李佳益,李曦,范銘豐,王曉艷,劉希華

(1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 三明 365004;2.三明學(xué)院 資源與化工學(xué)院,福建 三明 365004;3.三明市土肥站,福建 三明 365000; 4.三明市林業(yè)局,福建 三明 365000)

土壤重金屬污染是一個(gè)世界性的緊迫問題。土壤中金屬含量的持續(xù)增加通過食物鏈對(duì)人類和動(dòng)物的健康構(gòu)成威脅。土壤中的重金屬會(huì)抑制大多數(shù)植物的生長(zhǎng),尤其是非必需的重金屬,如Pb、Cd、Cr等[1]。植物細(xì)胞具有一系列潛在的重金屬的解毒機(jī)制,從而有重金屬脅迫的耐性[2]。內(nèi)生細(xì)菌不僅具有抵御重金屬毒性的能力,還能增加宿主植物對(duì)養(yǎng)分的獲取,增強(qiáng)其對(duì)抗脅迫的代謝活性[3]。因此,利用內(nèi)生細(xì)菌緩解重金屬對(duì)寄主植物的毒性是提高植物重金屬耐受性的有效策略。

東南景天(Sedumalfredii)屬景天科(Crassulaceae),是一種Cd/Zn超富集植物和Pb高富集植物,21世紀(jì)初在中國(guó)被發(fā)現(xiàn)。東南景天的營(yíng)養(yǎng)繁殖簡(jiǎn)單和快速生長(zhǎng)的特性以及顯著的Cd、Zn和Pb吸收、積累特性使其成為植物修復(fù)多重污染土壤的最佳種質(zhì)資源[4]。但由于其植株矮小,生物量較小,修復(fù)重金屬污染土壤的效果甚微。林木生物量大,生長(zhǎng)快速,作為能源植物獲得經(jīng)濟(jì)收益,是理想的植物修復(fù)材料,但由于重金屬對(duì)多數(shù)林木有毒害作用,導(dǎo)致幼樹生長(zhǎng)下降,嚴(yán)重可致其死亡[2]。研究發(fā)現(xiàn),一些植物生長(zhǎng)促進(jìn)菌(plant growthpromoting bacteria,PGPB)可以通過刺激植物激素(生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、赤霉素等)的合成來輔助寄主植物,通過產(chǎn)生鐵團(tuán)、增磷和固氮來緩解營(yíng)養(yǎng)缺乏,通過細(xì)胞外沉淀、細(xì)胞內(nèi)積累、隔離和酶解毒(如氧化/還原)降低重金屬生物毒性[5]。此外,PGPB接種提高了成年植物的重金屬積累和轉(zhuǎn)運(yùn)能力[6]。

本文分析鉛脅迫東南景天耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性,分析其內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群,將優(yōu)勢(shì)種群轉(zhuǎn)接到林木種子或者幼苗上,以利于林木在幼苗期獲得耐鉛污染的能力,從而提升植物修復(fù)鉛污染土壤的效率。

1 材料與方法

1.1 植物材料

1.1.1 植物材料 選擇生長(zhǎng)一致的東南景天植株移植到花盆中,砂子和壤土配比為1∶1。配制2.4、4.8、7.2、9.6、12 mmol/L硝酸鉛溶液1000 mL,每3天澆灌一次東南景天,一次100 mL,30 d以后,土壤中鉛離子的濃度達(dá)到相應(yīng)處理濃度。鉛脅迫處理之后更換成無菌水100 mL,一個(gè)月后采集長(zhǎng)勢(shì)好、無病害的東南景天的不同部位(根、莖、葉)新鮮組織進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的分離。

1.1.2 培養(yǎng)基 配制2.4、4.8、7.2、9.6、12、14.4 mmol/L硝酸鉛濃度的LB固體培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 耐鉛內(nèi)生細(xì)菌分離 分別取東南景天根、莖、葉,清洗干凈后,小量流水清洗1 h,分別移入組培瓶中。在超凈工作臺(tái)上完成如下工作:75%的酒精振蕩清洗(根5 min,莖和葉各2 min),無菌水中振蕩清洗5遍,最后一遍無菌水涂布LB培養(yǎng)基以確定是否為內(nèi)生細(xì)菌。消毒后的材料分別在滅菌后的研砵添加3～5 mL無菌PBS緩沖液和石英砂進(jìn)行研磨,吸取研磨后的汁液放入離心管中,在離心機(jī)中2000 r/min下離心3 min,吸取150 uL的上清液,涂布在含不同鉛離子的培養(yǎng)基,3次重復(fù),培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h,統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌基因組DNA提取和16S rDNA序列擴(kuò)增 菌株基因組DNA用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒(天根,DP302-02)進(jìn)行提取,以通用引物8f(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492r(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)(上海華大基因)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。退火溫度為52℃。PCR產(chǎn)物為1600 bp左右。

