劉文曲

(安順市人民醫(yī)院,貴州 安順 561000)

肺炎是發(fā)病率較高的常見疾病,其中重癥肺炎持續(xù)存在的高熱、呼吸受阻、肺功能受損等臨床癥狀可帶來更高風險的心肌損傷〔1,2〕。2018年全球累計肺炎病例因心肌損傷而致死近100萬人,且呈逐年上升趨勢〔3〕,因此重癥肺炎心肌損傷是臨床研究的熱點。姜黃素是一種植物多酚類物質,可避免心腦血管病心肌細胞的炎癥反應和氧化應激損傷,從而起到心肌保護作用,其作用機制可能與磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路蛋白表達的調控有關〔4,5〕。本研究觀察姜黃素對重癥肺炎大鼠心肌組織損傷的保護作用及PI3K/Akt信號通路蛋白的調控作用。

1 材料和方法

1.1實驗動物 雄性健康SPF級的SD大鼠50只,購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心〔SCXK(黔)2018-0002〕;周齡8 w,體質量(200±10)g,飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學實驗動物中心SPF級動物房〔SYXK(黔)2018-0001〕。動物在恒溫(22±1)℃和恒濕(55±5)%、照度15～20 Lx的環(huán)境下飼養(yǎng),每天光照和黑暗明暗交替時間為12 h/12 h,自由飲水和攝食,室內通風良好。動物術前在飼養(yǎng)環(huán)境下適應7 d。本實驗研究方案經(jīng)安順市人民醫(yī)院動物實驗管理委員會討論通過(編號:2019021)。實驗過程遵循3R原則。

1.2主要試劑與儀器 注射用姜黃素購自西安天美生物科技股份有限公司,批號H381840,藥品包裝10 mg∶2 ml×8支;肺炎支原體(MP)國際標準菌液,購于首都兒科研究所,批號H430181,菌液濃度106CFU/ml;Akt蛋白抗體(編號CST#6849)、PI3K蛋白抗體(編號CST#8018)、實驗指標蛋白抗體〔包括白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)的抗體〕均購自中杉金橋生物技術有限公司;通用型SP試劑盒(編號#SP-9000 WK152108)購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.3動物造模 適應性喂養(yǎng)1 w后行滴鼻接種脂多糖(MP),仰臥位使大鼠頭部輕微上揚,然后用無菌加樣器吸取MP國際標準菌液1 ml(106CFU),緩慢滴入大鼠鼻腔,隨著大鼠自然呼吸吸氣時進入,接種后使大鼠保持直立位靜置30 s,確保能促使菌液充分吸入,每日1次,連續(xù)4 d。造模實驗3 d后取大鼠股動脈血進行血氣指標〔氧分壓(PaO2)、PaO2/吸氧分數(shù)(FiO2)〕分析,以動脈血氣指標低于正常大鼠90%作為重癥肺炎模型制作成功的標準〔6〕。實驗后動物均按3R原則給予人道措施。每天觀察實驗動物的活動、精神狀態(tài)、皮毛情況等,統(tǒng)計死亡動物數(shù)。

1.4動物分組、喂養(yǎng)、給藥 大鼠隨機分為肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組,每組10只。另取10只未建模大鼠為正常組。參照《藥理實驗方法學》〔7〕中藥物劑量折算方法(成人60 kg折算)給藥。具體方法為:正常組及肺炎模型組均常規(guī)喂養(yǎng);低劑量組、中劑量組、高劑量組除常規(guī)喂養(yǎng)外,按成人標準姜黃素劑量(0.02 mg/kg)分別注射0.5倍劑量(0.067 μg/kg)、1倍劑量(0.134 μg/kg)和2倍劑量(0.268 μg/kg)〔8,9〕,連續(xù)7 d。

1.5檢測指標與方法 (1)心肌細胞生物學參數(shù)測定:各組實驗大鼠于給藥第8天處死并取心臟組織,以0.25%胰蛋白酶制成細胞密度為每毫升1×105個的懸溶液,鋪設于標記組別的96孔板中,振搖后,48 h內采用德國巴魯夫生物科學檢測儀器測定細胞生物學參數(shù)。測定參數(shù)細胞存活數(shù)(D0)、平均細胞凋亡數(shù)(Dq)、細胞存活80%時所需時間(N)及細胞相對存活率值。細胞相對存活率=D0/正常組D0×100%。(2) 血清炎癥因子、氧化應激因子和心臟組織蛋白表達檢測:血清指標測定于給藥第8天處死前股動脈取血,制備血漿,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和氧化應激因子〔ROS、MDA、總抗氧化能力(T-AOC)〕的表達水平;采用Western印跡法檢測心臟組織的Akt、PI3K、P-Akt蛋白表達情況,組織勻漿、裂解后提取總蛋白,蛋白樣品電泳并轉移至聚偏氟乙烯膜上,室溫密閉存放2 h后,以Akt蛋白抗體、PI3K蛋白抗體、p-Akt蛋白抗體,一抗孵育過夜,采用磷酸鹽緩沖液洗膜,然后以辣根過氧化物二抗室溫孵育1 h后洗滌顯影,凝膠拍照封存并計算蛋白表達量。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、重復方差檢驗和q檢驗(Newman-Keuls法)。

