關(guān)鍵詞：Cr（Ⅵ）；寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas sp.）；紅薯淀粉膠囊；包埋菌劑

中圖分類號(hào)：X172；X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）12-2923-12 doi：10.11654/jaes.2023-1105

鉻（Chromium，Cr）及其化合物因具備耐高溫、抗腐蝕、質(zhì)硬和耐磨等特性，被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中[1]。我國(guó)工業(yè)的快速發(fā)展產(chǎn)生了大量的Cr渣，一些Cr渣露天堆放導(dǎo)致部分堆場(chǎng)大量的Cr遷移進(jìn)入土壤和地下水。研究表明，土壤中的Cr污染會(huì)通過(guò)食物鏈或呼吸作用進(jìn)入人體，導(dǎo)致鼻炎、肺結(jié)核、腹瀉、支氣管炎、皮炎等多種疾病，對(duì)人類健康造成嚴(yán)重威脅[2-3]。因此，Cr污染土壤的修復(fù)十分迫切。

目前，Cr（Ⅵ）污染土壤的修復(fù)方法分為異位修復(fù)技術(shù)與原位修復(fù)技術(shù)[4]。其中，異位修復(fù)包括客土法、異位填埋、異位固化、異位土壤淋洗等方法。異位修復(fù)成本高，不利于大規(guī)模開(kāi)展，而且修復(fù)過(guò)程中易造成土壤二次污染[5]。原位修復(fù)技術(shù)主要包括生物修復(fù)、化學(xué)修復(fù)及物理修復(fù)等[6]。其中物理修復(fù)和化學(xué)修復(fù)能耗高、價(jià)格貴，在修復(fù)過(guò)程中常改變土壤的一些物理、化學(xué)及生物特性[7]，且修復(fù)效果隨修復(fù)藥劑的耗損而大幅降低，甚至出現(xiàn)Cr（Ⅵ）返溶現(xiàn)象，治理效果非常不穩(wěn)定。發(fā)展綠色廉價(jià)、環(huán)境友好、可持續(xù)的Cr污染治理技術(shù)尤為迫切。

微生物修復(fù)作為一種原位修復(fù)技術(shù)，具有成本低廉、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)成為土壤修復(fù)技術(shù)新的研究熱點(diǎn)[8]。但場(chǎng)地土壤重金屬污染情況復(fù)雜，場(chǎng)地土壤中一方面存在大量土著競(jìng)爭(zhēng)微生物，另一方面土壤條件惡劣，酸或堿性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏[9]，這些均導(dǎo)致外源微生物難以在場(chǎng)地成功定殖和長(zhǎng)期生存。微生物固定化技術(shù)作為一種保護(hù)微生物的有效手段，可以大幅提升游離菌的場(chǎng)地適應(yīng)性、修復(fù)效率和修復(fù)長(zhǎng)效性。該技術(shù)主要是一種生物可降解的成膜材料包覆固體或液體芯材，使之形成微小粒子的技術(shù)，制得的微膠囊具有改善和提高芯材物質(zhì)外觀及性質(zhì)的能力，能夠保護(hù)囊心物質(zhì)不受外界的影響[10]，這種用于固定微生物的微膠囊又稱為生物微膠囊[11]。

制備生物微膠囊的壁材原料種類多樣。壁材的不同將導(dǎo)致微膠囊對(duì)外界環(huán)境因素具有不同的抗性，進(jìn)而影響到內(nèi)部的微生物活性。目前制作包埋微生物材料的壁材主要是碳水化合物如海藻酸鹽、殼聚糖、菊粉、膳食纖維等[12]。該類壁材形成的孔徑較大、對(duì)酸性環(huán)境敏感、囊壁穩(wěn)定性差、傳質(zhì)差，容易造成水分的過(guò)度丟失，使得干燥后凝膠的硬度變大，對(duì)微生物菌群造成擠壓，導(dǎo)致菌群存活率降低，從而限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。課題組前期開(kāi)發(fā)了一種紅薯淀粉膠囊包埋技術(shù)，該技術(shù)是一種基于固定技術(shù)并結(jié)合膠囊特性的層層固定方法，制備的膠囊具有的三層中空結(jié)構(gòu)，可以為Cr還原微生物提供良好的生長(zhǎng)繁殖微環(huán)境，同時(shí)膠囊壁材為微生物提供了可利用碳源，增強(qiáng)了微生物的生長(zhǎng)和代謝能力。此外，紅薯淀粉為主的壁材傳質(zhì)性能優(yōu)越，污染物Cr可自由進(jìn)出微囊，與囊內(nèi)的微生物反應(yīng)，產(chǎn)物亦可順利排出。但前期僅考察了該包埋菌劑對(duì)Cr（Ⅵ）液體培養(yǎng)基中Cr（Ⅵ）的還原效果，缺少對(duì)土壤污染介質(zhì)修復(fù)效果及修復(fù)后土壤功能及植物種植安全利用研究。本試驗(yàn)的目的為：對(duì)比游離寡養(yǎng)單胞菌和紅薯淀粉膠囊包埋菌的Cr（Ⅵ）去除效率、修復(fù)后土壤主要營(yíng)養(yǎng)周轉(zhuǎn)功能酶的酶活性變化及植物的健康生長(zhǎng)狀況。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自西南科技大學(xué)生命科學(xué)院溫室旁（31°32′N，104°42′E）堆積的砂土。該土壤的基本性質(zhì)為：總Cr含量1.31～1.98 mg·kg^-1，未檢測(cè)出Cr（Ⅵ），有機(jī)質(zhì)含量1.44%～1.70%，陽(yáng)離子交換量2.93～3.21cmol·kg^-1，pH 7.03～8.03。

