在相同生長(zhǎng)環(huán)境下，品種間的產(chǎn)量也被證實(shí)存在明顯差異[48－49]。因此提高纖維產(chǎn)量，選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的品種，并探索和規(guī)范高效配套種植技術(shù)至關(guān)重要。

工業(yè)大麻纖維發(fā)育可分為3 個(gè)階段:發(fā)育起始階段、伸長(zhǎng)階段、細(xì)胞壁增厚階段，經(jīng)過(guò)這3 個(gè)階段逐步過(guò)渡可實(shí)現(xiàn)工業(yè)大麻從產(chǎn)量到品質(zhì)的轉(zhuǎn)變[39]。Koziel 等[50]利用RNA－Seq 對(duì)工業(yè)大麻韌皮纖維木質(zhì)化及次生壁發(fā)育進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)大麻纖維轉(zhuǎn)變的最佳靶基因是咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ(COMT2)、阿魏酸5 羥基化酶(F5H)和β－D 半乳糖苷酶(BGAL)。也有研究者利用RNA－Seq 和全基因組關(guān)聯(lián)分析協(xié)同對(duì)123 份大麻材料的纖維品質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行遺傳分析，對(duì)不同纖維品質(zhì)性狀的16 個(gè)QTL 進(jìn)行定位(葡萄糖、木質(zhì)素、韌皮纖維含量等)，推測(cè)這些物質(zhì)對(duì)纖維品質(zhì)起著重要作用[51]。上述研究挖掘出纖維產(chǎn)量及品質(zhì)相關(guān)基因及生物代謝途徑，除遺傳因素外，有研究表明，工業(yè)大麻性別可影響其纖維產(chǎn)量和品質(zhì)[52]，工業(yè)大麻多為雌雄異株，而雄麻纖維品質(zhì)優(yōu)于雌麻，因此，Prentout 等[53]采用概率性方法SEX－DETector 對(duì)工業(yè)大麻所有基因進(jìn)行分離和分析，鑒定出約500 多個(gè)與性別連鎖的基因，再通過(guò)RNA－Seq 技術(shù)將這些基因映射，組裝獲得了大麻性染色體，從而了解了工業(yè)大麻性染色體系統(tǒng)。作為迄今為止記載最為久遠(yuǎn)的植物性染色體系統(tǒng)，推測(cè)其具有很大及高度分散的非重組區(qū)域，該研究通過(guò)了解工業(yè)大麻性染色體系統(tǒng)，相當(dāng)于了解了其基因組信息。

通過(guò)上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)I(yè)大麻纖維發(fā)育及產(chǎn)量品質(zhì)進(jìn)行研究，挖掘出許多相關(guān)基因(表1)。在工業(yè)大麻下胚軸次生生長(zhǎng)過(guò)程中，也有研究者利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了與韌皮纖維伸長(zhǎng)相關(guān)的XTH基因(如XTH5 和XTH8)[54－58]和轉(zhuǎn)錄因子NST1、MYB46和WLIM1，參與纖維素生物合成的COBRA家族[7](COB和COBL4基因)，以及次生細(xì)胞壁纖維素合成酶基因(CesA4、CesA7和CesA8)[42－45]。

表1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出的部分已知工業(yè)大麻基因Table 1 Some Cannabis stiva L genes screened by transcriptome sequencing