1.2.3 16S rDNA序列酶切圖譜分析 選用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ等4 種限制性內(nèi)切酶消化16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分析酶切結(jié)果,分別用0,1數(shù)字代表酶切條帶的有無。

1.2.4 代表種群分子鑒定 篩選出聚類分析結(jié)果中的9個(gè)組群的代表種,擴(kuò)增出16S rDNA片段,回收1600 bp左右的PCR產(chǎn)物并連接到pMD19-T Vector,挑取陽(yáng)性克隆送往上海華大基因公司測(cè)序。序列經(jīng)BLAST進(jìn)行最大相似性比對(duì),用Clustal X 1.83進(jìn)行同源性分析[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS[8]進(jìn)行方差分析。

應(yīng)用Pritchard等[9]聚類分析方法(軟件Structure Version 2.2)對(duì)供試的內(nèi)生細(xì)菌的酶切結(jié)果進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。其中設(shè)定群體數(shù)目(K)為2～15,Structure參數(shù)Burnin Period和afterBurnin均設(shè)定為10 000次,然后依據(jù)似然值最大的原則選取合適的K值[11],并畫出基于模型的群體遺傳結(jié)構(gòu)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 東南景天內(nèi)生細(xì)菌分離情況

通過分離結(jié)果(圖1、圖2和圖3)來看,從東南景天的根部分離出來的內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量明顯多于莖部和葉部,葉部所分離的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最少。以土壤中鉛離子濃度為12 mmol/L的東南景天體內(nèi)所分離出來內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多,而2.4 mmol/L組則數(shù)量最少。隨著鉛脅迫的濃度的增大,東南景天體內(nèi)所共生的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量也隨之增加,以幫助東南景天來抵抗鉛離子脅迫,而在低濃度的鉛離子環(huán)境中,由于東南景天自身具有富集鉛離子的特性,所以無需共生細(xì)菌來抵抗鉛脅迫。不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基中分離內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也不同,趨勢(shì)為隨著培養(yǎng)基鉛離子增加,相應(yīng)的內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也隨之增加,但培養(yǎng)基中鉛離子的濃度超過9.6 mmol/L時(shí),內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量開始下降,當(dāng)培養(yǎng)基中鉛離子濃度為14.4mmol/L時(shí),內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最少。方差分析結(jié)果表明(表1),東南景天不同部位、不同鉛離子濃度土壤和不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基所分離的內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到極顯著差異。

注:圖示為土壤中鉛離子濃度,單位為mmol/L,下同。

圖2 不同鉛離子濃度土壤東南景天莖中不同鉛濃度培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量

圖3 不同鉛離子濃度土壤東南景天葉中不同鉛濃度培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量

表1 東南景天內(nèi)生細(xì)菌方差分析表

2.2 東南景天內(nèi)生細(xì)菌聚類分析

本文選取土壤和培養(yǎng)基鉛離子濃度均為12 mmol/L的組合來分析東南景天體內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)。選取根82株、莖29 株、葉7 株進(jìn)行提取單菌落細(xì)菌DNA,擴(kuò)增16S rDNA序列,經(jīng)酶切,酶切產(chǎn)物有多種類型(圖3)。整理四種酶的酶切圖,分別用0,1數(shù)字代表酶切條帶的有無,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

圖3 酶切凝膠電泳圖

利用Structure軟件對(duì)118株內(nèi)生細(xì)菌菌株進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,在K=2～12中,K=9時(shí)似然值最大(圖4),因此東南景天內(nèi)生細(xì)菌種群應(yīng)分為9大類(圖5),表明東南景天內(nèi)生細(xì)菌種群具有明顯的多元特性和異質(zhì)性。

以第8組群數(shù)量最多,為24個(gè),第9組群和第1組群數(shù)量也較多,分別是17個(gè)和15個(gè),第6組群數(shù)量為13個(gè),第3組群數(shù)量為11個(gè),其他4個(gè)組群數(shù)就比較少,第5組群、第7組群、第2組群和第4組群分別為9個(gè)、9個(gè)、6個(gè)和6個(gè),無法定義分類的種群數(shù)量為8個(gè)。說明第8和第9組群為主要組群。

選取這9個(gè)組群的代表菌株進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序序列信息在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索,分別找到與之相似性最高的種屬,系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,推斷出這9個(gè)組群所代表的菌種如表2。從表2中可以看到,芽孢桿菌屬(Bacillus)的數(shù)量在內(nèi)生細(xì)菌中是最多的,假單胞菌屬(Pseudomonas)和腸桿菌屬(Enterobacter)的數(shù)量也占據(jù)優(yōu)勢(shì)。阪崎腸桿菌屬(Cronobacter)和賴氨酸桿菌屬(Lysinibacillus)的數(shù)量則是最少的。

