吳 霜，鄭鴻宇，李雪楊，甘麥鄰，沈林園，朱 礪*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川省畜禽遺傳資源發(fā)掘與創(chuàng)新利用重點實驗室，成都 611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點實驗室，成都 611130）

肥胖造成脂肪組織異位沉積，脂肪組織功能失調(diào)伴隨了游離脂肪酸、炎癥物質(zhì)、ROS的分泌，會促使全身低度炎癥[1]。過量的脂質(zhì)在不同器官中沉積，產(chǎn)生脂毒性擾亂細(xì)胞器正常功能，發(fā)生線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失調(diào)，進(jìn)一步加劇炎癥物質(zhì)和ROS 的釋放，進(jìn)而擾亂胰島素的信號傳導(dǎo)途徑[2]。此外，脂質(zhì)過度沉積會干擾葡萄糖平衡，推動了胰島素抵抗的進(jìn)程[3]。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度通常大于200 個堿基沒有特定蛋白編碼能力的核苷酸序列。隨著對非編碼RNA 探究的深入，逐漸揭示了lncRNA 參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾、蛋白質(zhì)翻譯后修飾以及穩(wěn)定性等廣泛的生物調(diào)節(jié)[4]。在脂肪的發(fā)育調(diào)控中，長鏈非編碼RNA（lncRNA）發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，其調(diào)控機(jī)制在脂肪分化、代謝和功能方面有顯著意義。研究指出lncOb家族參與瘦素調(diào)節(jié)基因的定性和定量表達(dá)[5]，lnc-BATE1的反式作用是BAT 發(fā)育和維持產(chǎn)熱功能的必需lncRNA[6]，lnc uc.417則會通過抑制p38/MAPK 通路的磷酸化阻礙UCP1的激活負(fù)向調(diào)節(jié)棕色脂肪產(chǎn)熱[7]。

ENSMUSG00000092381 在成骨細(xì)胞中高度富集，在小鼠組織中被命名為lnc-ob1（lncRNA osteoblastogenesis associated 1）,特異性敲入lnc-ob1能夠上調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子Osterix，促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣化[8]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖小鼠模型的不同類型脂肪組織中觀察到lnc-ob1的差異表達(dá)，這提示lnc-ob1可能在脂肪細(xì)胞的分化以及功能履行中發(fā)揮特定調(diào)控作用。為了進(jìn)一步探究這種可能性，本試驗采用生物信息學(xué)結(jié)合活體注射的方式，初步探究了lnc-ob1對脂肪組織棕色化的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)PC庫及軟件

NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中下載lncRNA-seq 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)；ensembl 數(shù)據(jù)庫（http://asia.ensembl.org/index.html）中獲取lnc-ob1序列信息；UCSC 數(shù)據(jù)庫（https://genome.ucsc.edu）分析lncob1的保守性；RNAfold 網(wǎng)站（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）預(yù)測lncRNA二級結(jié)構(gòu)；CPC（http://cpc2.gao-lab.org/）編碼潛能預(yù)測；image J軟件統(tǒng)計脂肪細(xì)胞面積。

1.2 試驗材料

1.2.1 實驗動物

雄性6 周齡C57BL/6J 小鼠購于成都達(dá)碩實驗動物有限公司。試驗獲四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院實驗動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)。

1.2.2 試驗試劑

牛胰島素購置于北京索萊寶科技有限公司；TRlzol RNA抽提試劑購置于Invitrogen公司（美國）；Hiscript Ⅲ RT SuperMix for qPCR購置于Vazyme公司；TB GreebTMPremix Ex TapTMⅡ購置于Takara公司；甘油三酯（TG）、總膽固醇（T-CHO）和高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）測試盒均購置于南京建成生物工程研究所；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 顯色液購置于上海碧云天公司；Anti-UCP1（ab209483）抗體購置于abcam，β-actin（200068-6D7）購置于成都正能生物技術(shù)公司，Goat anti-rabbit IgG（AS070）購置于ABclonal生物公司。

