朱銘鈺崔利利陳歡侯宏衛(wèi)*胡清源*

(1. 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,煙草生物學(xué)效應(yīng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,鄭州 450000;2. 青島大學(xué),山東青島 266071)

神經(jīng)遞質(zhì)主要是指實(shí)現(xiàn)神經(jīng)化學(xué)傳遞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),促使機(jī)體完成特定生物反應(yīng)的化學(xué)物質(zhì)[1]。 神經(jīng)遞質(zhì)的新陳代謝和信號(hào)傳遞與維持大腦的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān),例如在大腦神經(jīng)元之間傳遞神經(jīng)信號(hào),維持神經(jīng)系統(tǒng)功能以及促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長和修復(fù)等。 神經(jīng)遞質(zhì)的失調(diào)會(huì)引起人體內(nèi)一系列疾病的發(fā)生,如精神分裂癥、帕金森氏癥、阿爾茨海默癥、癲癇和注意力缺陷多動(dòng)障礙等[2]。 自1921 年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者奧托·洛伊發(fā)現(xiàn)了第一個(gè)神經(jīng)遞質(zhì)——乙酰膽堿后,截至目前,已經(jīng)確定了100 多種神經(jīng)遞質(zhì)[3-4]。 根據(jù)其化學(xué)性質(zhì),可將腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)分為四大類:第一類為膽堿類,例如乙酰膽堿(ACh)等;第二類為單胺類,例如多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)和5-羥色胺(5-HT)等;第三類為氨基酸類,例如谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)等;第四類為神經(jīng)肽類,例如谷胱甘肽、阿片肽等。 其中,多巴胺作為最受關(guān)注的神經(jīng)遞質(zhì),在人體的生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用,與帕金森癥和阿爾茨海默癥密切相關(guān)。 乙酰膽堿和5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)也在學(xué)習(xí)、記憶和情緒中起到重要作用。

神經(jīng)遞質(zhì)之間存在著復(fù)雜的相互作用,協(xié)同調(diào)控人類神經(jīng)性疾病。 然而,由于內(nèi)源性成分的干擾以及神經(jīng)遞質(zhì)含量不斷更新變化和代謝,導(dǎo)致一些傳統(tǒng)的微透析法、電化學(xué)和熒光成像等檢測(cè)方法很難實(shí)現(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的精準(zhǔn)檢測(cè),神經(jīng)遞質(zhì)高時(shí)空分辨率的可視化檢測(cè)也成為神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)分析的難點(diǎn)[5]。 近年來,研究者們?yōu)榱司_檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,不斷地對(duì)微透析、電化學(xué)和熒光成像等方法進(jìn)行改進(jìn),開發(fā)出了一系列快速、靈敏、高效、同時(shí)檢測(cè)多種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方法,以期了解神經(jīng)遞質(zhì)在上述疾病中的作用機(jī)理,為新藥物的開發(fā)提供技術(shù)支撐[6]。 如圖1 所示,本文對(duì)微透析法、電化學(xué)法以及熒光成像這三類常用的神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行詳細(xì)的介紹,方便研究者根據(jù)需求選擇合適的研究方法。

圖1 三種神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的匯總圖Figure 1 Summary diagram of three neurotransmitter detection techniques

1 微透析法

微透析法(Microdialysis)是目前應(yīng)用最廣泛的采集體內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的方法之一,常與高效液相色譜-質(zhì)譜儀等設(shè)備聯(lián)用[7]。 微透析法作為一種侵入性的采樣技術(shù),其對(duì)測(cè)試組織的損傷相對(duì)較小,可以在不過度干擾研究環(huán)境的情況下對(duì)腦脊液樣品進(jìn)行收集。 早在1966 年,Bito 等[8]就首次提出了通過透析從大腦間質(zhì)液體中收集分析物的概念。 目前,微透析法已經(jīng)應(yīng)用于大腦疾病的研究中,對(duì)于診斷腦類疾病的潛在原因以及治療具有很大的意義。

微透析針被設(shè)計(jì)為穿過組織的“毛細(xì)血管”,由軸、殼體、入口管和出口管四部分組成。 入口管與灌注系統(tǒng)相連,通過探頭輸送灌注液(通常是人工腦脊液或林格氏溶液),以匹配腦間質(zhì)液的電解質(zhì)濃度[9]。 微透析過程中一般采用較低的流速收集透析液,以減少溶質(zhì)的非特異性消耗,并維持較高的相對(duì)回收率[10]。 但這也使得微透析時(shí)間分辨率降低,不利于將神經(jīng)遞質(zhì)濃度的改變與動(dòng)物特定行為聯(lián)系起來[11]。 細(xì)胞外流體中的溶液和小分子通過半透膜擴(kuò)散到內(nèi)部透析液中,然后被收集,如圖2所示。 微透析膜可以將組織結(jié)構(gòu)和灌流相關(guān)的流體動(dòng)力隔離開來,因此微透析探針植入后對(duì)組織損傷或流體動(dòng)力學(xué)破壞相對(duì)較少[12]。

