薛惠元 王天姿 劉坤 崔鳳梅 涂彧 孫亮

1蘇州大學(xué)蘇州醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院，放射醫(yī)學(xué)與輻射防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘇州215123；2 溫州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，溫州325035

沿海地區(qū)核設(shè)施的建設(shè)使得水生生態(tài)環(huán)境成為放射性污染物的主要接受者，核電正常運(yùn)行時(shí)的液態(tài)流出物或事故后釋出的大量放射性污染物都會(huì)對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生危害。近年來，由于核電排污的增加，導(dǎo)致氚的排放量增加，并引起了社會(huì)各界的廣泛關(guān)注。此外，氚可以迅速融入環(huán)境和生物系統(tǒng)，因此研究電離輻射在一定劑量范圍內(nèi)對(duì)水生生物的影響很有必要。氚（3H）是氫元素的放射性同位素之一，會(huì)隨核反應(yīng)裝置中的冷卻水排放入環(huán)境[1]。氚流動(dòng)性極強(qiáng)，可通過食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類健康造成影響[2-3]。水生模式動(dòng)物斑馬魚的基因與人類基因有著高達(dá)87%的相似度[4]。有研究結(jié)果表明，對(duì)非人類物種的研究結(jié)果可在一定程度上外推至人體[5]。針對(duì)斑馬魚早期發(fā)育階段氚暴露的生物效應(yīng)也有諸多研究，其結(jié)果顯示氚暴露可誘發(fā)斑馬魚生長發(fā)育的改變[6-8]。此外，魚類早期發(fā)育階段被認(rèn)為是其生命周期中最敏感的發(fā)育時(shí)期，可用作評(píng)估污染物毒性作用[9-10]。因此，本研究選擇處于早期發(fā)育階段的斑馬魚為研究對(duì)象，在前期斑馬魚輻射劑量評(píng)估的理論基礎(chǔ)上[11]，嘗試將觀察到的氚水對(duì)斑馬魚的輻射生物學(xué)效應(yīng)與理論劑量計(jì)算相結(jié)合，以研究劑量-效應(yīng)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑

野生型斑馬魚（AB 品系）購于蘇州木芮生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州大學(xué)倫理委員會(huì)同意，符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的要求。

甲基纖維素（M0387-100G）由美國Sigma-Aldrich?公司提供；氚水（5 mCi，185 MBq）由美國PerkinElmer 股份有限公司提供；閃爍液（UItima Gold LLT, PerkinElmer）由美國PerkinElmer 股份有限公司提供。甲基纖維素溶液、E3 溶液由本實(shí)驗(yàn)室自行制備。

根據(jù)購買氚水的出廠時(shí)間，計(jì)算配置溶液時(shí)氚水的活度，使用E3 溶液分別稀釋得到3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml 實(shí)驗(yàn)用氚水。

1.2 氚水活度濃度測(cè)定及其吸收劑量率的計(jì)算

分別取培養(yǎng)皿中3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml 3 種濃度氚水各4.5 ml，與6.5 ml 閃爍液于20 ml液閃瓶中混合均勻，避光8～12 h。使用檢出限為5 Bq/L 的 液 體 閃 爍 計(jì) 數(shù) 器（Tri-Carb 2910TR，Quantulus 1220，美國PerkinElmer 股份有限公司）測(cè)量。使用公式（1）對(duì)氚樣品活度濃度進(jìn)行計(jì)算：

式中，A 為氚樣品的活度濃度，單位 Bq/ml；cpms為待測(cè)氚樣品總計(jì)數(shù)率，單位計(jì)數(shù)每秒；cpmb為本底樣品總計(jì)數(shù)率，單位計(jì)數(shù)每秒；V 為測(cè)量所用溶液的體積，單位為ml； η為計(jì)數(shù)效率，無量綱。

根據(jù)生物實(shí)驗(yàn)中所關(guān)注的發(fā)育階段及斑馬魚發(fā)育形態(tài)的差異，選用斑馬魚受精后24 h（24 hours post fertilization，24 hpf）胚胎和96 hpf 幼魚為建模對(duì)象，使用前期建立的胚胎和幼魚模型[11]?？紤]到散射影響，本研究模擬斑馬魚在培養(yǎng)皿中的實(shí)際情況建立相應(yīng)模型：培養(yǎng)皿直徑為90 mm，高度為20 mm，內(nèi)有30 枚斑馬魚胚胎或10 條斑馬魚幼魚和25 ml 溶液（根據(jù)模擬條件不同有所變化，具體如下文所述）。模擬內(nèi)照射條件時(shí)，斑馬魚胚胎和幼魚幾何條件不變，培養(yǎng)皿中溶液為水，氚在胚胎、幼魚頭部、軀干及卵黃囊中均勻分布，源為各向同性。模擬外照射時(shí)，氚在溶液中均勻分布，源為培養(yǎng)皿中圓柱體體積源，直徑與培養(yǎng)皿內(nèi)徑相同，源為各向同性。表1 為斑馬魚材料組成，游囊內(nèi)氣體以空氣替代。應(yīng)用蒙特卡羅軟件GATE（the geant4 application for tomographic emission）8.2 版，結(jié)合實(shí)驗(yàn)條件對(duì)斑馬魚吸收劑量率進(jìn)行計(jì)算[12]。