供試菌劑為課題組前期從青海海北化工廠廢棄的Cr 渣土壤中分離的寡養(yǎng)單胞菌（菌種保藏號(hào)：CCTCC AB 2023023）。將保藏在-80 ℃的寡養(yǎng)單胞菌取出，接種于LB 液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)36 h，4 ℃、200 r·min-1離心10 min，棄上清，收獲菌體。將菌體和生理鹽水（0.9%）按照1∶5（質(zhì)量比）混合后，置于28 ℃、200 r·min^-1 恒溫?fù)u床培養(yǎng)4h，得到供試菌液（OD0.75）。

紅薯淀粉膠囊及包埋菌劑制備：（1）取0.5 g聚乙烯醇121 ℃高壓滅菌15 min；（2）1.5 g骨膠加15 mL去離子水，完全吸收后，置于70 ℃水浴鍋中，攪拌至完全融化；（3）30 g紅薯淀粉過(guò)80目篩，用30 ℃去離子水?dāng)嚢璩绅ず隣睿ㄊ帜蟪尚停凰缮ⅲ唬?）將上述處理過(guò)的紅薯淀粉與骨膠混合，快速攪拌，倒入自制模具（圖1）定型，得到半實(shí)心球體；（5）將水或制備好的供試菌劑用1 mL針管注入到半實(shí)心球體中，得到包封菌劑；（6）將包封菌劑放置于聚乙烯醇中均勻包裹，靜置2～3 h，充分定型，得到紅薯淀粉膠囊或包埋菌劑，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ褂们?，將包埋菌劑放入培養(yǎng)皿中密封，置于28 ℃培養(yǎng)箱中12 h，以活化菌種。

供試植物高羊茅種子購(gòu)自江西新途園林工程有限公司。具體培養(yǎng)方法如下：（1）用5% 的雙氧水對(duì)種子表面消毒1 min 后，用無(wú)菌蒸餾水沖洗5～7 次；（2）將消毒后的種子置于鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中（加3 mL 無(wú)菌水），于植物培養(yǎng)箱（溫度25 ℃，濕度55%，光照/黑暗為16 h/8 h）中萌發(fā)，為了防止種皮長(zhǎng)期浸泡后釋放的物質(zhì)影響種子的萌發(fā)，在萌發(fā)期間每天早晚將種子用無(wú)菌水清洗1次，并加入新鮮的無(wú)菌水；（3）待種子萌發(fā)7 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致且健壯的幼苗定植于1/2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液中，放置在溫室（溫度25 ℃，濕度50%，光強(qiáng)6 000 lx，光照/黑暗為16 h/8 h）進(jìn)行幼苗培養(yǎng)，培養(yǎng)期間每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液，培養(yǎng)1 周后，根據(jù)幼苗的基徑、高度和幼葉數(shù)量，選擇大小、生長(zhǎng)一致的健康幼苗900株，均分后分別移栽到不同處理修復(fù)后的土壤中培養(yǎng)15 d。

1.2 試驗(yàn)處理

盆栽試驗(yàn)于西南科技大學(xué)（31°32′N，104°42′E）溫室大棚中進(jìn)行。將供試土壤的Cr（Ⅵ）含量按照Wu等[13]的方法配制，設(shè)置3個(gè)Cr（Ⅵ）含量（0、30、100mg·kg^-1），每個(gè)含量設(shè)3個(gè)重復(fù)，將配制好的土壤自然狀態(tài)下定期補(bǔ)水，平衡1個(gè)月后，檢測(cè)土壤中的總Cr和Cr（Ⅵ）的含量，其結(jié)果與設(shè)定值基本一致。

