曹明奡 張 菲 黃光明 劉瑞成 劉利平 吳強(qiáng)盛 徐永杰

（1.長江大學(xué)園藝園林學(xué)院/西藏高原核桃產(chǎn)業(yè)研究所 荊州 434025；2.黃岡師范學(xué)院 經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黃岡 438000；3.湖北省林業(yè)科學(xué)研究院 武漢 430075）

磷（P）是植物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素之一，不僅參與光合作用、核苷酸合成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及能量傳遞等多種代謝過程，還是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的重要組成部分。土壤中20%～80%的P 以有機(jī)形態(tài)存在，這些有機(jī)P 很難被植物根系直接吸收，必須被磷酸酶轉(zhuǎn)化（Shaoet al.，2021）。此外，土壤速效P也容易被土壤中的鐵和鋁等固定，導(dǎo)致土壤P 不足，是作物產(chǎn)量的主要限制因素之一（Izabelaet al.，2019）。施P 肥可補(bǔ)充土壤P 不足，然而P 肥會(huì)消耗不可再生的磷礦儲(chǔ)量，如何提高植物對P 的吸收是農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)需要解決的一個(gè)重要課題。

核桃（Juglans regia）為胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans）多年生落葉喬木，既是優(yōu)質(zhì)的用材樹種，也是營養(yǎng)豐富的食用干果樹種和珍貴的油料樹種。P是核桃生長發(fā)育必需的營養(yǎng)素之一，特別是果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)直接受土壤和核桃植株P(guān) 含量的影響（Yuet al.，2011）。然而，核桃園土壤肥力普遍偏低，特別是有效P 含量，導(dǎo)致核桃果實(shí)產(chǎn)量不高，油脂含量低（張翠萍，2014）。核桃根際存在某些有益的叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌，這些AM 真菌能夠侵入核桃根系建立叢枝菌根共生體（Liet al.，2021）。研究表明，AM 真菌[如摩西球囊霉（Glomus mosseae）和根內(nèi)球囊霉（G.intraradices）]接種在核桃組培苗上可顯著提高移栽成活率（Dolcet-Sanjuanet al.，1996）。Huang 等（2020）在‘遼河一號’核桃（J.regiacv.Liaohe 1）上接種5 種AM 真菌 [細(xì)凹無梗囊霉（Acaulospora scrobiculata）、沾屑多樣孢囊霉（Diversisporaspurca）、幼套球囊霉（G.etunicatum）、摩西球囊霉（G.mosseae）和地表球囊霉（G.versiforme）] 后發(fā)現(xiàn)植株生長明顯改善，其中沾屑多樣孢囊霉促進(jìn)效果明顯。Cheng 等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，接種AM 真菌可提高'遼河一號'核桃葉片的P、K、Mg、B、Fe、Zn 和Cu 含量。在正常水分和干旱脅迫條件下，摩西球囊霉、幼套球囊霉及二者混合物均可增加核桃葉片的N、P 和Zn 含量（Behroozet al.，2019）。已有研究表明，AM 真菌通過根外菌絲網(wǎng)絡(luò)從根系無法接觸的土壤區(qū)域?qū)o機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主植物，并通過AM 真菌高親和力的磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因（如RiPT7）、向根際分泌磷酸酶以及上調(diào)宿主根系磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)水平，促進(jìn)宿主P 的吸收（Zuccaro，2019;Shaoet al.，2021; Xieet al.，2022）。目前，AM 真菌是否并如何通過磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因調(diào)控根際磷酸酶活性促進(jìn)核桃根系P 吸收尚不清楚。鑒于此，本研究采用低P 脅迫處理核桃幼苗并接種AM 真菌，探索低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系 P 吸收的影響及機(jī)制，以期為核桃幼苗的栽培生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用2×2 雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素一為沾屑多樣孢囊霉接種和不接種處理；因素二為P 處理，包括適P（100 μmol·L-1）和低P（1 μmol·L-1）。試驗(yàn)共4 個(gè)處理，每處理重復(fù)8 次，共32 盆，每盆定植1 株核桃幼苗，隨機(jī)排列。

