范宏博， 胡丁月， 徐 莉， 孫 浩， 劉 峰， 劉春娥， 張小栓

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺(tái)研究院，山東 煙臺(tái) 264670； 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京 100083）

0 引言

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus），俗稱海腸，是一種經(jīng)濟(jì)類海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，分布于黃海、渤海泥沙岸潮間帶及潮下帶，其富含必需氨基酸、不飽和脂肪酸和微量元素，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。

近年來(lái)，隨著單環(huán)刺螠養(yǎng)殖產(chǎn)量的提升，勢(shì)必對(duì)其遠(yuǎn)距離運(yùn)輸技術(shù)提出更高要求。鮮活的水產(chǎn)品更易受到消費(fèi)者的青睞，然而在運(yùn)輸過(guò)程中，水產(chǎn)品極易受環(huán)境影響出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致水產(chǎn)動(dòng)物品質(zhì)降低甚至死亡。環(huán)境影響因素包括運(yùn)輸溫度、運(yùn)輸密度、氧氣含量和水質(zhì)等。其中適宜的運(yùn)輸密度既可以保證運(yùn)輸質(zhì)量又可以降低運(yùn)輸成本，高密度運(yùn)輸雖然可以提高運(yùn)載量，但在運(yùn)輸過(guò)程中由于個(gè)體擁擠碰撞會(huì)造成機(jī)體損傷，此外動(dòng)物呼吸產(chǎn)生的大量CO2積累，也容易引起水產(chǎn)生物應(yīng)激反應(yīng)，影響其生理狀況和免疫防御功能[4-6]。TANG S 等[7]監(jiān)測(cè)了鮭魚(yú)運(yùn)輸過(guò)程中的CO2濃度，闡述了高密度運(yùn)輸引起CO2積累造成魚(yú)的高碳酸血癥。熊梅等[8]通過(guò)檢測(cè)血清皮質(zhì)醇水平、肌肉質(zhì)構(gòu)特性等指標(biāo)，研究密度脅迫對(duì)草魚(yú)的影響，發(fā)現(xiàn)密度脅迫對(duì)草魚(yú)肌肉質(zhì)構(gòu)產(chǎn)生了顯著影響。殷述亭等[9]通過(guò)觀察大菱鲆在密度脅迫下免疫效果和應(yīng)激指標(biāo)的變化規(guī)律，提出5 kg/m3為最佳密度。

目前對(duì)單環(huán)刺螠保活運(yùn)輸?shù)难芯恐饕性谶\(yùn)輸時(shí)的水質(zhì)條件、溫度及?；顒┑倪\(yùn)用等方面，而對(duì)于運(yùn)輸密度對(duì)單環(huán)刺螠的生理應(yīng)激反應(yīng)的影響研究目前未見(jiàn)報(bào)道[10-12]。本研究分析了不同運(yùn)輸密度和不同時(shí)間條件下，單環(huán)刺螠生理應(yīng)激差異及相關(guān)的生理指標(biāo)變化，以期為緩解低溫?；钸\(yùn)輸中單環(huán)刺螠的應(yīng)激反應(yīng)、提高產(chǎn)品運(yùn)輸品質(zhì)等相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

單環(huán)刺螠，平均體長(zhǎng)（18.2±1.5）cm，平均體質(zhì)量（100±20）g，購(gòu)自煙臺(tái)九田水產(chǎn)市場(chǎng)；酸、葡萄糖、皮質(zhì)醇、超氧化物歧化酶試劑盒，南京建成生物工程研究所；海水晶，浙江藍(lán)海星鹽制品有限公司；三氯乙酸、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、乙二胺四乙酸二鈉、硫代巴比妥酸，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

LS10T 型鹽度計(jì)，衡水正旭電子科技有限公司；TGL-16A 型冷凍離心機(jī)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；Synergy H1 型多功能酶標(biāo)儀，BioTek Instruments,Inc；UV7 型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 暫養(yǎng)

將單環(huán)刺螠置于透明塑料箱（84.5 cm×53 cm×51 cm）中暫養(yǎng)24 h。暫養(yǎng)條件：海水鹽度3%、pH 值8、水溫15 °C 左右、避光及持續(xù)充氣，所用海水由海水晶和充分曝氣的自來(lái)水配制成的人工海水。