將平衡后的土壤經(jīng)10目尼龍網(wǎng)篩篩分后，各取2.5 kg放置在花盆中（花盆底部放置塑料托盤，防止Cr污染物和土壤溶液滲漏損失），設(shè)置4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，分別為：①含0、30、100 mg·kg^-1Cr（Ⅵ）的土壤（分別記為0CK、30CK、100CK）；②裸菌處理（F），寡氧單胞菌，30 mL供試菌劑；③包埋材料處理（MI），紅薯淀粉膠囊，30 g包埋材料；④包埋菌處理（MIF），紅薯淀粉膠囊包埋寡氧單胞菌，30 g包埋材料+供試菌劑。用鋼鏟將各個(gè)花盆中處理后的土壤攪拌均勻，并置于溫室中（光強(qiáng)6 000 lx，光照/黑暗為12 h/12 h，日溫28 ℃，夜溫23 ℃，相對(duì)濕度45%～50%），各個(gè)處理土壤水分維持在50%的田間持水量，土壤處理時(shí)間為1 個(gè)月。在修復(fù)處理的第10 天（前期）、第20天（中期）、第30天（末期），充分翻拌土壤后，于每個(gè)花盆采集10～15 g土壤，采集的土樣置于實(shí)驗(yàn)室自然風(fēng)干，用于土壤pH、總Cr、Cr（Ⅵ）及土壤酶活的測(cè)定。處理第31天，在上述溫室中移栽供試植物高羊茅，培養(yǎng)期間每3 d澆水1次，保持土壤田間持水量50%。種植15 d后，選取第4葉位、健康及完整無(wú)損的葉片測(cè)定其丙二醛、活性氧和抗氧化酶活性。將花盆中土壤用水充分浸泡后，小心移出植物的整個(gè)根系，使用蒸餾水輕柔沖洗植物根部，以去除附著的土壤，收集根部。將新鮮的根及地上部分（莖和葉），包裹在錫箔紙中帶回實(shí)驗(yàn)室供后續(xù)總Cr含量測(cè)定。

1.3 分析方法

1.3.1 土壤總Cr含量測(cè)量

根據(jù)《土壤總鉻的測(cè)定火焰原子吸收分光光度法》（HJ 491—2009）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行土壤干燥、過(guò)篩、消解，土樣過(guò)濾后，使用火焰原子吸收光譜儀測(cè)量溶液中總Cr含量。

1.3.2 土壤Cr（Ⅵ）含量及去除率測(cè)定

根據(jù)《土壤和沉積物六價(jià)鉻的測(cè)定堿溶液提取-火焰原子吸收分光光度法》（HJ 1082—2019）標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)土壤樣品進(jìn)行提取后，抽濾、定容、搖勻、過(guò)濾，使用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀測(cè)量待測(cè)液中的Cr（Ⅵ）。使用公式（1）計(jì)算土壤的Cr（Ⅵ）去除率（R）：

式中：C 為試驗(yàn)處理前土壤中的Cr（Ⅵ）含量；C₁為試驗(yàn)后期土壤樣品中的Cr（Ⅵ）含量。

1.3.3 土壤Cr化學(xué)形態(tài)及pH

使用BCR法[14]連續(xù)分級(jí)提取土樣中各化學(xué)形態(tài)的Cr，按照相應(yīng)步驟提取土壤中的水溶態(tài)（Fws）、酸可提取態(tài)（Fae）、可還原態(tài)（Fre）、可氧化態(tài)（Fox）和殘?jiān)鼞B(tài)（Frs）Cr，并利用原子吸收光譜儀測(cè)定其含量。土壤在蒸餾水中浸提30 min（蒸餾水與土壤的質(zhì)量比為5∶1），在5 000 r·min^-1下離心10 min后用pH 計(jì)測(cè)定土壤pH[15]。

1.3.4 土壤酶活性

采用關(guān)松蔭[16]的方法測(cè)定土壤酶活性。脲酶活性的測(cè)定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，蔗糖酶活性的測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用紫外分光光度法[17]。

1.3.5 高羊茅植物地上、地下部分總Cr測(cè)定

同1.3.1土壤總Cr測(cè)定方法。

1.3.6 植物丙二醛和H₂O₂測(cè)定

采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法[18]測(cè)定高羊茅葉片的丙二醛（MDA）含量；利用分光光度計(jì)測(cè)定離心上清液的OD值，并根據(jù)Jin等[19]的方法測(cè)量高羊茅葉片的H₂O₂含量。

1.3.7 植物酶活性測(cè)定

采用Maehly 等[20]的方法測(cè)定過(guò)氧化物酶（POD）和CAT活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2021 計(jì)算數(shù)據(jù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析（One-way ANOVA）評(píng)價(jià)Cr（Ⅵ）、游離菌、包埋材料、包埋菌處理對(duì)土壤和植物生長(zhǎng)指標(biāo)的影響。統(tǒng)計(jì)分析前，利用SPSS 25.0的Kolmogo?rov-Smirnov檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。如果方差不齊性，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換，保證方差的正態(tài)和同質(zhì)性。當(dāng)方差分析顯示處理間差異顯著時(shí)（Plt;0.05），采用Duncan法進(jìn)行多重比較。使用Origin 2021制圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)對(duì)土壤總Cr含量與Cr（Ⅵ）去除率的影響