1.2.3 試驗儀器設(shè)備

試驗所用主要儀器設(shè)備見表1。

表1 試驗主要儀器設(shè)備表Table 1 Main test instruments and equipment

1.3 試驗方法

1.3.1 過表達(dá)載體構(gòu)建與引物設(shè)計合成

lnc-ob1過表達(dá)pCDNA3.1（+）質(zhì)粒購置于上海擎科生物有限公司。ENSMUSG00000092381 是位于小鼠第七號染色體（Chromosome 7:19 448 941～19 455 656）的反義lncRNA，轉(zhuǎn)錄本長度618 bp。對應(yīng)人源lnc-ob1（ENSG00000267282）位于人19 號染色體（Chromosome 7：44 882 027～44 890 876），轉(zhuǎn)錄本長度426 bp，序列如表2。

lnc-ob1引物序列設(shè)計于Primer3Plus 在線網(wǎng)站（http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi）。脂肪棕色化、產(chǎn)熱等相關(guān)基因參考序列信息從Genbank 中檢索下載，用Primer 5.0軟件設(shè)計9對引物（表3）。引物由擎科生物公司（成都）合成。

表3 引物序列Table 3 The primer sequences

1.3.2 實驗動物分組及處理

健康C57Bl/6J 雄性6 周齡小鼠18 只，隨機(jī)分為3 組：正常飲食對照組（normal diet，ND）、高脂飼喂組（high fat diet，HFD）、高脂飼喂+lnc-ob1過表達(dá)試驗組（HFD+lnc-ob1），3 組小鼠均自由采食飲水，其中n=6。HFD 組通過高脂飼喂構(gòu)建肥胖小鼠模型，飼喂4 周后超過對照組平均體質(zhì)10%為構(gòu)建成功。lnc-ob1過表達(dá)通過腹腔注射過表達(dá)載體實現(xiàn)，且ND組和HFD組注射等體積生理鹽水。

飼喂4 周后進(jìn)行組織樣本采集，眼球取血法采取全血，室溫靜置2 h后3 000 rpm離心15 min，取上清置-80 ℃冰箱保存。采血后對小鼠進(jìn)行斷頸處死法，采取肝臟（liver）、腹股溝脂肪（inguinal white adipose tissue,iWAT）、肩胛棕色脂肪（brown adipose tissue,BAT）和性腺脂肪（gonadal white adipose tissue,gWAT）并稱量，部分組織去除血污后利用4%多聚甲醛固定，用于制作H&E 染色切片；部分組織置于液氮速凍后迅速轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)試驗檢測。

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄-實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測

組織樣本用高速研磨儀破碎，用Trizol法提取組織mRNA，在ND-2000 分光光度計（NanoDrop）上檢測mRNA完整性和濃度。使用Hiscript Ⅲ RT Super-Mix for qPCR 試劑盒將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后用TB GreebTMPremix Ex TapTMⅡ進(jìn)行RT-qPCR 檢測，反應(yīng)體系配比為：5 μL TB Green，3 μL DEPC水，上下游引物各0.5 μL和1 μL cDNA。CFX96熒光定量儀反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性 10 s，60 ℃退火30 s，反應(yīng)39 個循環(huán)，72 ℃延伸1 min。mRNA的內(nèi)參基因為β-actin，基因表達(dá)量采用2-△△Ct法計算[9]。實時熒光定量PCR所用引物序列見表3。

1.3.4 Western blot

凍存的小鼠脂肪組織用研磨儀破碎，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，BAC 試劑盒（碧云天）檢測蛋白濃度，變性后按照25 ug 蛋白量上樣，15%SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，孵育UCP1 一抗（1∶2 000）、β-actin一抗（1∶5 000） 4 ℃過夜，TBST震蕩清洗后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST 震蕩清洗3次，ECL顯色法在凝膠影像分析儀成像。

1.3.5 GTT和ITT檢測

腹腔注射葡萄糖耐量試驗（GTT）操作如下：試驗處理4周后，試驗提前12 h對小鼠禁食，試驗當(dāng)天檢測小鼠體重，按照2 g/kg 根據(jù)體重計算20%葡萄糖溶液注射量，在0、15、30、60、90、120 min 時間點用羅氏試紙血糖儀檢測小鼠尾靜脈血糖。

腹腔注射胰島素耐量試驗（ITT）操作如下：操作同GTT，根據(jù)小鼠體重將胰島素（4 U/mL）按照0.75 U/kg劑量注射，在0、15、30、60、90 min 5個時間點檢測小鼠尾靜脈血糖。

1.3.6 蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining,HE）染色

小鼠部分組織用4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片，二甲苯浸泡后置于無水乙醇脫蠟，隨后依次置于95%、85%、70%乙醇中水化樣本。PBS清洗3次后，蘇木素染色5～10 min，蒸餾水洗去多余染色液后用1%鹽酸乙醇分化，細(xì)胞核反藍(lán)后蒸餾水清洗5 min。伊紅染液染色3 min，隨后脫水封片，顯微鏡鏡檢，進(jìn)行圖像采集分析。