圖2 微透析針結(jié)構(gòu)及微透析膜工作原理Note. After the microdialysis needle is placed in the tissue to be tested, the artificial cerebrospinal fluid is pumped into the internal pipeline through the inlet tube at a certain flow rate through the syringe pump. The semi-permeable membrane enters the probe and is continuously brought out by the continuous flow of artificial cerebrospinal fluid to realize the exchange of artificial cerebrospinal fluid and cerebrospinal fluid in the brain. Green transparent circles represent Na+, K+, Ca2 + and Mg2 +, etc.. Pink triangles represent amino acids, monoamine neurotransmitters,etc. Yellow circles represent proteins, polypeptides, etc.Figure 2 Microdialysis needle structure and microdialysis membrane working principle

透析針的大小、膜的表面積、分析物擴(kuò)散系數(shù)以及透析液收集的速度都會(huì)使得微透析技術(shù)受到時(shí)間和空間分辨低的限制[13]。 為了提高微透析采樣技術(shù)在時(shí)間和空間上的分辨率,Ngernsutivorakul等[14]將微制造的推拉式采樣針和微流控芯片相結(jié)合,通過直接進(jìn)樣到質(zhì)譜分析所得液滴,同時(shí)測(cè)定了谷氨酰胺、谷氨酸、γ-氨基丁酸和乙酰膽堿,在100 nL/min 灌注速率下產(chǎn)生6 s 時(shí)間分辨率。 這種推拉式采樣針提供的空間分辨率約是普通微透析探針的1000 倍。

1.1 微透析法與檢測(cè)器聯(lián)用

現(xiàn)如今有多種分析技術(shù)可定量微透析樣本中的神經(jīng)遞質(zhì)含量。 如前所述,在監(jiān)測(cè)腦介質(zhì)中神經(jīng)遞質(zhì)的濃度時(shí),時(shí)間分辨率至關(guān)重要。 微透析收集完樣本后可以通過液體旋轉(zhuǎn)器和注射閥與高效液相色譜儀進(jìn)行在線連接將不同的神經(jīng)遞質(zhì)分離出來,然后通過質(zhì)譜儀、熒光檢測(cè)器或電化學(xué)檢測(cè)器等對(duì)腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)的含量進(jìn)行分析。 透析樣品也可以冷凍存儲(chǔ),然后在不同的時(shí)間點(diǎn)通過高效液相色譜儀或氣相色譜儀器等進(jìn)行“離線” 分析[15]。 在線微透析雖然能最大限度地降低離線微透析過程中發(fā)生的樣本丟失或降解的可能性,但是在線微透析的時(shí)間分辨率不僅受樣品采集所需時(shí)間的限制,還受化學(xué)分析所需時(shí)間的限制[16]。

1.1.1 微透析法與液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用

液相色譜-質(zhì)譜法是現(xiàn)在應(yīng)用較為廣泛的定量分析方法,液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)不僅克服了液相色譜本身定性能力差的問題,也克服了質(zhì)譜法分離效率差的問題,極大地提高了分析的靈敏度。 液相色譜-質(zhì)譜法與其他檢測(cè)方法相比檢測(cè)物質(zhì)種類的范圍更廣,該技術(shù)以其優(yōu)異的靈敏度、選擇性和準(zhǔn)確性在神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)中占據(jù)著重要地位。 但是一些神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)質(zhì)譜的響應(yīng)信號(hào)較弱,且生物透析液中基質(zhì)復(fù)雜,這就需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜的前處理(如衍生化等)。 Wong 等[17]將微透析法與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合,利用苯甲酰氯對(duì)包括兒茶酚胺、吲哚胺以及氨基酸等在內(nèi)的70 種神經(jīng)相關(guān)化合物進(jìn)行標(biāo)記,在33 min 內(nèi)完成了對(duì)70 種化合物的分離。 大多數(shù)分析化合物的檢測(cè)極限低于10 nmol/L,檢出限在0.02 ~ 8.00 nmol/L 的范圍內(nèi),相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。 該方法在分析大鼠腦脊液、人腦脊液和血清等微透析液時(shí)能穩(wěn)定地進(jìn)行監(jiān)測(cè),證明了該方法在多種生理環(huán)境和模型系統(tǒng)中具有廣泛的實(shí)用性。 Meng 等[18]將液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和化學(xué)衍生化法相結(jié)合,對(duì)大鼠血清中包括神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸以及生物胺等在內(nèi)的42 種極性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè),在15 min 內(nèi)完成了對(duì)42 種神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的分離。 該方法的檢測(cè)限在0.05 ~ 11.63 nmol/L,定量下限為0.09 ~46.50 nmol/L。