低、高Cr（Ⅵ）含量下土壤總Cr含量情況見(jiàn)圖2a、圖2b。分析可知，與CK相比，F(xiàn)處理土壤的總Cr含量隨時(shí)間延長(zhǎng)無(wú)顯著變化，MI、MIF處理土壤的總Cr隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫末期，與CK相比，F(xiàn)處理無(wú)顯著差異，MI處理土壤總Cr顯著降低了41.27%、23.53%，MIF 處理顯著降低了61.18%、36.31%；與F處理相比，MIF處理土壤總Cr分別顯著下降了59.74%和12.46%（Plt;0.05）。

寡氧單胞菌主要通過(guò)胞外聚合物的羥基、羧基、硫基和磷酸基團(tuán)高效吸附Cr[21]，不能分解和轉(zhuǎn)化總Cr為其他物質(zhì)，測(cè)定總Cr之前過(guò)100目篩并不能把裸菌去除，其依然存在于土壤中，因此土壤的總Cr無(wú)明顯變化。但紅薯淀粉包埋菌劑的直徑增大，會(huì)被100目篩網(wǎng)篩出，導(dǎo)致其吸附的總Cr被帶離土壤，從而降低了土壤的總Cr含量，這是本研究中MIF處理總Cr含量下降的原因。

低、高Cr（Ⅵ）含量下（圖2c和圖2d），F(xiàn)處理Cr（Ⅵ）去除率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，與處理初期相比，處理末期分別顯著下降了37.12%、40.12%；MI處理下Cr（Ⅵ）去除率隨時(shí)間的延長(zhǎng)未發(fā)生顯著變化；MIF處理下Cr（Ⅵ）去除率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，與處理初期相比，處理末期分別顯著提高了23.38%、11.38%。處理末期，低含量Cr（Ⅵ）時(shí)，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF 處理下Cr（Ⅵ）去除率分別顯著提升了40.4%、58.78%、85.97%；與F處理相比，MIF處理下Cr（Ⅵ）去除率顯著提高了43.80%。高含量Cr（Ⅵ）時(shí)，與CK 相比，F(xiàn)、MI、MIF 處理下Cr（Ⅵ）去除率分別顯著提高了19.4%、62.78%、78.65%；與F處理相比，MIF處理下Cr（Ⅵ）去除率顯著提高了58.80%（Plt;0.05）。

Cr 污染場(chǎng)地的微生物修復(fù)方面的研究極為有限，且大多僅限于實(shí)驗(yàn)室中。研究發(fā)現(xiàn)，寡養(yǎng)單胞菌對(duì)Cr（Ⅵ）的還原作用主要表現(xiàn)在兩方面：一方面是寡氧單胞菌細(xì)胞表面的官能團(tuán)吸附作用，吸附后的Cr（Ⅵ）在還原酶催化下自發(fā)還原為Cr（Ⅲ），或通過(guò)硫酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞后在胞內(nèi)被還原[22]。另一方面則是寡養(yǎng)單胞菌在土壤中受到Cr（Ⅵ）脅迫后，為建立Cr（Ⅵ）耐受性，產(chǎn)生了Cr（Ⅵ）還原酶并發(fā)生電子轉(zhuǎn)移從而還原土壤中的Cr（Ⅵ）[23]。然而，針對(duì)實(shí)際Cr污染場(chǎng)地，添加外源微生物，其自身種群的存活或消亡以及是否保留對(duì)重金屬的耐受性，取決于非生物因素以及生物因素[24]。因非生物因素難以控制，外源微生物進(jìn)入土壤后的群落豐度及其功能也隨之具有不確定性。低、高含量的Cr（Ⅵ）污染土壤中，游離菌（F處理）的Cr（Ⅵ）去除能力呈現(xiàn)出初期增加、中后期降低的趨勢(shì)，表明游離的寡養(yǎng)單胞菌對(duì)土壤Cr（Ⅵ）的去除能力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減弱，而包埋菌（MIF處理）對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加，這可能是因?yàn)榫鷦┩鈬竦募t薯淀粉具有多孔結(jié)構(gòu)、較大的比表面積及碳源供給能力，可為內(nèi)部微生物的生長(zhǎng)和繁殖提供生長(zhǎng)吸附位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)等有利條件，增加了其生長(zhǎng)和代謝活性，進(jìn)而增強(qiáng)了對(duì)Cr（Ⅵ）的修復(fù)效率。此外，紅薯淀粉（MI處理）本身也具有Cr（Ⅵ）吸附和還原能力（圖2），這與張麗等[25]的研究一致。