1.2 試驗(yàn)處理

以‘遼河一號’核桃為材料，其種子由湖北省保康縣核桃技術(shù)推廣中心提供。種子預(yù)先用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇表面消毒，滅菌水潤洗后，播種于經(jīng)高溫高壓（121℃，0.11 MPa，2 h）滅菌的河沙中，在晝夜溫度28 ℃ /20 ℃、相對濕度80% 的培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。待長出4 片真葉后移栽至塑料盆（2.4 L）中，盆栽基質(zhì)為河沙。為防止基質(zhì)中原有P 元素對試驗(yàn)的干擾，使用前先經(jīng)酸洗脫并用蒸餾水洗凈，后在高溫、高壓（121 ℃，0.11 MPa）下滅菌2 h。

基于前期篩選的1 個(gè)高效AM 真菌菌株——沾屑多孢囊霉（Huanget al.，2020；Chenget al.，2020），移栽時(shí)進(jìn)行沾屑多孢囊霉的接種。該菌種保存于長江大學(xué)根系生物學(xué)研究所，經(jīng)白三葉（Trifolium repens）擴(kuò)繁3 個(gè)月后，收獲被AM 真菌侵染的根段（菌根侵染率在95%以上）與含AM 真菌的栽培基質(zhì)（孢子密度為15 個(gè)·g-1）作為菌劑。接種AM 真菌處理的植株每盆施入120 g 菌劑，不接種處理施入等量滅菌的菌劑，并添加等量菌劑的過濾滅菌液2 mL 以保持除目的菌種以外的微生物區(qū)系一致性。接種1 周后，進(jìn)行P 脅迫處理。通過控制Hoagland 營養(yǎng)液（pH7.0）中的KH2PO4濃度調(diào)節(jié)盆栽基質(zhì)P 濃度，其中100 μmol·L-1KH2PO4為適P 處理（李永夫等，2010），1 μmol·L-1KH2PO4為低P 處理。每盆、每3 天加營養(yǎng)液150 mL。此外，營養(yǎng)液澆灌每3 次后的次日以100 mL 重蒸水施入以洗去基質(zhì)殘留的營養(yǎng)液，防止P 積累。所有處理的核桃苗置于長江大學(xué)的塑料溫室中進(jìn)行苗木培養(yǎng)，3 個(gè)月后收獲植物和土壤材料。

1.3 指標(biāo)測定

收獲時(shí)將植株分成地上部分和地下部分，測定各自的鮮質(zhì)量。

根系菌根侵染判斷依據(jù)Phillips 等（1970）方法。利用卷尺測量主根長度，使用Epson 掃描儀對根系進(jìn)行掃描，應(yīng)用WinRHIZO 2007 軟件分析根系形態(tài)參數(shù)。運(yùn)用ICP 光譜儀測量根系P 含量。根系酸性磷酸酶活性采用對硝基苯酚磷酸二鈉比色法（Mclachlanet al.，1987）測定。土壤磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉法（趙蘭坡等，1986）測定。

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫獲取擬南芥紫色酸性磷酸酶分泌基因（AtPAP10和AtPAP12，可水解有機(jī)磷）和磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因（AtPT3;1和AtPT3;3，可促進(jìn)植物在缺P 條件下對P 的吸收）序列。經(jīng)過核桃基因組數(shù)據(jù)庫（http://aegilops.wheat.ucdavis.edu/Walnut/data.php）比對分析，使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)JrPAP10、JrPAP12、JrPT3;1、JrPT3;3基因引物序列（表1），由上海生物工程有限公司合成。根樣總RNA 采用植物專用RNA提取試劑盒(Aidlab) 進(jìn)行，然后利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，以核桃的18S rRNA作為內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析采用熒光染料法進(jìn)行，每處理3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法（Livaket al.，2001）計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 qRT-PCR 中的基因引物序列Tab.1 The primer sequence of genes in qRT-PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SAS 軟件的GLM 過程進(jìn)行雙因素（沾屑多樣孢囊霉接種和P 處理）方差分析，應(yīng)用鄧肯多重比較法分析（P＜ 0.05），使用SAS 軟件分析皮爾遜相關(guān)系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 根系菌根侵染

未接種AM 真菌的核桃根系未觀察到任何菌根結(jié)構(gòu)，接種沾屑多樣孢囊霉處理的核桃幼苗根系發(fā)現(xiàn)菌根侵染（圖1）。接種沾屑多孢囊霉的植株在低P（1 μmol·L-1）和適P（100 μmol·L-1）條件下根系菌根侵染率分別為53.2%±3.6% 和45.6%±4.9%（均值±SD），且低P 處理顯著提高根系菌根侵染率。