表1 斑馬魚受精后24 h 胚胎和96 h 幼魚模型的器官體積、密度和組成Table 1 Volume, density and composition of organs of zebrafish 24 hours post fertilization embryos and 96 hours post fertilization larvae models

建立斑馬魚早期發(fā)育階段氚染毒劑量計(jì)算模型（圖1）。

圖1 早期發(fā)育階段斑馬魚受精后24 h 胚胎和受精后96 h 幼魚氚染毒劑量計(jì)算模型 A 為模擬的培養(yǎng)皿形態(tài)；B 為將30 枚斑馬魚胚胎隨機(jī)分布于培養(yǎng)皿的30 個(gè)點(diǎn)位置；C 為將10 條斑馬魚幼魚隨機(jī)分布于培養(yǎng)皿的10 個(gè)點(diǎn)位置Figure 1 A model for the calculation of tritium contamination dose for 24 hous post fertilization embryos and 96 hours post fertilization larvae of zebrafish at early developmental stages

根據(jù)公式（2）計(jì)算斑馬魚的吸收劑量率：

式中，D 為劑量率，單位μGy/h；DCext為外照射劑量系數(shù)，單位μGy·L·Bq-1·h-1；DCint為內(nèi)照射劑量系數(shù)，單位μGy·kg·Bq-1·h-1；Aw為水中氚的活度濃度，單位Bq/L；Ao為生物體中氚的活度濃度，單位Bq/kg。

實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，生物體內(nèi)氚活度由于條件限制難以測(cè)量，因此采用濃度比的方法進(jìn)行計(jì)算。本研究中采用Arcanjoa 等[13]文獻(xiàn)中的濃度比公式進(jìn)行計(jì)算。

式中，CF 為濃度比，也稱為濃集因子，無量綱。定義為生物體內(nèi)放射性核素的活度濃度與環(huán)境介質(zhì)中放射性核素的活度濃度的比值。Ao為生物體中氚的活度濃度，單位Bq/kg；Aw為水中氚的活度濃度，單位Bq/L。

1.3 斑馬魚翻轉(zhuǎn)頻率和心率計(jì)數(shù)

1.3.1 斑馬魚染毒

取10 對(duì)成年斑馬魚，雌雄1∶1 配比放入生殖缸，待受精后收集胚胎，28℃恒溫保存在E3 培養(yǎng)液中。對(duì)照組為E3 溶液，處理組氚水的3 種濃度分別為3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml。將3 hpf胚胎分別暴露于E3 溶液和 3 種不同濃度的氚水中，每組50 枚，并重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)

受精后24 h，在上述3 種不同濃度的氚水中用簡單隨機(jī)抽樣方法各選取30 枚斑馬魚胚胎，體式顯微鏡（中國麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，Motic SMZ-168）測(cè)定胚胎1 min 翻轉(zhuǎn)次數(shù)。

1.3.3 斑馬魚幼魚心率

受精后96 h，在上述3 種不同濃度的氚水中用簡單隨機(jī)抽樣方法各選取10 條斑馬魚幼魚，將其放入甲基纖維素中進(jìn)行固定，測(cè)定20 s 心率。各階段結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，對(duì)照組與處理組之間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)（方差齊）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 斑馬魚幼魚氚染毒劑量計(jì)算模型和吸收劑量率

由表2 可知，氚活度濃度的測(cè)定結(jié)果與理論濃度值的誤差在5%以內(nèi)， 24 hpf 斑馬魚胚胎和96 hpf 幼魚的內(nèi)照射劑量系數(shù)一致，外照射劑量系數(shù)均高于內(nèi)照射劑量系數(shù)，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件無法滿足“均勻各項(xiàng)同性模型”的假設(shè)條件，培養(yǎng)皿的材料中產(chǎn)生了一定的散射線所致；外照射劑量系數(shù)96 hpf 幼魚要略高于24 hpf 胚胎，這可能與外形和材料組成的不同有關(guān)。因此，雖然斑馬魚幼魚氚的實(shí)際濃度比較低，但是最終氚的吸收劑量率幼魚略高于胚胎。