2.2 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)對(duì)Cr（Ⅵ）污染土壤酶活性的影響

土壤酶在土壤污染物的解毒與代謝方面起著重要作用，是評(píng)價(jià)土壤健康的重要指標(biāo)[26]。Cr（Ⅵ）污染會(huì)抑制土壤中的酶活性，因此土壤酶活性可以作為衡量Cr（Ⅵ）修復(fù)效果的指標(biāo)之一[23]。

2.2.1 脲酶

分析可知，低、高含量Cr（Ⅵ）污染土壤（圖3）中，F(xiàn)處理下的脲酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，與該處理的初期相比，末期分別顯著下降了0.05、0.04 mg·g^-1·d^-1；MI處理下的脲酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化；MIF處理脲酶活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，與該處理的初期相比，末期分別上升了0.04、0.09 mg·g^-1·d^-1。在處理末期，與CK相比，低含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF處理的脲酶活性分別顯著提高了0.04、0.08、0.13 mg·g-1·d^-1，與F處理相比，MIF處理脲酶活性顯著增加了0.09 mg·g^-1·d^-1；高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理下的脲酶活性分別顯著上升了0.02、0.03、0.17 mg·g^-1·d^-1，與F處理相比，MIF處理下的脲酶活性顯著增加了0.15 mg·g^-1·d^-1（Plt;0.05）。

2.2.2蔗糖酶

蔗糖酶是影響糖類生理代謝的一種重要酶，能夠促進(jìn)土壤中的蔗糖水解成單糖，給土壤中的微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是檢測(cè)重金屬污染程度的一種間接生物指示劑[27]。土壤中蔗糖酶活性變化規(guī)律與脲酶變化規(guī)律基本一致。分析可知，低、高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中（圖4），F(xiàn)處理下的蔗糖酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，與該處理的初期相比，末期分別下降了16.93、15.42 mg·g^-1·d^-1；MI處理下的蔗糖酶活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化；MIF處理蔗糖酶活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，與該處理的初期相比，末期分別上升了12.18、9.32 mg·g^-1·d^-1。在處理末期，與CK 相比，低含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF處理的蔗糖酶活性分別顯著提高了11.33、23.68、32.20 mg·g^-1·d^-1，與F 處理相比，MIF 處理蔗糖酶活性顯著增加了20.87 mg·g^-1·d^-1；高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理下的蔗糖酶活性分別顯著上升了9.91、18.31、34.43 mg·g^-1·d^-1，與F處理相比，MIF處理下的蔗糖酶活性顯著增加了24.52 mg·g-1·d^-1（Plt;0.05）。

2.2.3 過(guò)氧化氫酶

土壤中CAT活性變化與上述兩種土壤酶的變化情況基本一致。分析可知，低、高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中（圖5），F(xiàn)處理下的CAT活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，與該處理的初期相比，末期分別下降了0.31、0.29 mg·g^-1·h^-1；MI處理下的CAT活性隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)變化趨勢(shì)；MIF處理CAT活性隨時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，與該處理的初期相比，末期分別上升了0.60、0.65mg·g-1·h^-1。在處理末期，與CK相比，低含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理的CAT 活性分別顯著提高了0.70、0.57和1.83 mg·g^-1·h^-1，與F處理相比，MIF處理CAT活性顯著增加了1.13 mg·h-1·g^-1；高含量Cr（Ⅵ）污染土壤中F、MI、MIF 處理下的CAT 活性分別顯著上升了0.64、0.63、1.74 mg·h^-1·g^-1，與F 處理相比，MIF 處理下的CAT 活性顯著增加了1.11 mg·g-1·h^-1（Plt;0.05）。