圖1 核桃根系被沾屑多孢囊霉侵染Fig.1 Root colonization of walnut by D.spurca

2.2 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗生長的影響

與適P 處理相比，低P 脅迫顯著降低地上部、地下部及總生物量（表2）。此外，在低P 和適P 條件下，接種AM 真菌均顯著提高植物地上部、地下部及總生物量，低P 下分別提高56%、52%、51%，適P 下分別提高56%、27%、27%。交互作用結(jié)果顯示，AM 真菌處理和P 處理均顯著提高生物量，但二者間沒有顯著的交互作用。

表2 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃幼苗生物量的影響①Tab.2 Effects of D.spurca on biomass of walnuts seedlings under low P stress

2.3 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系形態(tài)的影響

在適P 條件下，接種AM 真菌提高根系體積48%，降低根平均直徑12%，對總長、投影面積以及表面積無顯著影響（表3）。在低P 條件下，接種AM 真菌顯著提高根系總長、投影面積、表面積、平均直徑和體積，分別提高21%、27%、28%、29% 和45%。AM 真菌接種顯著影響根系總長、表面積和體積，P 處理對根系形態(tài)沒有影響，AM 真菌和P 對根系投影面積和平均直徑存在顯著交互作用。

表3 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃幼苗根系形態(tài)的影響①Tab.3 Effects of D.spurca on root morphology of walnut seedlings under low P stress

2.4 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系P 含量和酸性磷酸酶活性的影響

未接種AM 真菌條件下，低P 處理顯著降低根系P 含量65%；接種AM 真菌條件下，低P 處理降低根系P 含量11%（圖2A）。此外，低P 脅迫下接種AM 真菌顯著增加根系P 含量51%，適P 條件下接種AM 真菌對根系P 含量無顯著影響。P 脅迫僅對菌根化植株根系酸性磷酸酶活性有促進(jìn)效應(yīng)。適P 條件下，AM真菌接種對根系酸性磷酸酶活性沒有顯著影響；低P條件下，AM 真菌接種顯著地提高根系酸性磷酸酶活性11%（圖2B）。交互作用分析顯示，單一AM 真菌處理和P 處理均顯著影響了系P 含量和根系酸性磷酸酶活性，且兩因素僅顯著交互影響根系P 含量（表4）。

圖2 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃幼苗根系磷含量（A）和酸性磷酸酶活性（B）的影響Fig.2 Effects of D.spurca on root P content (a) and acid phosphatase activity (b) of walnut seedlings under low P stress

表4 AM 真菌處理（A）和P 處理（P）間變量的交互作用顯著性Tab.4 Variable significance of the interaction between AM fungal inoculation (A) and P treatments (P)

2.5 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗土壤磷酸酶活性的影響

與適P 處理相比，低P 處理僅抑制非菌根化植株土壤堿性磷酸酶活性，對土壤酸性和中性磷酸酶無顯著影響（圖3）。相反，在菌根化植株上，低P 處理提高土壤酸性和中性磷酸酶活性，但降低堿性磷酸酶活性。另一方面，在低P 和適P 條件下，接種AM 真菌均對土壤酸性、中性和堿性磷酸酶活性有顯著提高作用（圖3），分別在低P 下提高47%、220%、164%以及適P 下提高15%、66%、162%。AM 真菌和P 處理顯著交互影響土壤各磷酸酶活性（表4）。由此可見，低P狀態(tài)下，AM 真菌對土壤酸性和中性磷酸酶活性的提升效果明顯高于適P 條件，這表明AM 真菌在P 缺乏條件下更能促進(jìn)土壤酸性和中性磷酸酶活性。

圖3 低P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃土壤磷酸酶活性的影響Fig.3 Effects of D.spurca on soil phosphatase activity of walnuts under low P stress

2.6 低P 脅迫下AM 真菌對核桃幼苗根系酸性磷酸酶分泌基因和磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)量的影響

低P 和適P 處理下接種AM 真菌， 均根系JrPAP10的相對表達(dá)量分別提高1 570% 和96%（P＜0.05）（圖4A）。低P 脅迫下接種AM 真菌，根系JrPAP12的相對表達(dá)量提高35%（P＜0.05），適P 處理時(shí)接種AM 真菌對根系JrPAP12的相對表達(dá)量無顯著影響。此外，低P 和適P 條件下接種AM 真菌，根系JrPT3;1的相對表達(dá)量分別提高354% 和83%（P＜0.05）（圖4B）。低P 脅迫下接種AM 真菌，根系JrPT3;2的表達(dá)量降低45%，但對適P 條件下根系JrPT3;2的表達(dá)量無顯著影響。AM 真菌和P 處理均顯著交互影響根系JrPT3;1、JrPT3;1、JrPAP10和JrPAP12的表達(dá)水平（表4）。