隨著近幾年色譜柱的不斷發(fā)展,使人們?cè)谝欢ǔ潭壬媳苊饬朔爆嵉臉悠非疤幚磉^程。 Fu 等[19]將體內(nèi)微透析和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法相結(jié)合,同時(shí)測(cè)定干細(xì)胞因子中木脂素和內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)等19 種物質(zhì),定量限為0.5 ~ 20.0 ng/mL。 該方法觀察和比較木脂素在正常大鼠和阿爾茨海默氏癥大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)差異以及對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的影響。Becker 等[20]通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏地同時(shí)定量小鼠微透析液中多巴胺、乙酰膽堿以及5-羥色胺在內(nèi)的16 種神經(jīng)遞質(zhì),該方法檢出限為0.005 ~17.100 ng/mL,定量限為0.015 ~ 50.000 ng/mL。潘凌云等[21]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定大鼠腦微透析樣品中11 種神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿、谷氨酸、甘氨酸和去甲腎上腺素等),該方法在5 min 內(nèi)對(duì)11 種神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行測(cè)量,檢出限為0.05 ~ 2.50 nmol/L,定量限為0.125 ~ 12.500 nmol/L。 為研究健康和疾病動(dòng)物模型中神經(jīng)遞質(zhì)的變化提供了高效的檢測(cè)方法。 Helmschrodt 等[22]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)小鼠腦透析液中5 種神經(jīng)遞質(zhì)(多巴胺、5-羥色胺、去甲腎上腺素、乙酰膽堿和γ-氨基丁酸)及其代謝物共11 種物質(zhì)進(jìn)行定量,該方法的檢出限在0.005 ~ 0.750 ng/mL,定量限在0.025 ~ 2.000 ng/mL,該方法首次能夠在一個(gè)樣品中同時(shí)定量膽堿、乙酰膽堿和γ-氨基丁酸,以及多巴胺和5-羥色胺代謝的代謝物。

1.1.2 微透析法與液相色譜-熒光檢測(cè)器聯(lián)用

液相色譜-熒光檢測(cè)法在一定程度上解決了液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法的一些缺點(diǎn),因其具有更高的穩(wěn)定性、更高的可靠性和易操作性。 但對(duì)于一些單胺類的神經(jīng)遞質(zhì),不具有吸收強(qiáng)熒光的官能團(tuán)。 因此,通常需要在柱前或柱后進(jìn)行額外的衍生化步驟,來提高檢測(cè)的靈敏度。 ?anl?等[23]將微透析和液相色譜-熒光檢測(cè)法相結(jié)合,通過利用3-(4-羧基苯甲?；?-2-喹啉甲醛對(duì)大小鼠脊髓組織中的4 種神經(jīng)遞質(zhì)(谷氨酸、甘氨酸、?；撬嵋约唉?氨基丁酸)進(jìn)行衍生化,開發(fā)出了一種快速,靈敏的神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)方法。 該方法樣品制備步驟簡單,在最佳條件下,4 種分析物在0.50 ~ 50.00 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)呈線性,檢測(cè)限和定量限的范圍分別為0.03 ~0.06 μmol/L 和0.095 ~ 0.179 μmol/L。 鄧祖躍等[24]開發(fā)了一種分離度高且穩(wěn)定性好的液相色譜-熒光檢測(cè)法,對(duì)大鼠不同的6 個(gè)腦區(qū)中的去甲腎上腺素、多巴胺和5-羥色胺及其代謝物共7 種物質(zhì)進(jìn)行定量。 該方法在0.9 ~ 400.0 μg/L 的濃度范圍內(nèi)線性范圍良好,檢測(cè)限的范圍為0.3 ~ 8.0 μg/L,證實(shí)了腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在不同腦區(qū)分布的差異。 昝富文等[25]通過高效液相色譜-熒光檢測(cè)法研究小鼠隨百草枯中毒時(shí)間變化腦組織中8 種神經(jīng)遞質(zhì)(多巴胺、左旋多巴、高香草酸、腎上腺素、去甲腎上腺素、二羥基苯乙酸、5-羥色胺和5-羥吲哚乙酸)的含量變化。 該方法的靈敏度高、選擇性好、操作簡便,檢出限的范圍為0.34 ~ 5.26 μg/L。