1.2.2 試驗(yàn)分組

設(shè)置12、24、36、48 和60 h 5 個(gè)時(shí)間梯度，0 h 為對(duì)照組；每一個(gè)時(shí)間梯度下設(shè)置低密度組、中密度組和高密度組3 個(gè)密度組。具體操作：把內(nèi)徑為17.5 cm×7.8 cm×10.5 cm 的聚苯乙烯泡沫箱分為低密度組、中密度組和高密度組，其中低密度組為1 層，中密度組為2 層，高低密度為3 層，每層放置4～6 只單環(huán)刺螠，用硬紙板隔開(kāi)。根據(jù)泡沫箱內(nèi)徑及單環(huán)刺螠質(zhì)量計(jì)算各組密度估計(jì)值：低密度組0.5 kg/L、中密度組1.0 kg/L、高密度組1.5 kg/L，每個(gè)密度組設(shè)置3 組平行試驗(yàn)，所有密度組置于4 °C 冰箱中，每2 h 搖晃箱體模擬運(yùn)輸環(huán)境。

1.2.3 解剖取樣

在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，將單環(huán)刺螠從泡沫箱中取出，從單環(huán)刺螠背側(cè)肛門(mén)端用解剖剪呈直線剪向吻端，將流出的體腔液收集至離心管中，在12 000 r/min 條件下冷凍離心5 min，取上清液即血清，儲(chǔ)存于-80 °C 冰箱，待測(cè)。

1.3 檢測(cè)方法

葡萄糖、乳酸、皮質(zhì)醇含量及超氧化物歧化酶活力均參考南京建成生物工程研究所試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定；丙二醛含量參考GB 5009.181—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測(cè)定》；持水力參照王碩等[13]的方法，解剖后取1 g 左右體壁，稱質(zhì)量，用定性濾紙包好，5 000 r/min 冷凍離心10 min 后再次稱質(zhì)量，并按照以下公式計(jì)算持水力。

式中m1——所取單環(huán)刺螠體壁離心前質(zhì)量，g

m2——所取單環(huán)刺螠體壁離心后質(zhì)量，g

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)密度組取3 個(gè)平行，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（Mean ± SD）表示，采用Excel2019 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與作圖，以運(yùn)輸密度和運(yùn)輸時(shí)間為自變量采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），Duncan 法比較差異顯著性，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠行為的影響

在運(yùn)輸密度和時(shí)間的脅迫影響下，單環(huán)刺螠表現(xiàn)出多種特殊行為變化。脅迫12 h，3 個(gè)密度組單環(huán)刺螠體表均呈現(xiàn)粉紅色，并且能夠緩慢蠕動(dòng)；36 h，3 個(gè)密度組單環(huán)刺螠應(yīng)激增強(qiáng)，表現(xiàn)為身體皺縮，個(gè)別個(gè)體出現(xiàn)分節(jié)現(xiàn)象；60 h 后，單環(huán)刺螠體壁肌肉強(qiáng)烈收縮，體壁較硬，體表顏色變深。低密度組為深紅色，而中密度組和高密度組為不同程度的黑褐色，如圖1 所示。

圖1 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠行為的影響Fig.1 Effect of transportation density and time on behavior of Urechis unicinctus

2.2 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠生理的影響

2.2.1 持水力

由圖2 可知，初始單環(huán)刺螠持水力89%，隨時(shí)間的延長(zhǎng)，持水力整體呈下降趨勢(shì)，60 h 高密度組持水力最低，為65%。所有時(shí)間段，中密度組和高密度組持水力均顯著低于對(duì)照組（P<0.05），而低密度組從24 h 開(kāi)始顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。不同密度對(duì)單環(huán)刺螠的持水力影響也較大，除24 h 外，其余時(shí)間點(diǎn)的高密度組受脅迫更為強(qiáng)烈，持水力均顯著低于低密度組和中密度組（P<0.05）。

圖2 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠持水力的影響Fig.2 Effect of transportation density and time on water holding capacity of Urechis unicinctus

