李欣媛，楊鳳妍，呂厚姣，耿偉濤，王艷萍*

（天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

益生菌是一類達到一定數(shù)量時能夠維持人體腸道菌群平衡，保護宿主健康的活性微生物[1-3]。乳酸菌在益生菌中扮演著重要角色，它們能夠利用碳水化合物產(chǎn)生乳酸[4]，有助于蛋白質(zhì)和鈣的吸收，從而預(yù)防疾病[5]。1857年，法國微生物學(xué)家LOUIS PASTEUR首次發(fā)現(xiàn)乳酸菌，這標志著乳酸菌的出現(xiàn)[6]。之后越來越多的科學(xué)家開始專注研究乳酸菌，以期能夠為人類帶來更好的健康效果。產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）屬于乳桿菌科（Lactobacteriaceae），乳桿菌屬（Lactobacillus），呈長桿狀的革蘭氏陽性菌[7]，包含兩個亞種，其中產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種于2021年被國家衛(wèi)健委列為國家新食品原料[8]，該亞種兼性厭氧且具有高產(chǎn)胞外多糖的生物學(xué)特性及抗氧化、抗腫瘤、抗過敏、改善腸道健康、免疫調(diào)節(jié)等益生功能，具有潛在應(yīng)用價值[9]。此前，本實驗室對西藏開菲爾粒的微生態(tài)組成進行了多年研究，并從中分離出多株產(chǎn)馬乳酒乳桿菌，前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其中產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）ZW3可以黏附在小鼠腸道上并產(chǎn)生有益菌群[10]，通過腦腸軸調(diào)節(jié)色氨酸代謝緩解小鼠抑郁[11]。前期研究還發(fā)現(xiàn)，Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciensZW18有很好的免疫調(diào)節(jié)能力等益生特性。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，基因組測序為全面系統(tǒng)地認識乳酸菌提供了方便[12]，并為預(yù)測乳酸菌的功能提供幫助[13-14]。

為了深入研究該種屬菌的特性及差異性，本研究對產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）ZW18的全基因組進行測序和分析，與親緣菌株進行比較，并且發(fā)掘益生作用的相關(guān)基因，為其深入研究和進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefiranofaciens）ZW18：保藏于天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室，美國國立生物技術(shù)信息中心（national venter for biotechnology information，NCBI）登錄號為CP123735。

產(chǎn)馬乳酒乳桿菌高加索酸奶粒亞種（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefirgranum）、產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）、瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）等57株乳桿菌的全基因組序列均下載于NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS液體培養(yǎng)基：牛肉膏10.0 g，葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母膏5.0 g，氯化鈉5.0 g，檸檬酸氫二胺2.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，吐溫-80 1.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.2～6.4。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。MRS固體培養(yǎng)基在MRS液體培養(yǎng)基中加入2%瓊脂粉。

1.1.3 試劑

液氮：天津市軍糧城常福氣體有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Anaerobox Ⅳ厭氧培養(yǎng)箱：美國GeneScience公司；3-18K冷凍離心機：德國SIGMA公司；Nanopore測序儀：牛津納米孔科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株ZW18的活化與培養(yǎng)

挑取-80 ℃冰箱凍存管的菌株ZW18于MRS固體培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃厭氧培養(yǎng)活化，至菌落長出；挑取單菌落于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，以2%（V/V）接種量接種于新鮮MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，室溫下14 000 r/min離心1 min，菌體沉淀于液氮中速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃儲存以供后續(xù)測序。

1.3.2 全基因組測序

將樣品交由北京百邁客生物科技有限公司進行高通量測序。細菌基因組完成圖基于Illumina二代測序以及Oxford Nanopore三代測序平臺實現(xiàn)完整組裝，獲得全面的基因組信息。