1.1.3 微透析法與液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用

液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法與液相色譜-質(zhì)譜法相比,具有較高的靈敏度和選擇性,操作相對(duì)比較簡單。 且大多數(shù)神經(jīng)遞質(zhì)是電活性化合物,液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法在檢測(cè)具有電活性的神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)不需要進(jìn)行衍生化處理,這也避免了液相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-熒光檢測(cè)法在樣品檢測(cè)前復(fù)雜的前處理過程。 液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法雖然具有較高的靈敏度和選擇性,但與液相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-熒光檢測(cè)法相比神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)種類相對(duì)較少,加上電極變質(zhì)等局限性,導(dǎo)致液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)法在重現(xiàn)性上相對(duì)較差。 van Schoors 等[26]開發(fā)了一種快速靈敏的微孔超高效液相色譜法,通過與電化學(xué)檢測(cè)相結(jié)合同時(shí)測(cè)定大鼠腦微透析樣品中的多巴胺、去甲腎上腺素和5-羥色胺。 該方法測(cè)得去甲腎上腺素的定量下限為100 pmol/L,多巴胺和5-羥色胺的定量下限為150 pmol/L。 徐妍等[27]將微透析技術(shù)與高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合對(duì)大鼠紋狀體部位腦脊液中所含的多巴胺、3,4-二羥基苯乙酸、高香草酸、5-羥色胺以及5-羥吲哚乙酸的含量進(jìn)行測(cè)量。 該方法的線性范圍為0.2~ 500.0 ng/mL,日內(nèi)和日間精密度(1 d)均不大于9.7%,檢出限為0.1 ~ 0.2 ng/mL。 該方法具有較高的靈敏度和良好的選擇性,對(duì)于在線、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)藥物作用下活體動(dòng)物腦脊液中神經(jīng)遞質(zhì)變化具有重要意義。 劉斌等[28]采用微透析和高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器聯(lián)用的方法,測(cè)定了大鼠右側(cè)下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)中5-羥色胺,多巴胺以及去甲腎上腺素在1 d 內(nèi)的變化趨勢(shì),實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)朱砂安神丸引起的單胺神經(jīng)遞質(zhì)的變化效應(yīng)以及對(duì)睡眠的影響。該方法線性范圍為3.125 ~ 50.000 pg/mL,日內(nèi)和日間精密度均小于3.6%。 結(jié)果表明,朱砂安神丸抑制下丘腦腹外側(cè)視前區(qū)接受5-羥色胺和去甲腎上腺素,從而起到安神助眠的作用。

1.1.4 微透析法與氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用

另一種和微透析相結(jié)合用于測(cè)定神經(jīng)遞質(zhì)的技術(shù)是氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)。 盡管在對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方面,通常首選微透析與液相色譜-質(zhì)譜法相結(jié)合,但是氣相色譜-質(zhì)譜法在對(duì)一些神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)方面具有出色的特異性和選擇性。Farthing 等[29]建立了一種快速、選擇性的氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定小鼠腦組織中γ-氨基丁酸和谷氨酸。 由于GC 需要揮發(fā)性化合物,因此在加熱的GC 進(jìn)樣口在線對(duì)γ-氨基丁酸和谷氨酸進(jìn)行衍生化,以獲得揮發(fā)性更強(qiáng)、反應(yīng)活性更低的化合物[30]。該方法在0.5 ~ 100.0 μg/mL 的范圍內(nèi)呈線性,γ-氨基丁酸和谷氨酸的檢出限分別為250 ng/mL 和100 ng/mL。 因此,根據(jù)所使用的神經(jīng)遞質(zhì)分離技術(shù)和檢測(cè)器的不同,微透析具有不同的靈敏度和選擇性,如表1 所示。

表1 與微透析聯(lián)用的不同檢測(cè)器之間的比較Table 1 Comparison between different detectors for use with microdialysis

2 電化學(xué)傳感器法

除了微透析法外,基于氧化還原反應(yīng)原理的電化學(xué)檢測(cè)方法近年也逐步發(fā)展起來,如圖3 所示。自1973 年Kissinger 等[31]首次使用伏安法后,伏安法已經(jīng)發(fā)展成為以亞秒精度進(jìn)行體內(nèi)神經(jīng)化學(xué)監(jiān)測(cè)的唯一可行技術(shù)。 目前,包括循環(huán)伏安法(CV)、差示脈沖伏安法(DPV)和快速掃描循環(huán)伏安法(FSCV)在內(nèi)的許多伏安技術(shù)已被應(yīng)用到神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的測(cè)量中[32-33]。 然而CV 僅限于體外應(yīng)用和檢測(cè)高濃度的神經(jīng)遞質(zhì),且時(shí)間分辨率較低。 DPV 雖然可以用單個(gè)探針同時(shí)檢測(cè)多個(gè)分析物,但仍不足以捕捉神經(jīng)遞質(zhì)的亞秒變化。 而FSCV 能夠以高時(shí)間分辨率在體內(nèi)外快速檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)[34]。 接下來,本文詳細(xì)綜述了FSCV 的基本原理、發(fā)展以及該方法在神經(jīng)傳遞研究中的應(yīng)用進(jìn)展。