土壤酶是微生物、植物根系、土壤動(dòng)物分泌或釋放的具有催化活性的蛋白質(zhì)，其參與有機(jī)質(zhì)分解、土壤微生物能量和營(yíng)養(yǎng)獲取、污染物降解等重要的生態(tài)過(guò)程[28]，因此，土壤酶活性是土壤質(zhì)量的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)，通常用來(lái)表征土壤重金屬修復(fù)效果。本研究結(jié)果表明，土壤添加30 mg·kg^-1和100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）后，其脲酶、蔗糖酶、CAT活性都大幅度下降，這是由于重金屬對(duì)土壤酶活性存在著抑制作用[29]。以往許多的研究表明，使用微生物菌劑都會(huì)影響土壤酶的活性。土壤微生物數(shù)量與土壤酶具有顯著的相關(guān)性，微生物數(shù)量的增多能夠改善土壤酶活性，從而提高土壤養(yǎng)分循環(huán)速率，土壤也隨之朝著良好健康的狀態(tài)發(fā)展[30]。與低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫的對(duì)照土壤相比，F(xiàn)處理土壤的脲酶、蔗糖酶、CAT的活性在試驗(yàn)初期上升，中后期下降。這可能與寡養(yǎng)單胞菌直接暴露在Cr（Ⅵ）中，隨時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)外受到Cr（Ⅵ）脅迫，致使寡養(yǎng)單胞菌生長(zhǎng)代謝變慢并導(dǎo)致其對(duì)Cr（Ⅵ）的強(qiáng)還原力[31]減弱有關(guān)。而與F處理相比，MIF處理下的脲酶、蔗糖酶、CAT活性顯著增加，且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)上升。這可能是由于紅薯淀粉可以供給多糖[32]，給包埋在體內(nèi)的寡養(yǎng)單胞菌在一定時(shí)間內(nèi)提供一定的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及生存空間，從而保護(hù)和支持寡養(yǎng)單胞菌的活性，使其發(fā)揮出最大程度的修復(fù)能力。除此之外，包埋材料紅薯淀粉基本組成單位是脫水葡萄糖殘基[33]，因糖苷鍵和共價(jià)鍵水解斷裂產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)移會(huì)有效地還原Cr（Ⅵ），這也是目前被證實(shí)的有機(jī)物的還原方式[34]。Cr（Ⅵ）先與小分子淀粉發(fā)生雙電子轉(zhuǎn)移，生成Cr（Ⅳ），C—C 鍵斷裂，發(fā)生單電子轉(zhuǎn)移，生成Cr（Ⅲ），Cr（Ⅲ）又與土壤中一部分OH^-作用產(chǎn)生Cr（OH）₃[18，35]，降低Cr（Ⅵ）的生物有效性，從而提高土壤酶的活性。這與下文中MI與MIF處理下，Cr的水溶態(tài)和酸可提取態(tài)占比減少的結(jié)果一致。綜上所述，MIF處理可以增強(qiáng)包埋菌的活性與修復(fù)能力，其包埋材料也有還原Cr（Ⅵ）的能力，以此提高Cr污染土壤酶活性，改善土壤環(huán)境。

2.3 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤對(duì)土壤pH和Cr形態(tài)變化的影響

土壤pH是土壤理化性質(zhì)的重要指標(biāo)之一，對(duì)土壤所含養(yǎng)分形態(tài)以及有效性具有重要影響。從表1可見(jiàn)，在30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下，土壤pH顯著降低，土壤呈弱酸性。在低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫的后期，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理pH顯著增加了0.91、0.81、1.46和0.97、0.84、1.46；與F處理相比，MIF處理pH顯著增加了0.55和0.49（Plt;0.05）。

環(huán)境中不同賦存形態(tài)Cr的遷移性和生物毒性存在很大差異。水溶態(tài)和酸可提取態(tài)屬于可交換態(tài)，易被生物吸收；可還原態(tài)能與鐵錳等氧化物結(jié)合，生物毒性較低；可氧化態(tài)可與有機(jī)物和硫化物結(jié)合，生物毒性很低；殘?jiān)鼞B(tài)穩(wěn)定存在于土壤中，對(duì)環(huán)境的威脅最小也不容易被生物利用[36]。在低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下（圖6），F(xiàn) 處理的可交換態(tài)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，分別增加了7.33%、10.17%；MI 處理的可交換態(tài)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，分別減少了9.34%、10.74%；MIF處理的可交換態(tài)含量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，分別減少了14.32%、33.18%。在處理末期，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF中可交換態(tài)的占比分別減少了19.11%、23.26%、45.54%和16.11%、28.18%、59.42%；與F處理相比，MIF處理下，Cr的可交換態(tài)分別減少了26.43%、43.31%。整個(gè)處理過(guò)程中，可還原態(tài)Cr在所有處理中的占比均無(wú)明顯變化。

F處理的可氧化態(tài)占比隨時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下分別減少了9.18%、2.02%；MI 處理的可氧化態(tài)在低Cr（Ⅵ）脅迫下隨時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有明顯變化，在高Cr（Ⅵ）脅迫下隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加了4.63%；MIF處理的可氧化態(tài)占比隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減小，低、高Cr（Ⅵ）含量下分別減少了13.58%、9.49%。在處理末期，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF中可氧化態(tài)的占比分別減少了8.775%、6.765%、8.69%和7.775%、13.585%、21.68%；與F處理相比，在低Cr（Ⅵ）脅迫下，MIF 處理的Cr可氧化態(tài)沒(méi)有顯著差異，而在高Cr（Ⅵ）脅迫下，Cr 可氧化態(tài)增加了13.91%。低Cr（Ⅵ）脅迫下，F(xiàn)處理的殘?jiān)鼞B(tài)占比隨時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)明顯變化，高Cr（Ⅵ）脅迫下，隨時(shí)間的延長(zhǎng)而減少了8.97%；MI、MIF 處理的殘?jiān)鼞B(tài)占比均隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下分別增加了12.23%、26.25% 和6.93%、25.79%。在處理末期，與CK 相比，低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下F、MI、MIF中殘?jiān)鼞B(tài)的占比分別增加了9.07%、17.21%、36.44%和8.08%、15.74%、38.17%；與F 處理相比，MIF 處理下，Cr的殘?jiān)鼞B(tài)占比分別增加了19.26%、30.09%。