3 工業(yè)大麻非生物脅迫轉(zhuǎn)錄組研究

3.1 鹽脅迫

鹽害是一種常見(jiàn)的非生物脅迫，土壤鹽分過(guò)多會(huì)破壞土壤溶液滲透壓平衡，抑制植株細(xì)胞呼吸等生命活動(dòng)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致植株死亡。我國(guó)鹽堿地逐年增長(zhǎng)且分布范圍逐漸擴(kuò)大，隨著我國(guó)人口增加和耕地不足矛盾日益凸顯，篩選抗性品種、加強(qiáng)鹽堿地利用以及開(kāi)展邊際土壤改良是今后農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要方向，開(kāi)展工業(yè)大麻耐鹽堿性研究、培育耐鹽品種具有重要應(yīng)用價(jià)值。工業(yè)大麻不同品種和不同生育期對(duì)鹽的敏感程度不同，在重度鹽環(huán)境下不能生長(zhǎng)[59]。蘇文君等[60]首次利用7 個(gè)工業(yè)大麻品種通過(guò)水培法對(duì)其萌發(fā)期和幼苗期進(jìn)行NaCl脅迫研究，篩選不同條件下大麻幼苗期耐鹽性評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合比較品種的耐鹽性發(fā)現(xiàn):皖麻1 號(hào)耐鹽性最強(qiáng)，巴馬火麻耐鹽性最弱，并且篩選出株高、莖粗、鮮重和干重等6 個(gè)衡量耐鹽性指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，另有研究者[61]以不同濃度NaCl 水溶液模擬鹽脅迫，對(duì)上述7 個(gè)工業(yè)大麻品種在萌發(fā)期和苗期的耐鹽性進(jìn)行對(duì)比研究:140 mmol/L NaCl 是大麻品種進(jìn)行耐鹽性鑒定的適宜濃度，且不同大麻品種在不同發(fā)育時(shí)期的耐鹽性存在較大差異，如在萌發(fā)期，晉麻1 號(hào)是耐鹽品種，巴馬火麻是不耐鹽品種，而在苗期，晉麻1 號(hào)是不耐鹽品種，巴馬火麻是耐鹽品種，研究者推測(cè)可能是大麻品種在不同時(shí)期具有不同耐鹽機(jī)理，萌發(fā)階段更多是通過(guò)抵抗?jié)B透脅迫來(lái)維持生長(zhǎng)發(fā)育，而苗期則是啟動(dòng)抵抗離子毒害程序。為了解工業(yè)大麻不同品種耐鹽性相關(guān)基因，劉家佳等[62]利用500 mmol/L NaCl 對(duì)2 個(gè)工業(yè)大麻品種植株葉片分別處理0、2、4、6 d，結(jié)合生理指標(biāo)測(cè)定及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2 種大麻生理反應(yīng)在脅迫2 d 時(shí)最激烈，并在2 個(gè)大麻品種中鑒定出都顯著上調(diào)的與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(MYB、NAC、GATA和HSF)。目前，NAC 轉(zhuǎn)錄因子已被大量證實(shí)響應(yīng)植物鹽脅迫，胡華冉等[63]基于劉家佳的研究基礎(chǔ)，篩選出4 個(gè)鹽脅迫應(yīng)答基因(CsNAC1、CsNAC2、CsGDH2和CsNAC3)。植株根部會(huì)采取不同的耐鹽策略響應(yīng)鹽堿脅迫，Cao 等[64]以耐受型品種火麻一號(hào)根部組織為材料，利用RNA－Seq 開(kāi)展了NaHCO3脅迫下根部基因表達(dá)機(jī)制研究，發(fā)現(xiàn)在NaHCO3脅迫下植物可能通過(guò)調(diào)控激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與合成、苯丙素生物合成、淀粉、蔗糖、氮、氨基酸等代謝途徑響應(yīng)脅迫，并發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵通路的樞紐基因與GTP 結(jié)合蛋白、谷氨酸合成酶、海藻糖磷酸、糖基轉(zhuǎn)移酶和木質(zhì)素合成相關(guān)。該研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)與共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析聯(lián)合闡明了工業(yè)大麻對(duì)NaHCO3脅迫的分子響應(yīng)機(jī)制。此外也有研究者從蛋白質(zhì)組學(xué)角度，利用相對(duì)和絕對(duì)定量同位素標(biāo)記技術(shù)(iTRAO)開(kāi)展耐鹽性品種的鹽脅迫蛋白應(yīng)激機(jī)制研究，結(jié)果表明，耐鹽型工業(yè)大麻能夠通過(guò)提高能量代謝、調(diào)節(jié)光合代謝來(lái)促進(jìn)有機(jī)物的滲透及合成，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的進(jìn)出穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)平衡來(lái)適應(yīng)脅迫[58，65]。上述研究，轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相互呼應(yīng)，為下一步綜合解析組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行工業(yè)大麻鹽堿適應(yīng)機(jī)制研究提供了基礎(chǔ)參考。