1.3.7 生化指標(biāo)檢測

血漿總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）和高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）經(jīng)試劑盒檢測含量。肝臟組織樣本按照肝臟重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入無水乙醇，在冰浴下機(jī)械研磨為勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清用于后續(xù)檢測。TC檢測操作：在96 孔酶標(biāo)板上分別加2.5 μL 蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本，再分別加入250 μL工作液，37 ℃孵育10 min，酶標(biāo)儀檢測510 nm 波長處吸光度值。TG 檢測操作同TC，檢測波長為500 nm。HDL-L 檢測操作：96 孔酶標(biāo)板上分別加2.5 μL 蒸餾水、標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣本，再分別加入180 μL 工作液R1，37 ℃孵育5 min，酶標(biāo)檢測546 nm 波長吸光度A1，各孔添加60 μL 工作液R2，37 ℃孵育5 min，酶標(biāo)檢測546 nm波長吸光度A2，根據(jù)公式計算濃度。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 9.0 （GraphPad software，San Diego，CA，USA）分析，相關(guān)性分析采用D'Agostino-pearson 進(jìn)行相關(guān)分析。試驗結(jié)果采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 lnc-ob1 在肥胖小鼠脂肪組織中差異表達(dá)，進(jìn)化上具有高度保守性

lnc-ob1（ENSMUSG00000092381）位于小鼠第七號染色體（Chromosome 7:19 448 941～19 455 656）的反義lncRNA（圖1A-B）。隨后鑒定了lnc-ob1在豬、人、鼠等多個物種中高度保守，進(jìn)化上的序列保守為lnc-ob1的功能保守提供了基礎(chǔ)條件（圖1C-E）。且編碼能力預(yù)測顯示lnc-ob1不具備編碼潛能（圖1F）。此外，我們從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載了高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠及其對照的LncRNA-seq 數(shù)據(jù)，差異表達(dá)分析鑒定出lnc-ob1在高脂誘導(dǎo)小鼠的肩胛脂肪中表達(dá)量異常下降，為了進(jìn)一步確定lnc-ob1對脂肪發(fā)育的潛在影響，我們在高脂飼喂小鼠中腹腔注射裸質(zhì)粒過表達(dá)lnc-ob1。通過RT-qPCR 檢測不同脂肪組織（n=5）中l(wèi)nc-ob1表達(dá)量變化，結(jié)果顯示過表達(dá)組lnc-ob1表達(dá)量顯著高于對照組和高脂飼喂組。在HFD誘導(dǎo)肥胖小鼠的腹股溝脂肪中l(wèi)nc-ob1表達(dá)量顯著降低，表明lnc-ob1表達(dá)與脂質(zhì)代謝相關(guān)，同時證明腹腔注射質(zhì)粒顯著增加了lnc-ob1在脂肪組織中的表達(dá)（圖1G）。

圖1 lnc-ob1保守性分析以及不同脂肪組織中差異lncRNA分析Figure 1 Conservative analysis of lnc-ob1 and differential lncRNA analysis in different adipose tissues

2.2 lnc-ob1 過表達(dá)抑制小鼠肥胖癥發(fā)展，緩解肥胖小鼠的胰島素抵抗

初始體重趨于一致的小鼠，飼喂高脂日糧小鼠的體重從飼喂起第2 周呈現(xiàn)顯著差異（圖2A，P<0.05），高脂飼喂組葡萄糖耐量試驗（GTT）曲線下面積（AUC）顯著升高（圖2B～C）且HFD組胰島素耐量試驗的AUC 也顯著增加（圖2D-E），說明高脂飼喂造成小鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)的破壞和胰島素敏感性降低，且該現(xiàn)象被lnc-ob1過表達(dá)挽救。

圖2 過表達(dá)lnc-ob1高脂誘導(dǎo)肥胖小鼠以及對照組的體重以及血液指標(biāo)檢測Figure 2 Effects of lnc-ob1 overexpression on body weight and blood indexes

與對照組相比，HFD組在總甘油三酯（圖2F）和總膽固醇（圖2G）兩項血液生化指標(biāo)檢測中都顯著升高，lnc-ob1過表達(dá)組的TG、T-CHO 和HDL-C 與HFD組相比均顯著下降（圖2F～H）。