趙少婷等[37]的研究表明，在未受Cr 污染和輕度Cr污染的土壤中，Cr主要以殘?jiān)鼞B(tài)存在，而在Cr污染嚴(yán)重的土壤中，則主要以水溶態(tài)和酸可提取態(tài)存在，這與本研究結(jié)論一致。土壤pH是影響重金屬吸附-解吸行為和生物有效性的關(guān)鍵因素[38]，F(xiàn)、MI、MIF處理下土壤的pH 值均呈弱堿性（表1），這有效降低了土壤中水溶態(tài)和酸可提取態(tài)的含量（圖6）[39-40]，表明3種處理均會(huì)影響土壤的pH 值，進(jìn)而影響Cr 形態(tài)變化。此外，包埋壁材紅薯淀粉的糖苷鍵和共價(jià)鍵被土壤中的微生物水解可斷裂產(chǎn)生電子和OH-，電子加速Cr（Ⅵ）還原為Cr（Ⅲ），產(chǎn)生的OH-與Cr（Ⅲ）作用，形成的Cr（OH）₃ 穩(wěn)定化合物也有助于降低土壤中水溶態(tài)Cr和酸可提取態(tài)Cr的占比[33]。F處理和MIF處理也均可以通過(guò)生物還原途徑，增加土壤中生物可利用性強(qiáng)的Cr（Ⅵ）向生物可利用性弱的Cr（Ⅲ）轉(zhuǎn)化，并通過(guò)土壤pH的變化沉淀Cr（Ⅲ），從而助力了土壤中可水溶態(tài)Cr和酸可提取態(tài)Cr占比的下降及殘?jiān)鼞B(tài)Cr的上升。

2.4 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤后對(duì)高羊茅地上、地下部分總Cr含量的影響

在低（圖7a、圖7c）、高（圖7b、圖7d）含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理下的高羊茅地上部分總Cr 含量分別顯著降低了2.02、3.60、5.92 mg·kg^-1和7.40、10.60、19.57 mg·kg^-1，地下部分總Cr含量分別顯著降低了16.80、24.10、30.80 mg·kg^-1和44.08、47.98、59.53 mg·kg^-1。低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與F處理相比，MIF處理后的高羊茅地上部分、地下部分的總Cr 含量分別顯著減少了3.90、14.00 mg·kg^-1 和12.17、18.45 mg·kg^-1（Plt;0.05）。

高羊茅是一種常見(jiàn)的多年生冷季型草坪草，也是溫帶地區(qū)重要的禾草類牧草。趙樹(shù)蘭等[41]研究發(fā)現(xiàn)高羊茅根系和莖葉具有富集重金屬的能力；Zhu等[42]的研究發(fā)現(xiàn)，土壤中生長(zhǎng)的高羊茅對(duì)重金屬具有耐受能力和吸收能力。本試驗(yàn)中，利用高羊茅評(píng)估不同處理對(duì)Cr（Ⅵ）污染土壤修復(fù)效果表明，在低含量與高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理之后的高羊茅地上、地下部總Cr含量均顯著降低，且MIF處理下植物地上和地下部總Cr含量最低，這與上述土壤中Cr形態(tài)差異變化一致。紅薯淀粉膠囊包埋寡養(yǎng)單胞菌有效地降低了土壤中Cr的可交換態(tài)含量，降低了Cr向植物轉(zhuǎn)移的能力。

2.5 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤后對(duì)高羊茅葉片中丙二醛和活性氧含量（以鮮質(zhì)量計(jì)）的影響

在植物的非生物脅迫研究中常用活性氧和MDA含量來(lái)反映植物細(xì)胞膜脂過(guò)氧化損傷程度，且兩者含量常與脅迫強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系（圖8）。與CK相比，30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下高羊茅H₂O₂含量分別增加18.82、35.52 μmol·mg^-1，MDA 含量分別增加了2.82、7.523 μmol·g^-1。在低、高含量Cr（Ⅵ）脅迫下，與CK相比，F(xiàn)、MI、MIF處理下H₂O₂含量分別顯著降低了10.70、6.37、14.76 μmol· mg^-1 和19.74、16.48、26.14μmol·mg^-1，MDA含量分別顯著降低了1.50、0.97、2.22μmol·g^-1和4.74、3.48、6.14 μmol·g^-1。與F處理相比，MIF處理高羊茅地上部分中H₂O₂含量分別顯著降低了4.06、6.40 μmol·mg^-1，MDA含量分別顯著降低了0.72、1.40 μmol·g^-1（Plt;0.05）。結(jié)果表明，Cr（Ⅵ）含量越高，高羊茅地上部分累積的H₂O₂和MDA越多，與F處理相比，MIF 處理更有效地降低了高羊茅H₂O₂和MDA 的累積。

