朱小潔 王雯 于倩倩 耿雅婷 朱沂昕 劉立科

(聊城大學生命科學學院，山東 聊城 252059)

種子是被子植物在復雜環(huán)境中生存和延續(xù)的關鍵，植物種子的異常發(fā)育可能會導致后代的生長繁殖受阻，同時種子的發(fā)育程度也決定著大多數農作物的產量。胚胎、胚乳和種皮的發(fā)育是種子的主要組成部分，決定了籽粒的生長發(fā)育，雖然這3個主要部分表現(xiàn)出不同的形態(tài)和功能，但必須協(xié)調生長才能實現(xiàn)種子的正常發(fā)育，這一過程由多種調控途徑共同作用，構成復雜的基因表達調控網絡。

在先前的研究中，確定了幾種影響種子發(fā)育的信號通路，包括IKU通路、泛素-蛋白酶體通路、G蛋白信號通路和MAPK信號通路[1]。在多種信號調控途徑中，植物激素同樣在種子發(fā)育調控中起重要作用，生長素、細胞分裂素、油菜素內酯和赤霉素是控制種子發(fā)育的關鍵成分，也成為當前種子發(fā)育調控的研究熱點。本文以這4類植物激素的生物合成及激素信號轉導過程為主，總結激素傳導通路上影響種子發(fā)育的調控基因及激素間互作關系，這些內容將有助于未來在作物研究中進行反向遺傳實驗的基因選擇，推動種子發(fā)育研究的進一步發(fā)展。

1 生長素

1.1 生長素在種子發(fā)育過程中的功能

生長素(Auxin)簡稱IAA，是調控種子發(fā)育過程的主要激素，并存在于種子發(fā)育的所有階段，從受精開始到種子成熟都保持著高水平積累，調控受精后胚胎、胚乳和種皮的發(fā)育。生長素在胚胎發(fā)生早期通過影響胚體的頂基極性，以濃度依賴的方式驅動生長和發(fā)育，在胚的形成中起重要作用，因此生長素也成為眾多植物激素中對種子發(fā)育影響最大的植物激素，生長素信號通路如圖1所示。

圖1 生長素信號通路

1.2 生長素調控基因

1.2.1 IAA的運輸

生長素外排載體PINs和內流載體AUX/LAX介導了種子發(fā)育過程中生長素的主動運輸，是調節(jié)生長素極性運輸的重要蛋白。目前已知LAX1、LAX2和LAX3參與生長素細胞內流，Robert等[2]在甘藍型油菜小孢子胚和擬南芥合子胚中，證明了AUX1、LAX1和LAX2是芽和根形成所必需的調控因子。生長素外流載體PIN3和內流載體AUX1參與生長素的極性分布，PIN3表達于被膜最內層，AUX1在胚乳和外被層均有表達，介導種皮中生長素的極性運輸[3]，ENP(PINOID增強子)也可以通過與PID(PINOID蛋白激酶)一起控制PIN1的極性特異性來調節(jié)子葉發(fā)育[4]。這些載體的細胞定位表明了生長素的流向，從而形成了生長素的濃度梯度，控制生長素運輸的平衡。

1.2.2 IAA生物合成

生長素的主要來源是生物合成，色氨酸(L-TrP)和吲哚-3-丙酮酸(IPyA)共同介導IAA的生物合成。YUCCA(YUCs)類基因編碼含黃素單氧化酶，與IPyA協(xié)同作用下控制IAA的生物合成。在玉米中，ZmYuc1基因編碼玉米胚乳特異性YUCCA1蛋白，其基因缺失突變體de18的IAA生物合成受損，導致胚乳增殖缺陷，使種子變小[5]。在進一步研究中發(fā)現(xiàn)，RGB1基因的下調顯著降低生長素含量，延緩籽粒發(fā)育，降低了淀粉積累和籽粒重，OsNFYB1作為RGB1的關鍵下游效應因子，直接與OsYUC11的啟動子相互作用，刺激OsYUC11的表達，從而調控生長素的生物合成[6]?？偟膩碚f，YUCs成員通過動態(tài)表達調控種子局部生長素的生物合成來調控種子發(fā)育，但生長素調節(jié)機制卻大多都集中在YUCs調控環(huán)節(jié)上，TAA調控生長素合成的基因還未有過多報道。