FSCV 常被用來測(cè)量清醒和有行為的動(dòng)物大腦中的多巴胺,解決生物醫(yī)學(xué)中神經(jīng)遞質(zhì)局部濃度低、測(cè)量難的問題[35]。 FSCV 以高掃描速度將三角形波形應(yīng)用于微電極,進(jìn)而快速氧化和還原電極表面的電活性物質(zhì),微電極的小尺寸(直徑5 ~ 20 μm)使其比微透析探針更能接近要檢測(cè)的釋放部位[36]。 近幾年隨著人們對(duì)電極的不斷開發(fā),FSCV可以與多電極陣列聯(lián)用實(shí)現(xiàn)各種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)。Castagnola 等[37]利用玻碳微電極陣列對(duì)大鼠紋狀體中多巴胺和5-羥色胺進(jìn)行定量。 該方法具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性,多巴胺和5-羥色胺的檢測(cè)范圍為10 ~ 200 nmol/L。 然而FSCV 所使用的傳統(tǒng)的三角形波形在檢測(cè)DA 和NE 時(shí)會(huì)產(chǎn)生類似的伏安圖,難以區(qū)分這兩種分析物的變化,分子特異性較差[38]。

FSCV 主要通過對(duì)電極進(jìn)行修飾或改變電流波形來提高其化學(xué)選擇性。 在電極方面,電極涂層可以防止具有相似氧化還原曲線的分析物吸附到電極表面,避免電極對(duì)非特異性分子的吸附,從而提高化學(xué)選擇性[39]。 例如,Nafion 涂層電極已成功用于5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)的檢測(cè)且防止碳纖維電極結(jié)垢,解決了5-羥色胺干擾降低記錄特異性和保真度等問題[40]。 Taylor 等[41]在3,4-乙烯二氧噻吩的基礎(chǔ)上開發(fā)出一種納米復(fù)合涂層,使得碳纖維電極檢測(cè)多巴胺的靈敏度提高了大約422 倍,檢測(cè)范圍為191 ~ 223 nmol/L。 Puthongkham 等[42]將納米金剛石懸浮液滴鑄到碳纖維微電極上,發(fā)現(xiàn)納米金剛石能夠顯著提高FSCV 對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的靈敏度,同時(shí)還能夠降低碳纖維電極在電化學(xué)和生物上的污損程度。 該方法在檢測(cè)多巴胺時(shí)表現(xiàn)尤為明顯,靈敏度提高了1.9 ~ 2.3 倍,檢出限提高至2 ~4 nmol/L。 而Bennet 等[43]首次將鉆石電極記錄應(yīng)用于人類,開發(fā)出了摻硼鉆石電極。 該電極的靈敏度與碳纖維電極相當(dāng),但物理強(qiáng)度要比碳纖維電極高出200 倍左右,在體外的使用壽命更長。 在電流波形方面,通過改變波形的電勢(shì)極限、掃描速率和應(yīng)用頻率來提高FSCV 對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)的靈敏度、選擇性和時(shí)間分辨率等各種性能,該方法性價(jià)比高、操作簡單[44]。 FSCV 的標(biāo)準(zhǔn)波形是類似CV 的三角形,若使用其他形狀的定制波形,可以實(shí)現(xiàn)特定化合物的檢測(cè)[45]。 Jo 等[46]將三角形波形和矩形波形相結(jié)合,利用0.1、0.2 和0.3 V 正常脈沖伏安法和FSCV 交替進(jìn)行對(duì)大鼠紋狀體中的多巴胺和去甲腎上腺素進(jìn)行區(qū)分,在0.1 V 時(shí)去甲腎上腺素和多巴胺這種區(qū)分最為明顯。 Ross 等[47]開發(fā)了一種類似梯形的波形,能夠選擇性地檢測(cè)腺苷、過氧化氫和ATP。 該波形與傳統(tǒng)波形相比有著更低的檢測(cè)限,并且能夠提高在高掃描速率下電極的穩(wěn)定性。 Park 等[48]將循環(huán)方波伏安法和背景減除相結(jié)合開發(fā)出快速循環(huán)方波伏安法(FCSWV),該方法極大地提高了對(duì)DA 檢測(cè)的靈敏度。 當(dāng)DA 濃度為0.5 ~ 2 μmol/L 時(shí),FCSWV 的檢測(cè)極限為5 ~ 9 nmol/L,而相同情況下FSCV 檢測(cè)極限為11 ~ 37 nmol/L。 除靈敏度增加外,與常規(guī)FSCV 比,FCSWV能更好地區(qū)分大鼠紋狀體中多巴胺與其他的神經(jīng)遞質(zhì)。 隨著交替波形開發(fā)(傳統(tǒng)三角形波形之外)以及專用探針的不斷進(jìn)步,FSCV 可實(shí)現(xiàn)同時(shí)、多重檢測(cè)不同的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)[49]。 隨著對(duì)FSCV 不斷地了解和開發(fā),相信定能解決現(xiàn)代神經(jīng)遞質(zhì)研究中所面臨的一系列問題。