2.6 紅薯淀粉膠囊包埋微生物修復(fù)Cr（Ⅵ）污染土壤后對(duì)高羊茅葉片中抗氧化酶含量（以鮮質(zhì)量計(jì)）的影響

植物生長(zhǎng)過(guò)程中，細(xì)胞產(chǎn)生活性氧作為信號(hào)分子調(diào)控植物受到的非生物脅迫反應(yīng)[43]?？寡趸烙到y(tǒng)具有維持植物體內(nèi)活性氧平衡的功能[44]。該系統(tǒng)包括兩大類：一類是非酶促抗氧化物質(zhì)，其中最為重要的是水溶性抗壞血酸（Asc），其次是谷胱甘肽（GSH）；另一類是酶促抗氧化劑，包括超氧化物歧化酶（SOD）、POD和CAT[45]。植物抗氧化調(diào)控系統(tǒng)中提高酶活性和抗氧化物的表達(dá)量是作物抵御逆境脅迫的關(guān)鍵（圖9）。與CK相比，30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫顯著增加了高羊茅POD 和CAT活性，POD 活性分別顯著增加19.02、34.13 μg^-1·min^-1；CAT活性分別顯著增加了9.44、19.45 μg^-1·min^-1。在低、高Cr（Ⅵ）含量脅迫下，與CK處理相比，F(xiàn)、MI、MIF處理下POD活性分別顯著降低了8.69、4.20、13.44 μg^-1 ·min^-1 和9.81、5.55、14.21 μg^-1·min^-1；CAT 活性分別顯著降低了5.39、3.16、7.39 μg^-1·min^-1 和5.77、3.41、9.17 μg^-1·min^-1。與F 處理相比，MIF 處理高羊茅地上部分中POD活性分別顯著降低了4.75、4.40 μg^-1·min^-1，CAT活性分別顯著降低了2.01、3.40 μg^-1·min^-1（Plt;0.05）。

在植物正常的生理代謝過(guò)程中，植物細(xì)胞通過(guò)實(shí)時(shí)生成和清除活性氧來(lái)維持細(xì)胞ROS的動(dòng)態(tài)平衡[46]，而重金屬脅迫會(huì)打破植物體內(nèi)的這種平衡，導(dǎo)致MDA 和H₂O₂ 的累積[47]。本研究中，Cr（Ⅵ）含量增高會(huì)導(dǎo)致高羊茅地上部分的H₂O₂ 和MDA 含量顯著上升，再通過(guò)POD 和CAT等抗氧化系統(tǒng)聯(lián)合抵抗重金屬脅迫[48]。其中，MDA 和H₂O₂ 的累積與抗氧化系統(tǒng)的酶活性從高到低為MIgt;Fgt;MIF，表明游離的寡養(yǎng)單胞菌和紅薯淀粉材料本身不但具有降低土壤毒性的能力，還能緩解高羊茅受到的重金屬脅迫，因此紅薯淀粉膠囊包埋寡養(yǎng)單胞菌修復(fù)的效果更佳。

3 結(jié)論

（1）在30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下，與游離菌處理相比，包埋菌在處理后期呈現(xiàn)出顯著高的Cr（Ⅵ）去除率。

（2）在30、100 mg·kg^-1 Cr（Ⅵ）脅迫下，相較于游離菌處理，包埋菌處理顯著提升了土壤脲酶、蔗糖酶及過(guò)氧化氫酶的活性，并隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，表明包埋型菌劑處理后土壤的功能性酶活性有了明顯的恢復(fù)。

（3）包埋菌處理顯著增加了土壤pH，減少了土壤中水溶態(tài)Cr的比例，增加了土壤中殘?jiān)鼞B(tài)Cr的占比。

（4）Cr（Ⅵ）污染土壤修復(fù)30d后，種植高羊茅15d，與游離菌處理相比，包埋菌處理下，高羊茅植株的地上和地下部分的Cr含量顯著降低。同時(shí)，高羊茅葉片中的丙二醛、過(guò)氧化氫含量及過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶活性也顯著減少，表明包埋菌處理顯著降低了Cr（Ⅵ）在高羊茅體內(nèi)的累積及對(duì)其的氧化損傷。