1.2.3 ARF相關基因

ARF是調節(jié)生長素應答基因表達的轉錄因子，具有識別下游基因啟動子區(qū)域內的生長素反應元件并調節(jié)其表達的能力。生長素反應因子ARF2是ARF轉錄因子家族成員，MNT編碼的ARF2是細胞分裂和器官生長的抑制因子，擬南芥功能缺失突變體mnt的種子與野生型相比大小和重量都有所增加[7]。過表達microRNA167A可以降低亞麻薺中α-亞麻酸含量，還可以通過靶向作用于ARF6和ARF8來調節(jié)胚胎和胚乳的發(fā)育，使種子增大[8]。在甘藍型油菜的9號染色體上還發(fā)現(xiàn)了另一個數量性狀位點ARF18，其編碼生長素反應因子，在角果發(fā)育過程中調節(jié)細胞壁的細胞生長，從而影響種子質量[9]。綜上所述，一旦ARF的表達出現(xiàn)被抑制或被激活，其相應的生長素反應基因也會被激活或去抑制。

2 細胞分裂素

2.1 細胞分裂素功能在種子發(fā)育過程中的功能

細胞分裂素(Cytokinin，CK)的主要功能為促進細胞分裂，影響細胞周期，主要作用于種子發(fā)育初始階段。在胚珠的形成階段，CK信號增強可以促進細胞分裂，產生更多的胚珠，胚珠的形成也是影響種子產量的關鍵，發(fā)育初始階段CK合成相關基因的高表達可提高種子數量[10]。種子的發(fā)育與胚和胚乳中CK水平的升高密不可分，CK信號通路如圖2所示。

圖2 細胞分裂素信號通路

2.2 細胞分裂素相關調控基因

2.2.1 CK的合成與分解

IPTs(異戊烯基轉移酶)和LOGs(細胞分裂素核苷5′-單磷酸鹽磷酸核糖水解酶)是參與CK合成的關鍵酶，植物中CK含量的多少可以直接調節(jié)種子發(fā)育的過程，因此控制CK合成與分解的過程尤為重要。TMO5/LHW通過LOG4控制CK生物合成，因此，TMO5是生長素的直接反應基因，TMO5的表達標志著球形胚胎時期細胞的建立[11]。擬南芥中，AtENO2編碼的蛋白AtENO2和AtMBP-1與AtbZIP75相互作用，控制種子中的CK的含量，而AtENO2功能的缺失導致了與烯醇化酶活性降低相關的發(fā)育缺陷，其突變體降低了CK的含量，與野生型植株相比，AtENO2突變體種子中葡萄糖含量顯著升高，淀粉含量顯著降低，導致子葉變小，種子的大小和重量減小[12]。

CK的分解由CKXs(細胞分裂素氧化酶/脫氫酶)催化，CKXs可使具有生物活性的CK失活，是植物內源CK的負調控因子。如，來自擬南芥的CKX3，CKX5基因可直接分解細胞分裂素，ckx3-ckx5功能缺失雙突變體可以進一步驗證CKX的分解作用，該突變體中活性CK的升高使擬南芥形成較大的花序和花分生組織，證明CKX3和CKX5可調控生殖分生組織的活性[13]。另一個負調控因子CKX2可啟動籽粒大小，Tsago等[14]在水稻Osckx2-2突變體中可以得到相似的結論，OsCKX2-2基因與野生型相比表達量更低，CKX活性的降低，使其籽粒相比于野生型更長、更寬、更重。

2.2.2 CK受體相關

CK信號由細胞膜上的HK(組氨酸激酶)感知，HK5和HK6作為細胞分裂素受體，可調節(jié)水稻生長發(fā)育的各個方面，在水稻hk5和hk6單突變體中，其根生長、葉寬、花序結構和花發(fā)育會受到影響，在hk5-hk6雙突變體中表現(xiàn)出更嚴重的缺陷[15]。HK受體的缺失導致CK無法在細胞膜上被特異性識別，胞內也無法進行下一步蛋白磷酸化級聯(lián)反應。

2.2.3 CK反應調節(jié)因子

細胞核內，CK信號通路涉及1個B型反應調節(jié)因子(RRB，在擬南芥中稱為ARR-B)和1個A型反應調節(jié)因子(RRA，擬南芥中稱為ARR-A)，其中，ARR-B是調控CK應答基因表達的轉錄因子，調控基因的轉錄及表達。研究發(fā)現(xiàn)，B型ARR功能缺失的三突變體arr1，10，12表現(xiàn)出生殖缺陷，雌蕊和花長較短，胚珠較少的性狀，導致擬南芥種子數量減少[16]，這證明了B型ARR是CK信號轉到中的重要環(huán)節(jié)，大多學者報道了其在CK信號通路上的功能，但近些年對調控B型ARR的遺傳因子還未有更深入的研究。