持水力能直接反映肌肉抑制水分流失的能力，不僅影響肌肉色澤，還與肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和變性程度有關(guān)[14-15]。試驗(yàn)中在運(yùn)輸密度和時(shí)間的雙重脅迫作用下，單環(huán)刺螠產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，體壁肌肉強(qiáng)烈收縮變硬，肌肉內(nèi)的肌原纖維相關(guān)氫鍵、化學(xué)鍵和離子鍵斷裂，蛋白質(zhì)三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)崩解，疏水基團(tuán)暴露，肌原纖維蛋白的溶解性下降，蛋白與水分子的相互作用減弱，最終造成水分流失，持水力下降[16-17]。

2.2.2 抗氧化能力

由圖3a 可知，超氧化物歧化酶可有效清除生物有機(jī)體內(nèi)的超氧陰離子（O-2）等成分，防御氧自由基對(duì)有機(jī)體造成損傷[18]。模擬運(yùn)輸12 h，3 個(gè)密度組與對(duì)照組相比超氧化物歧化酶活力均未發(fā)生顯著變化。36 h 后各密度組均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），除了48 h 低密度組與中密度組顯著低于高密度組，36 和60 h 時(shí)間下各密度組之間沒(méi)有顯著差異（P>0.05），這說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸，時(shí)間脅迫對(duì)超氧化物歧化酶活力的影響遠(yuǎn)超過(guò)密度脅迫。

圖3 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠抗氧化能力的影響Fig.3 Effect of transportation density and time on concentrations of superoxide dismutase and malondialdehyde of Urechis unicinctus

丙二醛是生物膜中多不飽和脂肪酸在活性氧自由基攻擊下而引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，被廣泛用于氧化應(yīng)激中自由基產(chǎn)生和生物膜氧化損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)[19-20]。由如圖3b 可知，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，丙二醛含量呈上升趨勢(shì)，48 ～60 h，低密度組、中密度組和高密度組均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。0～36 h，3 個(gè)密度組之間無(wú)顯著差異（P<0.05），說(shuō)明運(yùn)輸時(shí)間較短時(shí)，密度脅迫對(duì)丙二醛含量的影響較小。

超氧化物歧化酶和丙二醛在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可用作單環(huán)刺螠氧化應(yīng)激水平的量化指標(biāo)[21-22]。AHMAD I 等[23]指出，高密度養(yǎng)殖引起的應(yīng)激反應(yīng)可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成。對(duì)團(tuán)頭魴的養(yǎng)殖試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著飼養(yǎng)密度的增加，丙二醛含量顯著增加[24]。水產(chǎn)動(dòng)物在應(yīng)對(duì)密度和時(shí)間脅迫時(shí)，機(jī)體產(chǎn)生一系列氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，誘發(fā)超氧化物歧化酶活性增強(qiáng)，清除過(guò)量的自由基，以降低脅迫對(duì)機(jī)體的氧化損傷。隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，超氧化物歧化酶活性被顯著抑制，自由基過(guò)多引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)加劇，誘導(dǎo)丙二醛含量升高。因此，運(yùn)輸時(shí)間較短時(shí)，運(yùn)輸密度和時(shí)間脅迫對(duì)單環(huán)刺螠的抗氧化能力影響較小，丙二醛含量變化不顯著[25]。

2.2.3 葡萄糖和乳酸含量

由圖4a 可知，隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，3 個(gè)密度組單環(huán)刺螠的乳酸含量整體呈遞增趨勢(shì)，60 h 時(shí)高密度組達(dá)到最大值。24～60 h，3 個(gè)密度組單環(huán)刺螠的乳酸含量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），并且高密度組呈現(xiàn)脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，乳酸含量越高的趨勢(shì)，除24 h 外，其余時(shí)間點(diǎn)的高密度組均顯著高于低密度組 （P<0.05）。

圖4 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠葡萄糖和乳酸含量的影響Fig.4 Effect of transportation density and time on concentrations of lactic acid and glucose of Urechis unicinctus

由圖4b 可知，除12 和24 h 低密度組，其余各時(shí)間點(diǎn)各密度組的葡萄糖含量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。運(yùn)輸密度脅迫對(duì)葡萄糖含量的影響也較大，12～60 h，高密度組葡萄糖含量均顯著高于低密度組和中密度組（P<0.05）。