圖4 P 脅迫下沾屑多孢囊霉對核桃根系酸性磷酸酶分泌基因(a)和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(b)表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of D.spurca on the relative expression of acid phosphatase secretion genes (a) and phosphate transporter protein genes (b) of walnut roots under P stress

2.7 相關(guān)性分析

根系P 與土壤堿性磷酸酶活性、根系JrPAP12相對表達(dá)量、根系投影面積、根系表面積以及根平均直徑呈顯著正相關(guān)（P＜ 0.05），與根系JrPT3;2相對表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜ 0.01）（表5）。菌根侵染率與土壤酸性、中性、堿性磷酸酶、根表面積、體積以及根系JrPT3;1 和JrPAP10的相對表達(dá)量呈極顯著正相關(guān)，與根總長呈顯著正相關(guān)。

表5 核桃根系磷含量與相關(guān)變量的相關(guān)性①Tab.5 Relationship between P content and relevant variables of walnut roots

3 討論

沾屑多孢囊霉可與‘遼河一號’核桃根系建立菌根共生體，且低P 處理促進(jìn)根系菌根侵染率，與黃京華等（2006）研究玉米（Zea mays）幼苗在低P 脅迫菌根侵染率升高一致。AM 真菌侵染率往往與宿主根際基質(zhì)P 含量呈負(fù)相關(guān)，低P 狀態(tài)刺激菌絲的長度及菌根的形成（Wuet al.，2015）。本研究中，低P 處理顯著降低核桃幼苗生物量，但接種AM 真菌在不同程度緩解低P 脅迫對核桃幼苗生物量的抑制影響，且在低P 條件下菌根促進(jìn)生長作用要高于適P 條件下，說明菌根的作用在低P 條件下更突出（黃京華等，2006）。

根系是植物的重要吸收器官，也是土壤與植物的動(dòng)態(tài)界面，根系的生長和形態(tài)構(gòu)建與環(huán)境中養(yǎng)分的供應(yīng)和利用率密切相關(guān)，且具有很大可塑性，能被AM真菌調(diào)控（Liuet al.，2021）。本研究發(fā)現(xiàn)，適P 條件下接種AM 真菌僅顯著提高根系體積，而低P 條件下接種AM 真菌顯著提高根系總長、投影面積、表面積、平均直徑和體積，從而導(dǎo)致菌根化的植株能接觸到更多的土壤區(qū)域，進(jìn)而有利于植物對P 的吸收，與Shao等（2021）在低P 脅迫下茶樹（Camellia sinensis）上接種幼套球囊霉提高根系形態(tài)的結(jié)果一致。接種AM 真菌能顯著改善核桃根系構(gòu)型且在低P 條件下響應(yīng)更強(qiáng)烈。此外，根系P 含量與根系投影面積、表面積以及平均直徑呈顯著正相關(guān)，AM 真菌改善根系構(gòu)型是影響植物吸收P 的重要原因（Zhanget al.，2018a）。

土壤有機(jī)P 是土壤全P 的重要組成部分，占20%～50%，需在土壤磷酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為無機(jī)P后才能被根系吸收（Zuccaro，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，接種AM 真菌對低P 和適P 條件下土壤酸性、中性和堿性磷酸酶活性均顯著提升，與Yang 等（2021）在枳（Poncirus trifoliata）實(shí)生苗上接種摩西管柄囊霉提高土壤酸性、中性和堿性磷酸酶活性的結(jié)果一致，且低P 狀態(tài)下接種AM 真菌對土壤磷酸酶活性的提升更明顯。植物在低P 條件下生長受抑制，菌根通過增加植物向根系分泌磷酸酶，從而促進(jìn)植物P 的吸收（Smithet al.，2003）。此外，AM 真菌在根外菌絲招募溶磷細(xì)菌并促進(jìn)其分泌磷酸酶，有利于土壤有機(jī)磷的礦化（Jianget al.，2021；Zhanget al.，2018b； 2018c）。本研究顯示，菌根侵染率與土壤酸性、中性和堿性磷酸酶均呈極顯著正相關(guān)，表明菌根促進(jìn)土壤堿性磷酸酶活性的提升而顯著影響根系P 含量。另一方面，低P 處理下接種AM 真菌可提高核桃根系酸性磷酸酶活性。已知菌根菌絲、液泡和叢枝中包含酸性磷酸酶（Aarleet al.，2010），低P 條件比適P 條件顯著促進(jìn)沾屑多孢囊霉對核桃根系的侵染，說明菌根侵染率的增加可能促進(jìn)根系磷酸酶的活性，并加快向根際釋放。酸性磷酸酶能催化多聚磷酸鹽分解（Tatsuhiroet al.，2010），從而促進(jìn)植物對P 的吸收。