3 油菜素內酯

3.1 油菜素內酯在種子發(fā)育過程中的功能

油菜素內酯(Brassinolide，BR)作為主要的植物激素之一，對植物正常生長、發(fā)育和適應生物和非生物脅迫的各種過程至關重要，參與一系列的生理過程。在種子發(fā)育過程中，可以調節(jié)胚珠數及花粉發(fā)育，其中最重要的功能是BR可以使種子粒寬、粒長等形態(tài)特征發(fā)生改變，對控制種子的形狀有重要作用[17，18]，BR信號通路如圖3所示。

圖3 油菜素內酯信號通路

3.2 BR參與種子發(fā)育的調控基因

3.2.1 BR生物合成

BR以劑量依賴的方式控制植物的生長發(fā)育，因此種子中BR的生物合成至關重要。小麥中同樣發(fā)現(xiàn)了編碼BR生物合成酶的TaD11基因，該基因在根和籽粒中高表達，而外源BR可顯著抑制其表達，TaD11-2A基因缺失突變體tad11-2a-1內源BR含量降低，表現(xiàn)為矮化和小種子[19]。此外，在水稻中利用種子特異表達啟動子驅動BR合成關鍵酶基因OsDWF4的表達也可以顯著提高水稻粒長和單株粒數[18]。綜上所述，可以看出D11是BR合成過程中極其重要的調控因子，BR的合成可直接影響種子發(fā)育，造成種子形狀的改變。

3.2.2 BR受體相關

BRI1(BR受體激酶)是一種質膜富亮氨酸重復體樣激酶，也是擬南芥的主要BR結合受體，BRI1作為BR信號的結合受體，是BR胞內信號轉導的第1步。Jaiswal等[20]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶突變基因BRI1的116、144和168號大麥育種品系的粒級分布發(fā)生了變化，其中最大直徑發(fā)生了顯著變化，但直鏈淀粉濃度差異不顯著，BRI1突變還改變了B型和C型小淀粉顆粒的支鏈淀粉精細結構，導致攜帶BRI-1突變的基因型中A型葡聚糖短鏈的比例增加(<10DP)，B2鏈的比例減少(25-36DP)。這證明了BRI1在種子發(fā)育中的重要性，異常的BRI1會延遲籽粒發(fā)育、直鏈淀粉合成和淀粉在胚乳中的積累，籽粒發(fā)育的延遲可導致作物產量的增加，可以猜測其籽粒形態(tài)的改變是因胚乳中淀粉顆粒的支鏈淀粉精細結構的改變而改變的。

3.2.3 BZR1相關基因

BR通過一系列磷酸化級聯(lián)反應，利用PP2A(蛋白磷酸酯酶2A)使BZR1/BES1去磷酸化，并與14-3-3蛋白解離，使BZR1/BES1聚集在細胞核內，誘導下游調控植物種子生長發(fā)育過程中多種基因的表達。

OsBZR1與BR合成基因D11相似，BR信號感知因子OsBZR1的過表達可直接促進CSA的表達，從而觸發(fā)花粉和種子發(fā)育過程中糖分配和代謝基因的表達，導致花藥和種子中的糖分積累量的增加，進提高籽粒產量[21]。而OsBZR1又與OFP1啟動子相關聯(lián)，OFP1通過高BR信號參與抑制植物生長，因此，OFP1過表達也會導致籽粒形狀的改變[17]。GW5也是一種BR信號正調控因子，在水稻各器官中均有表達，幼嫩穗中表達量最高，影響水稻籽粒寬度和籽粒重量，GW5蛋白可與擬南芥GSK2(糖原合成酶激酶2)相互作用，抑制GSK2的活性，使未磷酸化的OsBZR1蛋白在細胞核中積累，從而介導BR應答基因表達和生長應答[22]，GW5缺失型水稻品種的籽型發(fā)生改變，有著較短的粒長、較寬的粒寬、較厚的粒厚、較小的長寬比和較重的千粒質量[23]。

4 赤霉素

4.1 赤霉素在種子發(fā)育過程中的功能

赤霉素(Gibberellin，GA)最早發(fā)現(xiàn)于20世紀初，與脫落酸(Abscisic acid，ABA)在植物體內相互作用，是拮抗調節(jié)種子發(fā)育和萌發(fā)的主要激素，也是胚胎發(fā)育的負調控因子。在胚胎分化階段，可促進細胞生長和膨脹，同時控制籽粒灌漿過程中胚乳細胞的伸長和分裂[24]，GA信號通路如圖4所示。