過表達(dá)lnc-ob1顯著抑制了高脂飼喂導(dǎo)致的小鼠肝臟重量增加（圖3A），改善了肥胖誘導(dǎo)的肝臟細(xì)胞間距增加的NAFLD樣變化（圖3D）。同時極顯著地降低了肝臟總甘油三酯和膽固醇的含量（圖3B-C）。以上結(jié)果證明，過表達(dá)lnc-ob1具有調(diào)節(jié)小鼠脂肪代謝、緩解肥胖小鼠胰島素抵抗的功能。

2.3 lnc-ob1過表達(dá)降低肥胖小鼠的脂肪質(zhì)量和脂肪細(xì)胞面積

HFD 小鼠肩胛脂肪和性腺脂肪相對于對照組增加（圖4A），肩胛和性腺脂肪的器官指數(shù)顯著增加（圖4B～C）。lnc-ob1過表達(dá)顯著降低了HFD誘導(dǎo)的性腺白色脂肪重量增加，同時抑制了性腺白色脂肪的脂肪面積增大，與HFD 相比lnc-ob1過表達(dá)的脂肪組織間毛細(xì)血管增加。

圖4 lnc-ob1對小鼠肩胛和性腺脂肪組織的影響Figure 4 Effect of lnc-ob1 on the adipose tissue of interscapular and gonadal

HFD 處理組的腹股溝白色脂肪（iWAT）的脂肪細(xì)胞面積和重量顯著高于對照組（圖5A～D），表現(xiàn)出了更嚴(yán)重的脂肪堆積。lnc-ob1的過表達(dá)顯著抑制了iWAT 的脂肪面積增加（圖5B～D），HE 染色表現(xiàn)出更明顯的脂肪棕色樣變化的血管分布（圖5A）。且Pearson相關(guān)性分析（Pearsonr=0.912 2）顯示lnc-ob1表達(dá)量與腹股溝脂肪細(xì)胞面積呈現(xiàn)強(qiáng)相關(guān)（圖5E）。

圖5 lnc-ob1對小鼠腹股溝脂肪組織的影響Figure 5 Effect of lnc-ob1 on the inguinal fat in mice

2.4 lnc-ob1 通過促進(jìn)白色脂肪棕色化緩解脂質(zhì)聚集

在過表達(dá)lnc-ob1的腹股溝脂肪中檢測到，白色脂肪棕色化傳統(tǒng)調(diào)控通路的UCP1基因表達(dá)和蛋白活性加強(qiáng)（圖6A～B）。q-PCR 結(jié)果顯示，與高脂飲食（HFD）組相比，過表達(dá)組脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱相關(guān)基因表達(dá)量增加，包括解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）、PR 結(jié)構(gòu)域蛋白16（PRDM16）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ 輔助激活因子-1α（PGC-1α）。同時，線粒體β 氧化調(diào)控基因過氧化物酶體增值無激活受體-α（PPAR-α）、過氧化物酶體增值物激活受體-γ（PPAR-γ）以及上游調(diào)控因子LPIN1和HSL表達(dá)量呈現(xiàn)相同趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖6 lnc-ob1調(diào)控小鼠脂肪代謝和棕色化基因表達(dá)變化Figure 6 lnc-ob1 regulates lipid metabolism and browning gene expression in mice

3 討論與結(jié)論

動物能量攝取超過能量消耗量時，多余的能量會以脂質(zhì)的形式儲存在脂肪細(xì)胞和其他代謝組織中，長期慢性能量攝入過剩則可能導(dǎo)致肥胖并誘發(fā)2型糖尿病[10]。棕色脂肪組織（BAT）通過UCP1解偶聯(lián)呼吸鏈與ATP合成，甘油三酯儲存的能量在氧化后以熱量的形式耗散從而產(chǎn)熱[11]。多項研究指出，在特定刺激下，如冷刺激、低氧、腎上腺素能激動劑，WAT內(nèi)的部分脂肪細(xì)胞發(fā)生棕色樣的變化行使BAT的功能，被稱為第三類脂肪組織“米色脂肪”[12-13]。

lnc-ob1功能保守，在多個物種（小鼠、豬、人）中基因組位置、全長已知。從超級保守區(qū)（UCR）轉(zhuǎn)錄的RNA（T-UCR），擁有較高的進(jìn)化保守性，在不同哺乳動物的進(jìn)化中都得到了保留，暗示了其在疾病或生理功能中的重要調(diào)控作用[14]。