3 熒光傳感器法

熒光檢測(cè)是一種高特異性、高時(shí)空分辨率和良好的生物相容性的蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)需引入熒光素基團(tuán)對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記,通過檢測(cè)和分析熒光信號(hào)的強(qiáng)度,完成對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的監(jiān)測(cè)。 根據(jù)此原理,本文詳細(xì)綜述兩類較為成熟的實(shí)時(shí)可視化監(jiān)測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)的熒光傳感器[50]。

3.1 基于FRET 的蛋白質(zhì)傳感器

熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (fluorescence resonance energy transfer,FRET)是激發(fā)態(tài)的供體熒光團(tuán)通過偶極間的相互作用將其激發(fā)能以非輻射方式傳遞給受體熒光團(tuán),從而導(dǎo)致受體熒光團(tuán)發(fā)光的技術(shù),如圖4A[51]。 自1948 年發(fā)現(xiàn)以來,FRET 已經(jīng)發(fā)展成為檢測(cè)分子之間,尤其是蛋白質(zhì)之間相互作用的強(qiáng)大工具,為生物醫(yī)學(xué)研究的廣泛領(lǐng)域開辟了新的可能性[52]。 Okumoto 等[53]利用能夠與神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合的細(xì)菌周質(zhì)結(jié)合蛋白(PBPs)作為傳感器支架,將來自大腸桿菌的谷氨酸/天冬氨酸結(jié)合蛋白ybeJ(也稱GltI)與綠色熒光蛋白的兩個(gè)變體融合,研發(fā)出初代Glu 熒光指示蛋白(FLIPE),對(duì)谷氨酸的親和力約為600 nmol/L,時(shí)間分辨率約為1 ms,如圖4B。 Masharina 等[54]基于FRET 技術(shù),將SNAP-tag、CLIP-tag 和目標(biāo)分析物的受體蛋白(RP)組成融合蛋白,研發(fā)出半合成熒光傳感器蛋白(Snifit)。 該傳感器以高特異性和高時(shí)間分辨率在哺乳動(dòng)物活細(xì)胞表面檢測(cè)γ-氨基丁酸,γ-氨基丁酸的檢測(cè)濃度在微摩爾至毫摩爾的范圍內(nèi),時(shí)間分辨率在1 ~ 10 s的范圍內(nèi),在研究生物系統(tǒng)中γ-氨基丁酸的作用發(fā)揮著重要的價(jià)值。

圖4 FRET 基本原理與基于FRET 原理的谷氨酸傳感器Note. A. The basic principle of FRET. Donor fluorophore in the excited state transfers its excitation energy to the acceptor fluorophore in a nonradiative manner through the interaction between dipoles, thereby causing the acceptor fluorophore to emit light. B. Based on the principle of FRET Schematic diagram of the glutamate sensor. First glutamate sensor was designed by fusing GltI from Escherichia coli with a FRET pair consisting of cyan fluorescent protein (CFP) and yellow fluorescent protein (YFP). GlTI is the molecular recognition domain of the sensor. When it binds to glutamate, its conformation changes, causing YFP and CFP to move away from each other, and the FRET efficiency decreases.Figure 4 Basic principle of FRET and glutamate sensor based on FRET principle

由于多巴胺和去甲腎上腺素結(jié)構(gòu)上的相似性,在電化學(xué)傳感器等檢測(cè)方法中這兩種神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)信號(hào)也較為相近。 而之后開發(fā)的一系列基于細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)熒光工程報(bào)告程序(CNiFERs),不僅能分別通過D2 受體、α1A 受體和M1 受體,完成對(duì)多巴胺、去甲腎上腺素以及乙酰膽堿的選擇性檢測(cè),而且能精確定位所檢測(cè)的位置和時(shí)間,時(shí)間分辨率在1 ~ 10 s 的范圍內(nèi)[55-56]。 與FLIPE 和Snifit系統(tǒng)相比,CNiFER 系統(tǒng)已經(jīng)在體內(nèi)得到了廣泛的表征。 Muller 等[57]將CNiFERs 注射到小鼠的前額葉皮質(zhì),使用雙光子顯微鏡測(cè)量條件反射過程中神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。 在該方法中,D2 CNiFER 對(duì)多巴胺表現(xiàn)出納摩爾級(jí)別的靈敏度,而去甲腎上腺素的靈敏度比多巴胺低了30 倍左右,多巴胺的檢測(cè)濃度為2.4 ~ 2.6 nmol/L,而去甲腎上腺素的檢測(cè)濃度為73 ~ 89 nmol/L。 同樣,α1A CNiFER 對(duì)去甲腎上腺素表現(xiàn)出納摩爾級(jí)別的靈敏度,去甲腎上腺素的檢測(cè)濃度為18 ~ 20 nmol/L,而多巴胺的檢測(cè)濃度為1.3 ~ 1.5 μmol/L。 雖然CNiFER 不能分辨單個(gè)突觸的神經(jīng)傳遞,但仍然是體內(nèi)監(jiān)測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)最有特色的方法之一。