2 結 果

2.1各組一般情況 實驗期間,重癥肺炎造模均成功,肺炎模型組和中劑量組各死亡1只。正常組PaO2、PaO2/FiO2明顯高于肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組(P<0.01),肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的PaO2、PaO2/FiO2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。肺組織病理顯示(圖1):肺炎模型組與正常組相比,肺組織間隔明顯增厚并有充血現(xiàn)象,肺泡腫大,大量炎細胞浸潤;各藥物組病變明顯減輕,炎細胞浸潤程度減輕,肺泡微水腫,有少量紅細胞,且劑量越高,效果越好。

2.2心肌細胞生物學參數(shù)分析 與正常組比較,肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組D0、N、細胞相對存活率均顯著下降,肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組Dq均顯著提升(P<0.01),且與肺炎模型組比較,低、高、中劑量組D0、Dq、N、細胞相對存活率差異顯著(P<0.01)。中劑量組D0、Dq、N、細胞相對存活率均顯著高于低、高劑量組(P<0.01)。見表1。

表1 各組實驗給藥前血氣指標及細胞化療生物學參數(shù)、化療增敏值比較

圖1 各組肺組織(HE染色,×100)

2.3各組血清實驗指標分析 與正常組比較,肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、MDA均顯著上升(P<0.01),T-AOC顯著下降(P<0.01),且與肺炎模型組比較,低、高、中劑量組IL-1β、IL-6、TNF-α、ROS、MDA均顯著降低,T-AOC顯著升高(P<0.01)。中劑量組上述指標均顯著優(yōu)于低、高劑量組(P<0.01)。見表2。

2.4各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達量分析 與正常組比較,肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組的Akt表達均顯著上升(P<0.01),PI3K、P-Akt表達顯著下降(P<0.01),且與肺炎模型組比較,低、高、中劑量組的PI3K/Akt信號通路蛋白表達量差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。中劑量組上述指標均顯著優(yōu)于低、高劑量組(P<0.01)。見表3、圖2。

表2 各組心臟組織實驗指標

表3 各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達量

1～5:正常組、肺炎模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組圖2 各組PI3K/Akt信號通路蛋白表達

3 討 論

肺炎病因較為復雜,其發(fā)病機制、病理發(fā)展過程至今尚未完全明確,但臨床普遍認同的是:肺部或全身性不可控感染而形成不可控炎性反應和氧化應激反應,最終可導致機體器官實質性損傷,可損傷心肌功能〔10〕。姜黃素具有抗心肌損傷的功效。馮敬媛等〔11〕研究顯示,姜黃素可提升慢性心力衰竭大鼠心肌細胞生物學活性,改善慢性心力衰竭大鼠的心臟功能。另外有研究顯示,姜黃素可通過抑制心肌組織炎癥反應和氧化應激反應來改善心功能〔12〕。

血清TNF-α是機體炎癥反應的起始因子,是可促進心肌細胞損傷的重要誘導炎性因子〔13〕。另外由單核巨噬細胞分泌合成的血清IL-6、IL-1β炎性因子可參與細胞的增殖、凋亡過程,其高炎性反應可抑制心肌細胞活性,從而抑制心肌細胞生物活性〔14〕。氧化應激因子也是心肌細胞損傷的重要因素,在ROS高表達時,心肌細胞受氧化平衡影響而導致心肌細胞氧化損傷,MDA也可起到與ROS相似的心肌細胞氧化損傷作用〔15〕;T-AOC低表達可使機體產(chǎn)生大量超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶,從而打破機體氧化防御體系,也可產(chǎn)生心肌細胞氧化損傷作用〔16〕。本研究結果提示,姜黃素可改善炎性因子、氧化應激因子的表達,從而減輕心肌細胞損傷,起到心肌保護作用。PI3K/Akt通路是目前心肌細胞損傷的重要信號轉導通道,在該信號通路中,Akt和P-Akt均是PI3K的下游基因表達基因,Akt高表達和p-Akt低表達均可誘導絲氨酸殘基底物磷酸化,從而激活或抑制心肌細胞的炎性因子和氧化應激因子的異常表達,導致心肌細胞損傷〔17〕。在心肌損傷動物模型中,炎癥反應和氧化應激反應可持續(xù)存在,如炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的高表達,氧化應激因子ROS、MDA、T-AOC的異常表達均可激活心肌損傷信號分子通路,最終導致心肌細胞損傷〔18〕。Mohamed 等〔19〕認為PI3K/Akt通路激活,可促進大量促炎因子高表達,形成炎癥級聯(lián)放大反應,在病變組織中形成炎癥“瀑布”反應,從而打破心肌細胞氧化平衡,導致心肌損傷。本研究結果提示,調控PI3K/Akt信號通路蛋白的表達可能是姜黃素改善炎性因子、氧化應激因子對心肌細胞損傷的重要原因。