表2 受精后24 h 斑馬魚胚胎與96 h 幼魚在不同濃度氚水中的測(cè)量濃度、濃度比、內(nèi)外照射劑量系數(shù)和吸收劑量率Table 2 Measured concentration, concentration ratio, internal and external radiation dose coefficient and absorbed dose rate after exposure of 24 hours post fertilization embryos and 96 hours post fertilization larvae of zebrafish in different concentrations of tritium water

2.2 氚水對(duì)斑馬魚翻轉(zhuǎn)頻次和心率的影響

由表2 可知，24 hpf 斑馬魚胚胎在3.7×103、3.7×104、3.7×105Bq/ml 3 種不同濃度的氚水中對(duì)應(yīng)的吸收劑量率分別為2.15×10、2.21×102、2.55×103μGy/h。氚水暴露后，斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)頻率和斑馬魚幼魚心率結(jié)果如圖2 所示。各組間斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)頻率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.64，P＜0.001），與對(duì)照組相比，3.7×103Bq/ml 氚水處理組斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)頻率明顯減少（t=3.94，P＜0.001）；3.7×104Bq/ml 氚水處理組斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)頻率雖有升高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-0.06，P=0.95）；3.7×105Bq/ml 氚水處理組斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)頻率無明顯改變（t=0.17，P=0.87）。

圖2 氚水對(duì)受精后24 h 斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)頻率和受精后96 h 斑馬魚幼魚心率的影響 a 表示與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.94、2.86、12.12，P＜0.001、=0.01、＜0.001）Figure 2 Effects of tritiated water on the frequency of zebrafish embryo flipping at 24 hours post fertilization and on the heart rate of zebrafish larvae at 96 hours post fertilization

96 hpf 斑馬魚幼魚在3 種不同濃度的氚水暴露下，相對(duì)應(yīng)的劑量率分別為2.95×10、3.03×102、3.47×103μGy/h，3 組間斑馬魚幼魚心率的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=93.85，P＜0.001）。由圖2 可見，與對(duì)照組相比，3.7×103Bq/ml 氚水處理組斑馬魚幼魚心率明顯下降（t=2.86，P=0.01），而3.7×105Bq/ml 氚水處理組斑馬魚幼魚心率上升（t=-12.12，P＜0.001），3.7×104Bq/ml 氚水處理組斑馬魚幼魚的心率無明顯變化（t=1.27，P=0.21）。

3 討論

斑馬魚胚胎和幼魚對(duì)輻射環(huán)境較敏感，低劑量輻射即可對(duì)其發(fā)育產(chǎn)生影響，還伴隨著DNA 損傷和基因表達(dá)的變化。Gagnaire 等[9]和Arcanjo 等[14]用氚水對(duì)斑馬魚胚胎和幼魚進(jìn)行染毒，結(jié)果顯示，0.4 mGy/h 和4 mGy/h 2 種劑量率的斑馬魚自發(fā)翻轉(zhuǎn)次數(shù)與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但隨著發(fā)育時(shí)間的不同，自發(fā)翻轉(zhuǎn)次數(shù)也有變化；在0.4 mGy/h劑量率下，96 hpf 幼魚游泳活性較對(duì)照組有明顯下降，但在4 mGy/h 劑量率下，2 組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能與氚水調(diào)節(jié)編碼肌肉收縮的相關(guān)基因引起DNA 損傷、神經(jīng)毒性及免疫毒性有關(guān)。有研究結(jié)果表明，自然情況下，斑馬魚胚胎自發(fā)翻轉(zhuǎn)頻率先上升后下降，在19 hpf 時(shí)達(dá)到巔峰，然后至26 hpf 緩慢下降[15]。在另一項(xiàng)關(guān)于雙酚A 對(duì)斑馬魚神經(jīng)發(fā)育毒性的研究結(jié)果也表明，發(fā)育時(shí)間的長短可以影響斑馬魚胚胎自發(fā)翻轉(zhuǎn)[16]。在本研究中，2.21×102μGy/h 吸收劑量率下，胚胎自發(fā)翻轉(zhuǎn)頻率輕微上升，可能是因?yàn)槲覀儗?shí)驗(yàn)觀察斑馬魚翻轉(zhuǎn)情況是在受精后23～27 h 進(jìn)行，從而由于發(fā)育時(shí)間的不同造成的。因此在本研究所對(duì)應(yīng)的吸收劑量率下，也許會(huì)影響斑馬魚有關(guān)神經(jīng)發(fā)育或肌肉運(yùn)動(dòng)的基因表達(dá)；同時(shí)，高劑量誘發(fā)了斑馬魚胚胎的損傷保護(hù)機(jī)制，使得較高劑量氚水處理組胚胎翻轉(zhuǎn)頻率與對(duì)照組無明顯差異。