表2 9個(gè)組群的代表菌種

3 小結(jié)與討論

本文探討了不同鉛離子脅迫下的東南景天體內(nèi)耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的種群多樣性。在預(yù)試驗(yàn)中,由于高濃度(土壤中鉛離子濃度為14.4 mmol/L)的鉛脅迫導(dǎo)致東南景天出現(xiàn)葉片發(fā)黃,且部分植株死亡,所以沒有開展該處理的東南景天內(nèi)生細(xì)菌的分離。通過分離實(shí)驗(yàn),從東南景天的根部分離出來的內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量明顯多于莖部和葉部,葉部所分離的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最少。在鉛脅迫培養(yǎng)東南景天內(nèi)生細(xì)菌分離實(shí)驗(yàn)中,隨著硝酸鉛濃度的增加,內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也增加,以土壤中鉛離子濃度12 mmol/L的東南景天體內(nèi)所分離出來的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多。不同鉛離子濃度的培養(yǎng)基中分離內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量也不同,9.6 mmol/L鉛離子培養(yǎng)基中分離到內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最多,而14.4 mmol/L鉛離子的培養(yǎng)基中所分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量最少。利用Structure軟件并結(jié)合分子鑒定對(duì)澆鉛濃度和培養(yǎng)基鉛離子濃度均為12 mmol/L所分離到118株?yáng)|南景天內(nèi)生細(xì)菌菌株進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析,表明芽孢桿菌屬的數(shù)量在內(nèi)生細(xì)菌中是最多的,依次是假單胞菌屬和腸桿菌屬,說明這三者是東南景天體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)種群。

隨著全球工業(yè)化的發(fā)展,世界范圍內(nèi)土壤中的重金屬濃度進(jìn)一步增加,從而影響到人類的健康。因此如何修復(fù)土壤中的重金屬污染是科學(xué)家亟待解決的問題。微生物與植物的聯(lián)合修復(fù)既解決了微生物修復(fù)重金屬污染的殘留問題,也解決鉛脅迫植物生長(zhǎng)不良的問題,已成為現(xiàn)在研究熱點(diǎn)。微生物在植物生長(zhǎng)和發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10]。同時(shí),植物微生物共生有效地改善了土壤質(zhì)量和養(yǎng)分循環(huán),因此,接種精選和馴化的微生物可以顯著提高植物修復(fù)效率[11]。植物的種類和基因型、植物組織與植物內(nèi)生細(xì)菌的種群密度關(guān)聯(lián)性很大,有文獻(xiàn)報(bào)道,植物超積累重金屬的機(jī)制很可能與定殖于其組織內(nèi)的內(nèi)生菌多樣性有著十分密切的關(guān)系[12],從部位來說植物根組織中的內(nèi)生細(xì)菌的種群密度是最高的[13]。本文中,東南景天的根部的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量也是遠(yuǎn)高于莖和葉組織。研究發(fā)現(xiàn),一些植物生長(zhǎng)促進(jìn)細(xì)菌可以通過刺激生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素等植物激素的合成來幫助寄主植物;通過鐵載體的產(chǎn)生、磷的溶解和固氮來緩解營(yíng)養(yǎng)缺乏;通過細(xì)胞外沉淀、細(xì)胞內(nèi)積累、隔離和酶解毒(如氧化/還原)來降低重金屬的生物毒性[14-16]。隨著鉛脅迫濃度的增大,植物體內(nèi)需要有更多內(nèi)生細(xì)菌的數(shù)量,以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)以及提高植物對(duì)鉛的抗性。芽孢桿菌USTB-O 可提高小麥對(duì) Cu 的積累,且能分泌 IAA促進(jìn)植物生長(zhǎng)[17];而假單胞菌能夠向植物根際提供生長(zhǎng)激素[18],促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)會(huì)產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)[19],吸收植物所產(chǎn)生的ACC以降低植物的乙烯含量[20];腸桿菌通過改變重金屬價(jià)態(tài)的形式實(shí)現(xiàn)去除重金屬毒性的作用[21]。這3類菌能夠保護(hù)植物在鉛脅迫逆境中的生長(zhǎng),成為東南景天內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群。

東南景天體內(nèi)具有豐富促生特性的內(nèi)生細(xì)菌種質(zhì)資源,這對(duì)于植物-微生物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染菌群資源的開發(fā)及微生物肥料的菌種選育和生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。