3.2 干旱脅迫

水分作為植物的生命之源，也會(huì)對(duì)植物造成脅迫，可分為兩種情況，第一種是干旱脅迫，是指植物在缺水的環(huán)境中生長(zhǎng)，本質(zhì)是因缺水抑制植物光合作用等生長(zhǎng)發(fā)育活動(dòng)；第二種是淹水脅迫，則是由于水分過(guò)多從而抑制植物根部的細(xì)胞呼吸，降低光合速率，進(jìn)而干擾植物正常生長(zhǎng)。工業(yè)大麻干旱脅迫的研究更多采用不同生理指標(biāo)參數(shù)進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，從而篩選抗旱能力強(qiáng)的品種[66－69]。另外也有研究者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究外源物質(zhì)對(duì)干旱脅迫下工業(yè)大麻脅迫的應(yīng)答機(jī)制，如楊志晶等[70]采用盆栽稱(chēng)重控水法模擬干旱脅迫(50%基質(zhì)含水量)對(duì)“云麻1 號(hào)”進(jìn)行不同濃度的維生素C、甜菜堿、CaCl2和赤霉素處理，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析其抗旱生理響應(yīng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)外源物質(zhì)可通過(guò)調(diào)節(jié)大麻的葉綠素、脯氨酸和可溶性糖的含量來(lái)緩解干旱損傷。烯效唑(S3307)作為一種高效低毒的三唑類(lèi)植物生長(zhǎng)延緩劑，在植物抗逆和增產(chǎn)方面效果顯著，通過(guò)外源噴施S3307及干旱脅迫協(xié)同處理，姜穎等[67]通過(guò)對(duì)工業(yè)大麻品種漢麻2 號(hào)進(jìn)行RNA－Seq 分析發(fā)現(xiàn)，S3307通過(guò)調(diào)控植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光合作用、卟啉與葉綠素代謝等代謝通路中DEGs的表達(dá)來(lái)緩解干旱脅迫對(duì)工業(yè)大麻生長(zhǎng)發(fā)育的損害，同時(shí)鑒定出S3307誘導(dǎo)調(diào)控干旱脅迫的差異基因IINV、TREH、PYG(3)、GBE1(2)、TPS(7)和β－淀粉酶。此外，Gao 等[71]通過(guò)RNA－Seq 分析篩選出與工業(yè)大麻抗旱性有關(guān)的過(guò)氧化物酶、擴(kuò)展蛋白、肌醇加氧酶、NAC和B3的轉(zhuǎn)錄因子。上述研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)工業(yè)大麻外施S3307等外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可調(diào)控光合作用、葉綠素等代謝途徑，以此來(lái)提高工業(yè)大麻的干旱適應(yīng)能力。