Arcanjo 等[6]在0.4 mGy/h 和4 mGy/h 2 種氚暴露劑量情況下，對(duì) 24 hpf 斑馬魚胚胎和96 hpf 斑馬魚幼魚進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，結(jié)果表明，無論劑量率如何，在24 hpf 斑馬魚胚胎中，氚水污染對(duì)斑馬魚調(diào)控肌肉收縮的基因均有影響，但在不同劑量率下差異表達(dá)基因的種類及調(diào)控方式不同，只有少部分差異表達(dá)基因之間有所重疊。在劑量率為0.4 mGy/h時(shí)，暴露于氚水24 h 后，有關(guān)斑馬魚肌肉收縮的基因有所上調(diào)，而劑量率為4 mGy/h 時(shí)，有關(guān)斑馬魚肌肉收縮的基因卻出現(xiàn)下調(diào)的情況。本研究中，3.7×103Bq/ml與3.7×105Bq/ml 不同濃度氚水處理組斑馬魚卻表現(xiàn)出截然相反的心率變化，其可能原因是由于基因表達(dá)不同所造成的。Arcanjo 等[14]在之后的研究中對(duì)72 hpf、96 hpf 斑馬魚心率進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，發(fā)育時(shí)間對(duì)不同劑量率的心率有顯著的影響，生物體也許可以通過早期基因表達(dá)的變化來應(yīng)對(duì)氚毒性效應(yīng)。

斑馬魚24 hpf 和96 hpf 是輻射生物學(xué)效應(yīng)研究中觀察生物學(xué)評(píng)價(jià)終點(diǎn)常見的時(shí)間點(diǎn)。本研究通過觀察氚染毒條件下斑馬魚24 hpf、96 hpf 這2 個(gè)重要發(fā)育階段的翻轉(zhuǎn)頻率和心率生物學(xué)指標(biāo)，結(jié)合實(shí)驗(yàn)環(huán)境，計(jì)算斑馬魚早期發(fā)育階段的吸收劑量率，將劑量計(jì)算結(jié)果與觀察到的生物效應(yīng)相結(jié)合，結(jié)果表明，斑馬魚受照劑量隨發(fā)育時(shí)間的增長有所提高，這可能是由于幼魚破膜骨性材料增加所致。斑馬魚胚胎翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)前劑量率中胚胎翻轉(zhuǎn)頻率的輕微上升可能是胚胎發(fā)育時(shí)間輕微不同和有關(guān)神經(jīng)發(fā)育或肌肉運(yùn)動(dòng)的基因表達(dá)受到影響造成的。較高劑量處理組翻轉(zhuǎn)頻率與對(duì)照組無明顯差異，這可能是由于高劑量誘發(fā)了胚胎的損傷保護(hù)機(jī)制所致。同時(shí)，胚胎自發(fā)翻轉(zhuǎn)的實(shí)效性，對(duì)在一個(gè)時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行的翻轉(zhuǎn)計(jì)數(shù)結(jié)果有一定的影響，后期實(shí)驗(yàn)應(yīng)盡量避免該情況。在斑馬魚心率實(shí)驗(yàn)中，幼魚心率隨濃度的變化可能是由于不同劑量率下，基因調(diào)控行為不同而導(dǎo)致的。

本研究由于魚體較小，且發(fā)育速度較快，未開展不同組織滯留核素相互影響的定量分析。并且假設(shè)核素在氚染毒環(huán)境和斑馬魚器官內(nèi)均勻分布，這一假定對(duì)于某些體內(nèi)再分布的核素而言具有一定局限性。上述假定和不足都是今后優(yōu)化斑馬魚模型和進(jìn)行劑量-效應(yīng)關(guān)系研究工作的重點(diǎn)。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

志謝 感謝江蘇省高校協(xié)同創(chuàng)新中心對(duì)本研究的支持

作者貢獻(xiàn)聲明 薛惠元負(fù)責(zé)模型的建立、論文的撰寫；王天姿負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與數(shù)據(jù)的分析；劉坤負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的采集與整理；崔鳳梅、涂彧負(fù)責(zé)論文撰寫的指導(dǎo)與修改；孫亮負(fù)責(zé)論文的設(shè)計(jì)、審閱與修改