Marvin 等[58]將循環(huán)重排綠色熒光蛋白(circular permutated enhanced green fluorescenr protein,cpEGFP)插入到GltI 中開發(fā)出了iGluSnFR,增強(qiáng)了與Glu 結(jié)合時(shí)的熒光信號(hào),并在神經(jīng)元、視網(wǎng)膜、蠕蟲、斑馬魚以及小鼠中都能長期穩(wěn)定的成像。 與CNiFERs 相比,iGluSnFR 可以快速直接進(jìn)入突觸間隙,有著更適合于體內(nèi)成像的信噪比和動(dòng)力學(xué),其對(duì)谷氨酸的親和力在98 ~ 116 μmol/L 的范圍內(nèi),時(shí)間分辨率在約為5 ms 的范圍內(nèi),檢測(cè)范圍為1 ~ 10 mmol/L。 Marvin 等[59]用環(huán)重排超折疊綠色熒光蛋白(circularly permuted superfolder green fluorescent protein, cpSFGFP ) 取代了原來的cpEGFP,開發(fā)出了SF-iGluSnFR。 雖然SF-iGluSnFR的動(dòng)力學(xué)與最初的iGluSnFR 相比要慢,但SFiGluSnFR 具有更高的親和力和靈敏度,比iGluSnFR更適用于監(jiān)測(cè)突觸中谷氨酸的快速釋放[60]。Helassa 等[61]在最初的iGluSnFR 的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)出了iGluf和iGluu兩種新的變體,其中iGluu能夠在100 Hz 的頻率下直接報(bào)告大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中單個(gè)谷氨酸的釋放,檢測(cè)范圍為0.01 ~ 10 mmol/L。雖然與iGluSnFR 相比,iGluf和iGluu的親和力有所降低,但這兩種變體在體外的構(gòu)象變化速度和在突觸中的動(dòng)力學(xué)速度分別提高了6 倍和5 倍[62]。

3.2 基于G 蛋白偶聯(lián)受體的蛋白質(zhì)傳感器

G 蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)是最大的膜受體家族,近年來,已開發(fā)了一系列基于GPCR 的傳感器來測(cè)量神經(jīng)遞質(zhì),比如ACh 傳感器(GACh)、DA 傳感器(GRABDA)和NE傳感器(GRABNE),如圖5 所示,以及通過人類DAD1 和D4 受體進(jìn)行檢測(cè)的dLight 系列探針[63]。與PBPs 作為傳感器支架相比,基于GPCR 傳感器在原理上可達(dá)到相似的靈敏度和響應(yīng)動(dòng)力學(xué),但在檢測(cè)相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)時(shí)具有更好的親和力和選擇性。

圖5 基于G 蛋白偶聯(lián)受體的熒光傳感器Note. GPCRs consist of seven α-helical transmembrane domains (TMs), and the conformation of the cytoplasmic end of TM6 changes the most when a ligand binds to the GPCR. Ligation of TM5 and TM6 is accomplished by cpGFP inserted into the third intracellular loop domain of GPCRs to detect conformational changes that occur upon GPCR binding to ligands. Ligand binding induces a conformational change in the GPCR resulting in increased fluorescence.Figure 5 Fluorescent sensor based on G protein-coupled receptors