本研究表明，低P 處理下接種AM 真菌顯著誘導(dǎo)根系JrPAP10和JrPAP12的表達(dá)（尤其是JrPAP10），與舒波（2013）的研究結(jié)果一致。相關(guān)性分析表明，根系JrPAP10與根系菌根侵染率和根系酸性磷酸酶活性（r= 0.72,P＜ 0.01）均呈極顯著正相關(guān)，表明低P 條件下AM 真菌促進(jìn)根系酸性磷酸酶活性與AM 真菌誘導(dǎo)根系JrPAP10表達(dá)有關(guān)。此外，根系P 含量與JrPAP12表達(dá)量呈顯著正相關(guān)。因此，菌根可以通過間接地對酸性磷酸酶基因的表達(dá)產(chǎn)生影響，進(jìn)而改善植物P 的吸收功能。

AM 真菌能促進(jìn)植物對P 的吸收，尤其在土壤營養(yǎng)匱乏的環(huán)境中，菌根菌絲對P 的傳遞作用更顯著（薛英龍等，2019）。本研究表明，低P 脅迫顯著降低根系P 含量，且只有在低P 條件下AM 真菌才顯著提高核桃根系P 含量，適P 條件下則無顯著影響。適P條件下植物根系能吸收到足夠的P，因此菌根的作用不顯著；而低P 條件下，植物吸收不到足夠的P，需在AM 真菌的幫助下增強(qiáng)土壤磷酸酶活性，促進(jìn)土壤有機(jī)磷水解，且其菌絲能伸展到根系不能到達(dá)的區(qū)域攝取額外的P 以滿足植物對P 的需求（Zuccaro，2019）。

AM 真菌通過誘導(dǎo)植株根系的高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因高效表達(dá)，增強(qiáng)植物對P 的吸收并轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的部位（薛英龍等，2019）。本研究表明，低P 和適P 條件下AM 真菌均上調(diào)根系JrPT3;1的相對表達(dá)量，且菌根侵染率與JrPT3;1極顯著正相關(guān)，與劉春艷等（2017）在低P 脅迫下接種摩西管柄囊霉誘導(dǎo)枳根系PtaPT3、PtaPT5和PtaPT6表達(dá)的研究結(jié)果一致。然而，低P條件下AM 真菌卻抑制根系JrPT3;2的相對表達(dá)量，根系P 含量與根系JrPT3;2的相對表達(dá)量呈極顯著負(fù)相關(guān)，可能JrPT3;2是一個(gè)低親和力的磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因，而菌根能夠特異地誘導(dǎo)某些高親和力磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因如玉米ZmPT9的表達(dá)水平（Rauschet al.，2001; Xuet al.，2018）。本研究中，JrPT3;1在低P 條件下被沾屑多孢囊霉誘導(dǎo)，增加354%，因此，JrPT3;1是否是一個(gè)沾屑多孢囊霉特異誘導(dǎo)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因，JrPT3;1在含有叢枝的根系皮層細(xì)胞中的功能，還待深入研究。

4 結(jié)論

低P 脅迫抑制核桃幼苗根系發(fā)育，降低生物量、根系P 含量、土壤堿性磷酸酶活性以及JrPAP12的表達(dá)。而在低磷脅迫下接種AM 真菌誘導(dǎo)JrPAP10、JrPAP12和JrPT3;1基因的表達(dá)，促進(jìn)土壤以及根系磷酸酶活性，改變根系構(gòu)型，從而提高植物P 吸收和生物量積累，但AM 真菌接種在適P 條件下并沒有在低P 條件下對核桃幼苗根系P 含量改善顯著。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，可在土壤相對貧瘠的核桃園引入AM真菌或者核桃育苗過程中接種AM 真菌，培育菌根化核桃苗，用于各種土壤的定植。