C57Bl/6J 小鼠品系在高脂飲食飼喂條件下，容易出現(xiàn)胰島素抵抗、肝臟脂肪變性的變化。肥胖帶來胰島素和葡萄糖代謝紊亂，lnc-ob1外源性過表達(dá)抑制了高脂日糧飼喂的小鼠的體重增長，降低了小鼠的空腹血糖水平，增加了小鼠的胰島素敏感性，緩解了高脂飼喂誘發(fā)的肥胖和胰島素抵抗。葡萄糖經(jīng)由肝臟代謝轉(zhuǎn)化為甘油三酯和脂肪酸，作為極低密度脂蛋白的成分被脂肪細(xì)胞攝取，隨后存儲于白色脂肪組織[15]。慢性營養(yǎng)過剩造成的肥胖，促使小鼠肝臟脂肪生成和糖異生作用增強(qiáng)，發(fā)生顯著的肝臟脂肪性病變[16]。脂肪組織功能障礙伴隨的慢性炎癥和脂肪因子的釋放，進(jìn)一步促使肝臟脂質(zhì)代謝紊亂產(chǎn)生脂毒性，共同加劇胰島素抵抗[15]。通過H＆E染色和肝臟甘油三酯、膽固醇水平的檢測，明確了lnc-ob1對脂肪細(xì)胞的調(diào)控作用。試驗結(jié)果表明，lnc-ob1抑制了高脂飼喂對于脂肪沉積的不良影響，緩解了肝臟的NAFLD樣變化。

肩胛和甲狀腺周圍脂肪棕色化標(biāo)志基因表達(dá)量高，腹股溝脂肪（WAT）為代表的皮下脂肪高度表達(dá)成脂功能相關(guān)基因，性腺脂肪（腎周、腸系膜等內(nèi)臟脂肪）高度表達(dá)炎癥因子[17]。圍繞3 個具有代表性的部位脂肪展開研究，探究lnc-ob1對于胰島素抵抗的作用。試驗中觀察到lnc-ob1過表達(dá)顯著減弱腹股溝脂肪細(xì)胞的細(xì)胞面積，表明脂肪細(xì)胞的大小或是區(qū)別于數(shù)量導(dǎo)致腹股溝白色脂肪墊重量減少的原因，進(jìn)一步證明lnc-ob1調(diào)控脂質(zhì)代謝而非脂肪細(xì)胞形成。

經(jīng)典組成棕色脂肪的細(xì)胞存在于肩胛和腎周脂肪中，源自myf-5肌肉樣細(xì)胞系，白色脂肪和棕色化的白色細(xì)胞源于的脂肪前體細(xì)胞[18]。白色脂肪組織的UCP1基因基礎(chǔ)表達(dá)量非常低，但經(jīng)過寒冷或c-AMP等途徑長期刺激，會促發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生多房性的棕色脂肪特征，并激活UCP1表達(dá)開啟產(chǎn)熱功能[19]。PRDM16促進(jìn)白色脂肪棕色化阻斷脂肪細(xì)胞纖維化，同時能夠刺激骨骼肌成肌細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化，驅(qū)動完整脂肪棕色化的基因表達(dá)程序[18]。lnc-ob1通過增加棕色脂肪的含量/活躍度從而增加能量消耗，減少脂質(zhì)囤積，改善胰島素抵抗，降低肥胖小鼠的體重量。產(chǎn)熱基因UCP1、PGC-1α的激活，代表線粒體β氧化功能的PPAR-α表達(dá)量上升，證明lnc-ob1促進(jìn)iWAT 棕色化轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂挟a(chǎn)熱功能的米色脂肪組織[20]。

臨床上利用胰島素增敏劑促進(jìn)前脂肪細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)脂肪細(xì)胞對血液游離脂肪酸和甘油三酯的攝取，從而降低血液中脂肪酸含量，缺點是易造成肥胖的副作用[21]。利用基因調(diào)控脂肪代謝，促進(jìn)白色脂肪棕色化從而增強(qiáng)胰島素敏感性的方法能降低藥物的副作用，對于胰島素抵抗和肥胖癥或許有更大的治療潛力[22]。

綜上所述，本試驗驗證了在高脂飼喂誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪發(fā)育中，不同脂肪組織的lnc-ob1表達(dá)量差異，過表達(dá)lnc-ob1促進(jìn)了腹股溝脂肪的棕色化，減輕了小鼠的胰島素抵抗，為后續(xù)研究lnc-ob1在白色脂肪棕色化中的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。