圖4 赤霉素信號通路

4.2 GA相關調控基因

4.2.1 GA的生物合成

GA生物合成的后期，GA生物活性的水平主要由3種酶控制，GA20ox和GA3ox催化中間產物轉化為具有生物活性的赤霉素，另一種酶GA2ox，催化有生物活性的GA轉化為無活性的分解代謝產物，研究發(fā)現(xiàn)，這3種酶可以依據GA濃度在細胞內動態(tài)調節(jié)活性GA的生物合成，控制種子發(fā)育。

GA20ox基因編碼GA合成途徑中的關鍵酶GA20ox，可使無活性的GA催化生成有活性的GA，過表達GA20oX提高了轉基因植物種子的大小，即GA20ox可以通過影響赤霉素的生物合成而正向調控大豆種子大小[25]。GA3ox是大豆赤霉素合成途徑的另一個關鍵酶，GmGA3ox1基因編碼該酶，敲除GmGA3ox1可導致許多光合作用相關基因的上調，雖然減少了赤霉素的生物合成，但促進了大豆的光合作用，可在總體上提高種子產量[26]。而GA2ox與GA20ox、GA3ox催化作用相反，可使胚乳中有生物活性的GA失活，擬南芥種子中，在MEDEA啟動子的控制下，過表達PsGA2ox基因可導致種子流產和抑制花粉管的生長[27]。綜上所述，GA含量的適當減少可以在一定程度上提升作物產量，但GA含量過少會導致種子發(fā)育缺陷，證明胚乳中活躍的GAs對種子的正常發(fā)育至關重要。

4.2.2 GA受體相關

赤霉素受體GID1感知到有生物活性的GA時，植物中的GA信號開始細胞內傳導。GID1A，GID1B和GID1C為3個GA受體基因，GID1A在整個雌蕊中表達，在坐果和生長過程中起主要作用；GID1B在胚珠中表達，種子發(fā)育中起作用；GID1C在瓣中表達，可調控莢果的伸長，其三突變體表現(xiàn)出比極端GA缺乏突變體更嚴重的矮化表型，發(fā)育遲緩，花的形成時間較長且花器官發(fā)育缺陷嚴重[28]。楊曉穎等[29]對水稻中另一個GA受體基因OsGRL1的功能進行了探究，發(fā)現(xiàn)與GID1不同，OsGRL1定位于細胞膜上而非細胞核中，且不受外源GA的誘導，這可能是不同于GID1的調節(jié)機制，OsGRL1基因突變使GA信號轉導通路中抑制基因SLR1的表達下調，提高了突變體對GA敏感性，體表現(xiàn)出穗頸伸長、籽粒變小和千粒重降低的表型。這些證明了受體基因在GA信號轉導中的重要程度，相關基因的低表達會造成種子生長發(fā)育缺陷。

4.2.3 DELLA蛋白相關基因

當GA與GID1結合后進入細胞核內，GA信號通路以DELLAs為中心，可抑制GA依賴的生物過程，是GA信號的負調控因子，E3泛素連接酶參與GA感知和信號轉導，通過泛素26S蛋白酶體途徑降解DELLAs。擬南芥TaGW2-6A可編碼RINGE3泛素連接酶，因此NIL31(TaGW2-6A等位基因變異)中GA生物合成和應答基因的表達量更高，導致GASA4的高表達，通過GA激素途徑控制籽粒灌漿過程中胚乳細胞的伸長和分裂[24]。

5 植物激素間的相互作用

5.1 GA信號通路中DELLA蛋白介導的激素互作

GA在一些花的形成過程中有負調控作用，BR可以在番茄胚珠形成過程中下調赤霉素合成的關鍵蛋白基因GA20ox1，在該過程中對GA的生物合成起反向作用，降低有活性GA水平，減少DELLA蛋白的降解，BR通過這種方式穩(wěn)定DELLA蛋白，使胚珠原基形成[30]。DELLA可與BR信號轉導中的BZR1/BES1相互作用，而且對BZR1的轉錄活性也有抑制作用，BR信號通過促進BZR1與DELLA相互作用來增強GA信號傳導，從而減輕DELLA對GA介導的生長的抑制，建立了DELLAs作為BR和GA之間信號串擾的介質，控制細胞伸長和調節(jié)植物生長[31]。