1.3.3 生物信息分析

通過軟件Prodigal v2.6.3[15]進行基因預(yù)測；采用軟件Infernal v1.1.3[16]預(yù)測基因組中的三類核糖體核酸（ribosomal ribonucleic acid，rRNA）；采用tRNAscan-SE v2.0[17]高精確預(yù)測基因組中的轉(zhuǎn)運核糖核酸（transfer RNA，tRNA）；采用CRISPR Recognition Tool對基因組進行CRISPR預(yù)測；采用軟件BPGA構(gòu)建系統(tǒng)進化樹；利用在線注釋軟件Ortho Venn 2（https：//orthovenn2.bioinfotoolkits.net/home）分析核心基因組、獨特基因。使用基本局部比對搜索工具（basic local comparison search tool，BLAST）將預(yù)測得到的編碼基因蛋白序列與公共蛋白數(shù)據(jù)庫進行比對，如基因本體（gene ontology，GO）、基因的進化譜系：非監(jiān)督直系群數(shù)據(jù)庫（evolutionary genealogy of genes：non-supervised orthologous groups database，eggNOG）、京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）等，獲得編碼基因的功能信息；采用在線注釋網(wǎng)站RAST（https：//rast.nmpdr.org/）進行全基因組功能基因注釋。使用Circos v0.66[18]完成全基因組精細圈圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株ZW18基因組基本特征

為了更加全面直觀的描述菌株ZW18基本特征，通過軟件Circos v0.66制作基因組圈圖，結(jié)果見圖1。

圖1 產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種ZW18基因組圈圖Fig.1 Genome diagram of Lactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciens

由圖1可知，經(jīng)全基因組測序和組裝，菌株ZW18基因組共有一個完整閉合的染色體和兩個質(zhì)粒，全長為2 438 418 bp，鳥嘌呤（guanine，G）胞嘧啶（cytosine，C）含量為37.27%。菌株ZW18中編碼tRNA基因64個，rRNA基因12個，共預(yù)測到11個潛在CRISPR序列，其中9個分布在染色體中，2個在質(zhì)粒2中。菌株ZW18在GO、eggNOG和KEGG數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果統(tǒng)計見圖2。由圖2A可知，通過GO數(shù)據(jù)庫共注釋到的基因個數(shù)為1 843個，其中與細胞膜構(gòu)建、參與催化反應(yīng)及代謝相關(guān)基因占比最多；由圖2B可知，通過eggNOG數(shù)據(jù)庫注釋可得關(guān)于細胞復(fù)制、重組和修復(fù)基因數(shù)量最多，其次為碳水化合物的利用與一般功能預(yù)測相關(guān)基因，分別為273個、175個、162個；由圖2C可知，通過KEGG數(shù)據(jù)庫注釋，菌株ZW18中ABC轉(zhuǎn)運蛋白數(shù)量最多，能夠把代謝物、藥物和各種毒素從細胞中轉(zhuǎn)運出來，維持細胞穩(wěn)態(tài)。

圖2 GO數(shù)據(jù)庫（A）、eggNOG數(shù)據(jù)庫（B）、KEGG數(shù)據(jù)庫（C）基因注釋統(tǒng)計結(jié)果Fig.2 Statistical results of gene annotation in GO database (A),eggNOG database (B), and KEGG database (C)

2.2 全基因組比較分析

2.2.1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

為了確定近緣菌株，根據(jù)核心基因序列，利用基因組比較平臺BPGA對菌株ZW18及其他57株乳桿菌進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖3。由圖3可知，菌株ZW18與產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種ZW3、產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）ATCC 43761、產(chǎn)馬乳酒乳桿菌高加索酸奶粒亞種（Lactobacillus kefiranofacienssubsp.kefirgranum）DSM 10550及產(chǎn)馬乳酒乳桿菌（Lactobacillus kefiranofaciens）1207遺傳距離最近。除此之外與其較近的還有瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、卷曲乳桿菌（Lactobacillus crispatus）與嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）。

圖3 基于核心基因序列構(gòu)建菌株ZW18的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain ZW18 constructed based on the core gene sequences

2.2.2 核心基因組與獨特基因分析

利用在線注釋軟件OrthoVenn2選取與菌株ZW18遺傳距離較近的產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種ZW3、產(chǎn)馬乳酒乳桿菌ATCC 43761、產(chǎn)馬乳酒乳桿菌高加索酸奶粒亞種DSM 10550及產(chǎn)馬乳酒乳桿菌1207進行全基因組序列比對，結(jié)果見圖4。核心基因組指在所有個體中都存在的基因且非常保守。由圖4可知，這5株產(chǎn)馬乳酒乳桿菌共有的核心基因家族為1 553個。菌株ZW18的獨特基因數(shù)量最多，有30個，說明菌株ZW18更具有多樣性，有更多研究價值。

圖4 核心基因組和獨特基因Venn圖Fig.4 Venn diagram of core genome and specific genes

2.3 益生功能相關(guān)基因分析

2.3.1 與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因分析

在菌株ZW18中共注釋出19種與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的基因，具體結(jié)果見表1。