Patriarchi 等[64]開發(fā)了一種基于遺傳編碼的多巴胺傳感器——dLight1,該傳感器能夠以高時(shí)空分辨率監(jiān)測(cè)小鼠紋狀體中多巴胺毫秒級(jí)的變化情況,該傳感器對(duì)多巴胺親和力在300 ~ 360 nmol/L 的范圍內(nèi)。 研究表明dLight1 在研究藥理操作、電生理或光遺傳學(xué)刺激等情況下多巴胺的動(dòng)態(tài)變化時(shí)具有很強(qiáng)的實(shí)用性。 Patriarchi 等[65]還設(shè)計(jì)除了干擾性小和光穩(wěn)定性強(qiáng)的RdLight1,RdLight1 對(duì)多巴胺的親和力為229 nmol/L,檢測(cè)范圍為0.01 ~ 100 μmol/L,為擴(kuò)展基于GPCR 的傳感器的顏色光譜提供了一個(gè)范例。 Sun 等[66]用cpGFP 取代了多巴胺D2 受體GPCR 的第三細(xì)胞內(nèi)環(huán),經(jīng)過廣泛的優(yōu)化制備出了對(duì)多巴胺具有高度特異性的GRABDA,該傳感器具有亞細(xì)胞分辨率、亞秒動(dòng)力學(xué)、較大的表觀親和力以及出色的分子特異性,能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)活蠅、斑馬魚和小鼠等多個(gè)模型系統(tǒng)中內(nèi)源性多巴胺的動(dòng)態(tài)變化。 GRABDA對(duì)多巴胺的親和力為130 nmol/L,時(shí)間分辨率不大于100 ms。 dLight 和GRABDA在HEK293 T 細(xì)胞中都具有很好的表達(dá)和良好的性能。

Jing 等[67]開發(fā)了一系列基于GPCR 的GACh,能夠選擇性地響應(yīng)外源性和內(nèi)源性乙酰膽堿,并通過雙光子顯微鏡捕捉到強(qiáng)烈的熒光信號(hào),具有良好的靈敏度、配體特異性、動(dòng)力學(xué)和光穩(wěn)定性。 該傳感器在對(duì)乙酰膽堿的親和力為100 μmol/L,時(shí)間分辨率在毫秒級(jí)別的范圍內(nèi)。 Feng 等[68]利用配體結(jié)合時(shí)第五和第六跨膜域之間的構(gòu)象變化來調(diào)節(jié)結(jié)合的熒光蛋白的亮度,開發(fā)了一系列基于GPCR 激活的GRABNE。 研究發(fā)現(xiàn),GRABNE具有很高的靈敏度、特異性和光穩(wěn)定性,對(duì)去甲腎上腺的親和力在納摩爾至微摩爾的范圍內(nèi),時(shí)間分辨率在亞秒級(jí)別的范圍內(nèi), 檢測(cè)范圍為0.1 ~ 100.0 μmol/L。GRABNE能快速、特異地監(jiān)測(cè)小鼠生理和病理過程中體內(nèi)去甲腎上腺素的動(dòng)態(tài)變化,對(duì)于了解去甲腎上腺素在復(fù)雜行為中的調(diào)節(jié)和影響具有重要的作用。表2 為不同種類的熒光傳感器在神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)方面的比較。

表2 不同種類的熒光傳感器在神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)方面的比較Table 2 Comparison of different kinds of fluorescence sensors for neurotransmitter detection

4 總結(jié)與展望

神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的化學(xué)信使,在維持人體正常的生命活動(dòng)中扮演著十分重要的角色。雖然已有關(guān)于神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的文章,但大部分文章只著重討論某一類神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)。 本文對(duì)目前常用的能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的技術(shù)進(jìn)行了全面的回顧。 詳細(xì)闡述了各個(gè)檢測(cè)方法的原理及其應(yīng)用,比較了這些方法的優(yōu)缺點(diǎn),如表3 所示。 當(dāng)面臨不同的情況時(shí),可以為選擇合適的技術(shù)提供了良好的參考。

表3 神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)工具之間的比較Table 3 Comparison between neurotransmitter detection tools

在自由活動(dòng)的動(dòng)物模型甚至人類中,對(duì)神經(jīng)化學(xué)動(dòng)力學(xué)的微侵入性監(jiān)測(cè)仍然是具有挑戰(zhàn)性的。除了上面討論的技術(shù)外,研究者們還開發(fā)了其他基于化學(xué)和細(xì)胞的方法來監(jiān)測(cè)神經(jīng)化學(xué)動(dòng)力學(xué)[69]。隨著材料學(xué)、生物和化學(xué)等領(lǐng)域中各種新技術(shù)的不斷發(fā)展,大腦神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)的研發(fā)將會(huì)被推向一個(gè)新的水平。 神經(jīng)科學(xué)的研究者們提出的新問題和在創(chuàng)造各種技術(shù)中吸取的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)將成為開發(fā)新的檢測(cè)神經(jīng)遞質(zhì)方法的紐帶[11]。 神經(jīng)遞質(zhì)的檢測(cè)研究已經(jīng)具備較好的基礎(chǔ),許多技術(shù)正在經(jīng)歷廣泛的創(chuàng)新并顯示出巨大的未來前景,未來神經(jīng)遞質(zhì)檢測(cè)技術(shù)將繼續(xù)向著無創(chuàng)、實(shí)時(shí)可視化以及信號(hào)放大等方向發(fā)展。