GA和ABA作為拮抗劑，拮抗調節(jié)種子發(fā)育和萌發(fā)，DELLA，ABI3和ABI5形成蛋白復合物，可以激活種子萌發(fā)的關鍵抑制因子SOM基因的表達，共同介導GA和ABA信號，激活ABA生物合成并抑制GA生物合成[32]。

5.2 IAA相關的激素互作

在植物體內，IAA與CK相互作用，TMO5是生長素直接反應基因，LOG4是編碼CK生物合成過程中的關鍵酶，而LOG4又是TMO5/LHW的直接靶基因，生長素作用于TMO5/LHW后，通過LOG4控制CK生物合成，因此CK可被生長素誘導[11]。此外，TAA1和PIN3可被CK及轉錄因子SPT激活，SPT及CK可能共同促進編碼TAA1和PIN3基因的表達，從而產生對雌蕊生長非常重要的生長素[16]。

生長素信號通路的缺陷可導致種子萌發(fā)過程中ABA修飾的敏感性，ABI4和ABI5是生長素介導的抑制種子萌發(fā)的重要調節(jié)因子，因此ABA抑制生長素介導的種子萌發(fā)[33]。

5.3 BR相關的激素互作

BR和ABA信號通路之間存在復雜的相互作用，Li等[34]證明ABA通過誘導BR合成調控基因OsGSR1的表達來激活BR合成，且ABA僅依賴于ABA信號核心轉錄因子ABI3調控OsGSR1表達，這證明了ABA與BR之間協(xié)同交互作用的存在，并揭示了這一協(xié)同作用部分依賴ABI3-OsGSR1模塊的分子機制。

CK還可以上調BR生物合成(DFW4)和信號轉導(BRI1、BAK1)基因，BR上調IPT，IPT是生物活性CK生物合成的主要酶[35]，同時增加BR和CK含量能提高胚珠數和種子數，BR和CK在種子發(fā)育中表現(xiàn)出正交互作用，這表明BR-CK串擾可能有助于改變源/庫關系，提高作物產量和脅迫響應。

5.4 ET相關的激素互作

乙烯(Ethylene，ET)是一種氣體植物激素，對擬南芥種子萌發(fā)具有拮抗作用，而對GA具有協(xié)同作用。在萌發(fā)過程中，ABA和GA處理對乙烯生物合成的影響主要是通過改變ACO的表達，進而影響乙烯的生物合成，在乙烯生物合成突變體aco2中，由于ACO缺乏，ET的產生受到影響[36]。研究發(fā)現(xiàn)，BR也可能通過誘導擬南芥ACS5基因表達來調節(jié)乙烯生物合成，BR通過增加ACS5的穩(wěn)定性來發(fā)揮轉錄后作用，BR受體BRI1激活BR信號，以劑量依賴的方式控制乙烯生物合成[37]。

從上述激素間的互作關系可以看出，多種激素通過激素信號通路間的互作控制著有關種子多方面的生長發(fā)育，還可以影響其他激素的合成和敏感性，綜合上述調控種子發(fā)育的植物激素互作關系，繪制出了激素間的調控網絡，如圖5所示。

圖5 涉及種子發(fā)育的植物激素互作調控網絡

6 展望

提高作物產量一直是農業(yè)育種中的一個重要目標，根據以上對種子發(fā)育的分子機制和調控網絡的理解，可以使用農藝干預、分子標記輔助選擇及CRISPR/Cas9基因編輯技術等方法，篩選出具有所需改良性狀種子的作物。在此基礎上，先導編輯(Prime Editing)是近年來發(fā)展起來的一種新型CRISPR/Cas衍生的精密基因組編輯技術，其可以在目標位置引入任何堿基轉換[38]，這項技術未來在作物育種上還有很大的應用潛力。

許多國內外學者已經發(fā)現(xiàn)很多參與植物激素代謝途徑的調控基因，認識到了種子的發(fā)育過程絕不是單一激素的作用結果，因此對于激素互作的調控網絡還待繼續(xù)發(fā)掘。此外，在已有的研究中，大多調控基因都參與胚胎及胚乳的發(fā)育，而通過種皮影響種子發(fā)育形態(tài)的調控因子遠沒有胚胎及胚乳多，且發(fā)掘的大多是與作物產量性狀相關的遺傳因子，未來在滿足產量的基礎上，可以將更多的目光投入到提升種子營養(yǎng)的方向上，這將有助于對種子發(fā)育的分子機制展開更深入的研究。