表1 菌株ZW18中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)主要基因分析結(jié)果Table 1 Analysis results of major genes related to stress response in strain ZW18

由表1可知，菌株ZW18中與氧化應(yīng)激相關(guān)的基因有12種。烷基過氧化氫還原酶（alkyl hydroperoxide reductase）是分布在原核生物和真核生物中的一大家族硫醇特異性抗氧化蛋白的關(guān)鍵成分[19]。非特異性脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）結(jié)合蛋白Dps屬于鐵蛋白超家族，通過氧化和儲存鐵可以有效去除H2O2和Fe2+的毒性，保護DNA、蛋白質(zhì)和膜脂免受自由基損害[20]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）過氧化物酶能夠使菌株抵抗過氧化氫等的毒性，保護細胞生長[21]。Sir2蛋白在維持細胞抗脅迫能力、基因組穩(wěn)定性等方面起重要作用[22]。除抵抗氧化應(yīng)激外，菌株ZW18中還含有6種熱休克、1種冷休克相關(guān)蛋白基因，幫助菌體抵御外界環(huán)境不良刺激。

2.3.2 與胃腸道耐受相關(guān)基因分析

人體胃腸道（gastrointestinal tract，GIT）具有許多防御機制來阻止病原體定植，包括胃酸和腸液，在保護機體、抵抗病原菌侵染方面起重要作用，同時也是考驗益生菌能否在腸道中起作用的關(guān)鍵[23]。因此，對菌株ZW18基因組中與胃腸應(yīng)激耐受性相關(guān)基因進行挖掘，結(jié)果見表2。由表2可知，菌株ZW18基因組中含有大量有助于細菌耐酸、耐膽鹽的基因，表明該菌株有能力對胃腸道中的應(yīng)激做出反應(yīng)。F（1）F（0）-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成酶（F（1）F（0）-ATP synthetase）是重要的耐酸相關(guān)酶，活性隨環(huán)境pH降低而增加。當(dāng)pH下降時，F(xiàn)（1）F（0）-ATP合成酶會利用水解ATP的方式將H+從細胞內(nèi)泵出以保持pH的平衡，同時保證細胞內(nèi)正常代謝，從而在較低的pH環(huán)境下繼續(xù)生長并產(chǎn)生有益的物質(zhì)[24]。Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白在維持細胞pH穩(wěn)態(tài)和Na+動態(tài)平衡中起重要作用，利用該Na+外排系統(tǒng)能夠?qū)⒍嘤郚a+排至胞外從而維持細胞內(nèi)外滲透壓平衡[25]。在菌株ZW18中也發(fā)現(xiàn)了兩個膽酰甘氨酸水解酶基因和兩個膽鹽轉(zhuǎn)運蛋白基因。膽酰甘氨酸水解酶是一種膽鹽水解酶，具有去交聯(lián)膽鹽的能力，被認為具有解除膽鹽毒性的作用，延長菌體在腸道中的生存時間[26]。

表2 菌株ZW18中與胃腸應(yīng)激耐受性相關(guān)基因分析結(jié)果Table 2 Analysis results of genes related to gastrointestinal stress tolerance in strain ZW18

2.3.3 與黏附和聚集相關(guān)蛋白質(zhì)基因分析

益生菌對腸上皮細胞的黏附能力是其發(fā)揮益生作用的首要標準，黏附能力強的菌株更容易在腸道中停留，同時競爭性地排除有害病原體[27]。菌株ZW18基因組中與黏附和聚集相關(guān)的多種蛋白基因預(yù)測結(jié)果見表3。由表3可知，ZW18基因組中預(yù)測出7種與黏附和聚集相關(guān)的蛋白質(zhì)基因。烯醇化酶在多種細菌表面上普遍存在，能夠有效促進細菌與宿主之間的結(jié)合，增強細菌黏附力[28]；纖維連接蛋白結(jié)合蛋白是一種重要的多結(jié)構(gòu)域糖蛋白，具有多種黏附特性[29]；S-層蛋白存在于乳桿菌中，能夠增強菌株黏附力，抵御致病菌入侵宿主[30]；LPxTG細胞壁錨定結(jié)構(gòu)域蛋白可以增加菌株黏附率，在一定程度上可以引起免疫細胞的響應(yīng)，進而調(diào)節(jié)腸道炎癥[31]。