3.3 重金屬脅迫

重金屬主要指汞、鎘、鉛、鉻、銅和鋅類(lèi)金屬砷等，重金屬對(duì)作物的影響從種子萌發(fā)階段開(kāi)始，而種子能否萌發(fā)和是否正常萌發(fā)是決定作物產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵[72]。李增強(qiáng)等[73]研究發(fā)現(xiàn)，紅麻幼苗通過(guò)調(diào)節(jié)自身生命活動(dòng)過(guò)程及代謝物來(lái)應(yīng)對(duì)鉛脅迫，該結(jié)果為研究分析麻類(lèi)作物應(yīng)對(duì)重金屬脅迫提供了重要參考信息。為了明確工業(yè)大麻在重金屬脅迫下的研究機(jī)理，黃玉敏[74]對(duì)鎘脅迫處理12 h 下的工業(yè)大麻“Yuma 1”(Ym)和“Neimengguxiaoli”(Nx)的根部組織進(jìn)行RNA－Seq 分析，發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫處理下，Ym 品種比Nx 品種耐鎘能力強(qiáng)，還發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫時(shí)，工業(yè)大麻會(huì)啟動(dòng)光合作用系統(tǒng)，并通過(guò)加快谷胱甘肽代謝等生物合成途徑來(lái)抵抗鎘毒害。在該研究基礎(chǔ)上，研究者在鎘處理?xiàng)l件下對(duì)兩個(gè)鎘耐受性不同的工業(yè)大麻進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)Ym 耐受品種比Nx 敏感品種具有更強(qiáng)的運(yùn)輸和累積能力，Ym 顯示了更強(qiáng)的解毒能力，同時(shí)通過(guò)RNA－Seq 分析也在兩個(gè)品種間鑒定出調(diào)控重金屬運(yùn)輸和氧化還原過(guò)程的且與鎘耐受相關(guān)的基因(WRKY、Myb和NAC轉(zhuǎn)錄因子)[75]。通過(guò)上述兩個(gè)研究可知，Ym 品種抗鎘性強(qiáng)，從基因水平揭示分子機(jī)制，挖掘抗鎘相關(guān)基因。同時(shí)，在探討緩解鎘脅迫對(duì)工業(yè)大麻影響技術(shù)方法方面，尹明[76]在有無(wú)原花青素的不同處理下協(xié)同鎘脅迫進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)外源原花青素與鎘離子會(huì)同時(shí)作用于EDS1 基因。因此推測(cè)該基因具有降低大部分植物激素相關(guān)基因表達(dá)量的功能，從而使植株利用原花青素與水楊酸，并通過(guò)光合作用、次級(jí)代謝物合成和抗氧化物質(zhì)合成等相關(guān)途徑來(lái)緩解鎘脅迫帶來(lái)的影響。

4 問(wèn)題與展望

工業(yè)大麻用途廣泛，而國(guó)內(nèi)工業(yè)大麻產(chǎn)業(yè)主要圍繞纖維和籽實(shí)開(kāi)展相關(guān)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，且采用的原料幾乎不含有THC，醫(yī)藥用途目前也僅利用CBD 成分[77]。隨著轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，研究者通過(guò)工業(yè)大麻的基因組序列和表達(dá)信息開(kāi)展調(diào)控關(guān)鍵性狀基因位點(diǎn)及代謝物合成途徑挖掘研究，將為解析調(diào)控優(yōu)異性狀分子機(jī)理奠定重要基礎(chǔ)[7]。然而相對(duì)其他麻類(lèi)作物，工業(yè)大麻轉(zhuǎn)錄組研究大多集中于纖維發(fā)育基因表達(dá)調(diào)控及活性成分合成途徑，對(duì)于影響纖維和籽實(shí)等產(chǎn)量性狀關(guān)鍵調(diào)控因子、抗逆作用機(jī)制的研究還有很大的空間，同時(shí)，隨著工業(yè)大麻藥用價(jià)值日益提升，圍繞CBN和大麻萜酚(Cannabigerol，CBG)等稀有成分的生物合成途徑研究也將成為重點(diǎn)。近兩年，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展快速[78]，并已開(kāi)始應(yīng)用到不同作物的研究中，接下來(lái)可以結(jié)合上述技術(shù)，彌補(bǔ)常規(guī)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)方法研究的不足，并通過(guò)多組學(xué)聯(lián)合、生物工程等不同分子生物學(xué)方法共同闡明工業(yè)大麻重要性狀的表達(dá)調(diào)控策略，挖掘功能基因及揭示其遺傳多樣性。