田興[26]研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸造成斑點(diǎn)叉尾鮰和黃顙魚(yú)血糖濃度顯著升高。SCHRECK C B 等[27]也發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸脅迫會(huì)導(dǎo)致大麻哈魚(yú)組織中乳酸含量的升高，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。在運(yùn)輸過(guò)程中，低氧條件限制了機(jī)體的有氧代謝水平，機(jī)體被動(dòng)進(jìn)行無(wú)氧代謝，加速乳酸的產(chǎn)生和積累。同時(shí)，水產(chǎn)動(dòng)物面臨脅迫，體內(nèi)葡萄糖被大量分解供能，一定程度上促進(jìn)了肌糖原大量分解，糖異生過(guò)程加速，動(dòng)物體內(nèi)的葡萄糖含量升高，這一動(dòng)態(tài)平衡解釋了試驗(yàn)中葡萄糖含量的波動(dòng)變化趨勢(shì)[28-30]。

2.2.4皮質(zhì)醇含量

由圖5 可知，皮質(zhì)醇含量隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。前面檢測(cè)的很多指標(biāo)在12 h 時(shí)與對(duì)照組相比，并沒(méi)有發(fā)生顯著變化，然而皮質(zhì)醇含量在所有時(shí)間點(diǎn)，低密度組、中密度組和高密度組的皮質(zhì)醇含量均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）； 60 h，高密度組的皮質(zhì)醇含量最高，并且顯著高于低密度組和中密度組（P<0.05）。

皮質(zhì)醇作為一種重要應(yīng)激激素，可以有效地反映水產(chǎn)動(dòng)物的應(yīng)激程度[31]。很多研究表明，脅迫會(huì)導(dǎo)致血漿皮質(zhì)醇含量的上升[32-35]。KLUG J J 等[36]發(fā)現(xiàn)，高密度養(yǎng)殖條件會(huì)引起虹鱒幼魚(yú)血液中皮質(zhì)醇濃度上升。在脅迫狀態(tài)下，一方面，作為一種應(yīng)激激素，皮質(zhì)醇的分泌量會(huì)隨著應(yīng)激強(qiáng)度的增大而增加；另一方面，皮質(zhì)醇含量增加，在一定程度上可以刺激糖的合成和糖原分解，引起血糖濃度升高，產(chǎn)生大量能量來(lái)滿足自身的能量需求，這與本實(shí)驗(yàn)各組葡萄糖含量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高是一致的[37-38]。

3 結(jié)束語(yǔ)

無(wú)水?；钸\(yùn)輸?shù)拿芏群蜁r(shí)間不僅會(huì)影響單環(huán)刺螠的品質(zhì)和口感，還會(huì)影響其免疫力、酶活力及代謝能力。運(yùn)輸時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，運(yùn)輸密度過(guò)大，會(huì)引起單環(huán)刺螠持續(xù)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致單環(huán)刺螠體壁過(guò)度收縮，口感下降。同時(shí)，長(zhǎng)時(shí)間脅迫引起的應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)刺激機(jī)體產(chǎn)生過(guò)氧化反應(yīng)，促使單環(huán)刺螠的特異性和非特異性免疫能力下降，增加對(duì)病原的敏感程度，機(jī)體抗氧化能力減弱，甚至導(dǎo)致死亡。因此，在單環(huán)刺螠的保活運(yùn)輸過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的運(yùn)輸方式，較佳的無(wú)水?；钸\(yùn)輸條件：運(yùn)輸時(shí)間<24 h、中密度運(yùn)輸<1.0 kg/L，以減緩生理應(yīng)激，提高單環(huán)刺螠運(yùn)輸質(zhì)量。

圖5 運(yùn)輸密度和時(shí)間對(duì)單環(huán)刺螠皮質(zhì)醇含量的影響Fig.5 Effect of transportation density and time on concentration of cortisol of Urechis unicinctus

［1］劉峰，孫濤，紀(jì)元，等.單環(huán)刺螠生物學(xué)及生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)，2017，41（10）：125-131.LIU Feng，SUN Tao，JI Yuan，et al.Advances in studies on the biology and ecology ofUrechis unicinctus[J].Marine Sciences，2017，41（10）：125-131.