2.3.4 與免疫相關(guān)特性基因分析

益生菌由于其黏附特性和競爭性抑制病原菌的能力使得腸道內(nèi)含有大量益生菌群，對營養(yǎng)物質(zhì)的攝入、疾病治療等具有調(diào)節(jié)作用[32]。前期研究發(fā)現(xiàn)，菌株ZW18中具有多種黏附蛋白、細菌素和抵抗應(yīng)激反應(yīng)的基因。這些益生基因能夠幫助菌株定植于腸上皮細胞，抑制病原菌，對人體腸道進行免疫調(diào)節(jié)[33]。除此之外，菌株ZW18基因組中預(yù)測出胞外蛋白基因（GE001482、GE002271）。據(jù)文獻報道，這些基因可以輔助腸上皮細胞與免疫細胞相互作用，促進細胞因子的分泌[34]。前期研究也發(fā)現(xiàn)，菌株ZW18具有免疫輔助治療小鼠黑色素瘤的效果[35]。

2.3.5 與細菌素相關(guān)特性基因分析

細菌素是細菌在代謝過程中分泌的一種小分子抗菌肽，對其自身往往無抑制作用，卻能夠抑制其他相近種屬菌株生長[36]。細菌素?zé)o毒且抑菌作用強，是胃腸道中抑制病原菌的關(guān)鍵物質(zhì)，可作為抗菌材料，具有較好的開發(fā)利用價值。因此，對菌株ZW18基因組中與細菌素相關(guān)特性基因進行分析，結(jié)果見表4。由表4可知，菌株ZW18中共預(yù)測出5種與細菌素相關(guān)的基因，包括羊毛硫細菌素Class-Ⅳ、腸菌素A、瑞士乳桿菌素J同源物及細菌素免疫蛋白，其中，羊毛硫細菌素Class-Ⅳ數(shù)量最多，共69個。

2.4 菌株ZW18合成營養(yǎng)物質(zhì)相關(guān)基因分析

益生菌的營養(yǎng)合成（維生素和必需氨基酸）正成為新型發(fā)酵食品的一個研究熱點。維生素是人體生理反應(yīng)中重要的微量營養(yǎng)素，維生素缺乏會增加患傳染病、過敏性疾病和炎癥性疾病的風(fēng)險[37]。對菌株ZW18基因組中與維生素合成的相關(guān)基因進行預(yù)測，結(jié)果見表5。由表5可知，在菌株ZW18基因組中預(yù)測到34種與維生素合成相關(guān)的基因，分別與硫胺素、核黃素、吡哆醇、生物素和葉酸合成有關(guān)。

表5 菌株ZW18中與合成維生素相關(guān)基因分析結(jié)果Table 5 Analysis results of genes related to synthetic vitamins in strain ZW18

人體需要從食物中攝取的8種必需氨基酸為異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸[38]，而半胱氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸是對嬰兒和正在成長中的兒童很重要的4種氨基酸[39]。對菌株ZW18基因組中與合成氨基酸相關(guān)的基因進行預(yù)測，結(jié)果見表6。由表6可知，從菌株ZW18基因組中共預(yù)測到24種與氨基酸合成相關(guān)的基因，分別與精氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、賴氨酸生物合成有關(guān)。

表6 菌株ZW18中與合成氨基酸相關(guān)基因分析結(jié)果Table 6 Analysis results of genes related to synthetic amino acids in strain ZW18

3 結(jié)論

通過對產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種ZW18進行全基因組測序可得其基因組中共有一個完整閉合的染色體和兩個質(zhì)粒，全長為2 438 418 bp，GC含量為37.27%。通過數(shù)據(jù)庫注釋可知其生長穩(wěn)定且對碳水化合物利用基因較多。菌株ZW18有1 553個核心基因，30個獨特基因，是產(chǎn)馬乳酒乳桿菌中具有多樣性的菌株。菌株ZW18中含有很多益生相關(guān)基因，在抵抗惡劣環(huán)境脅迫、抗氧化、耐受胃腸道、調(diào)節(jié)免疫、抗菌等方面有突出作用。除此之外，該菌株能夠合成人體所需維生素，如硫胺素、核黃素等，也可以合成成人及嬰幼兒生長所需氨基酸，如賴氨酸、蛋氨酸等，具有潛在研究價值。綜上，從產(chǎn)馬乳酒乳桿菌馬乳酒亞種ZW18的全基因組分析及功能特性可以看出，菌株ZW18是一株益生功能強且具有潛在應(yīng)用價值的菌株，為其今后的進一步深入研究與應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。