王君坦, 張宇坤

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科醫(yī)院,武漢 430022

下腰痛(lower back pain,LBP)是一種世界范圍內(nèi)常見的慢性疼痛性疾病,好發(fā)于體力勞動(dòng)者以及長(zhǎng)期久坐辦公人群。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全世界多達(dá)80%人群均遭受過不同程度的LBP癥狀,然而現(xiàn)有LBP的治療效果卻差強(qiáng)人意[1]。脊柱系統(tǒng)作為人體最重要的支撐系統(tǒng),椎間盤組織起到了緩沖人體載荷的重要功能,是人體骨骼肌肉系統(tǒng)中重要一環(huán)。研究發(fā)現(xiàn),LBP癥狀與腰椎間盤退變(intervertebral disc degeneration,IDD)息息相關(guān)。椎間盤由中央髓核(nucleus pulposus,NP)、四周纖維環(huán)以及上下軟骨終板組織構(gòu)成。IDD的病理特征主要表現(xiàn)為髓核細(xì)胞(NPC)減少和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解[2]。其中,髓核ECM是維持椎間盤彈性和功能的主要成分,其降解是IDD的主要病理特征之一。ECM的主要組分包括Ⅱ型膠原蛋白(collagen Ⅱ)和蛋白聚糖(aggrecan)。ECM的減少既包括合成減少亦包括分解增加,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)MMP-3和MMP-13在ECM降解中起到了重要作用,這也是椎間盤退行性改變的重要標(biāo)志物[3]。目前治療IDD的方法有限,多以手術(shù)清除病灶、藥物治療緩解疼痛為主,尚沒有能夠減輕IDD進(jìn)程的有效藥物。因此,尋找減緩IDD進(jìn)展,甚至逆轉(zhuǎn)IDD進(jìn)程的治療方式,成為目前脊柱退行性疾病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[4]。

外泌體是一種納米級(jí)細(xì)胞外脂質(zhì)雙層囊泡,在生理及病理?xiàng)l件下幾乎所有細(xì)胞均可分泌,其直徑大約30～150 nm,密度1.13～1.19 g/mL;不同細(xì)胞來源的外泌體大小略有差異,也是其后期篩選的重要標(biāo)志之一。初期研究認(rèn)為外泌體只是被人體細(xì)胞舍棄的細(xì)胞外成分,后期研究發(fā)現(xiàn),外泌體廣泛存在于人體的各個(gè)部位。外泌體呈扁平狀,內(nèi)部包含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物大分子,既可以通過血漿遠(yuǎn)處運(yùn)輸,也可以在相鄰細(xì)胞間互相作用,對(duì)于細(xì)胞間交流以及維持細(xì)胞的蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的平衡都具有重要的意義[5]。目前研究表明,外泌體有抑制細(xì)胞凋亡、抗衰老、促進(jìn)增殖、抑制炎性反應(yīng)的作用,同時(shí)還能促進(jìn)干細(xì)胞向特定方向分化,其功能差異由其內(nèi)含物決定。而外泌體的外雙層脂質(zhì)能夠有效保護(hù)其內(nèi)容物免受補(bǔ)體或巨噬細(xì)胞的清除,保證了外泌體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。因此改變或者重塑外泌體內(nèi)容物成了外泌體研究的熱點(diǎn),也是外泌體臨床應(yīng)用的關(guān)鍵步驟之一。

隨著表觀遺傳學(xué)、再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)研究的深入,細(xì)胞外囊泡——外泌體作為IDD治療的一種潛在手段被科研人員寄予厚望[6]。作為一種包含核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等物質(zhì)的磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)細(xì)胞外囊泡,外泌體的來源不具特異性,幾乎所有的細(xì)胞均可分泌外泌體[7],但目前以髓核間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cells,AMSCs)來源的外泌體最為常見。同時(shí),外泌體具有低免疫原性,不同來源的外泌體不會(huì)被機(jī)體免疫系統(tǒng)破壞清除[8],此特性也為外泌體治療IDD的臨床應(yīng)用提供了巨大的潛力。本文將綜合分析外泌體研究在椎間盤退變領(lǐng)域的最新動(dòng)態(tài),對(duì)不同細(xì)胞來源外泌體的功能進(jìn)行綜述,以期為后續(xù)外泌體研究及外泌體治療IDD的臨床應(yīng)用提供參考。

1 外泌體的生物學(xué)來源

外泌體的產(chǎn)生以及分泌后被相關(guān)靶細(xì)胞攝取的機(jī)制尚不完全明確。目前的研究表明,外泌體來源于腔內(nèi)囊泡。在高爾基復(fù)合體和溶酶體的作用下,多囊泡體通過依賴ESCRT(endosomal sorting complexes required for transport)途徑和非依賴ESCRT途徑內(nèi)折形成腔內(nèi)囊泡(intraluminal vesicles,ILVs),多囊泡體攜帶內(nèi)部ILVs抵達(dá)質(zhì)膜后,與質(zhì)膜融合釋放出內(nèi)部ILVs于細(xì)胞外形成外泌體[9]。研究發(fā)現(xiàn),肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白-皮質(zhì)素在調(diào)節(jié)外泌體分泌中扮演了重要角色,皮質(zhì)素、Rab27a和coronin 1b共同調(diào)節(jié)多泡晚期內(nèi)體中皮質(zhì)肌動(dòng)蛋白對(duì)接位點(diǎn)的穩(wěn)定性,此過程被認(rèn)為對(duì)外泌體的分泌起到了重要的調(diào)節(jié)作用。外泌體被靶細(xì)胞攝取主要通過3種方式:受體配體相互作用、直接膜融合和內(nèi)吞作用,根據(jù)機(jī)體器官類型、炎性狀況以及靶細(xì)胞不同,攝取方式也存在很大差異[10-14]。

由于外泌體大小、質(zhì)量、密度和沉降力等有所不同,目前外泌體的提取方法主要包括超速離心法、聚合物沉淀法和梯度離心法。在外泌體的鑒定方面,通常使用電子顯微鏡、納米粒子追蹤分析(nanoparticle trafficking analysis,NTA)、流式分析(flow cytometric analysis)、免疫印跡(Western blot,WB)等方法對(duì)外泌體的形態(tài)、數(shù)量、粒徑和標(biāo)志物進(jìn)行鑒定[15];在進(jìn)行流式及WB鑒定時(shí),常用CD90、CD105、CD73,、CD34、TSG101、ALIX、CD63、CD9、HSP70等分子作為標(biāo)志物進(jìn)行分析[16]。雖然外泌體分離及鑒定技術(shù)已逐漸成熟,但如何快速、有效、大量、高純度地制備特定外泌體以用于臨床疾病的治療,仍需進(jìn)一步研究。

2 外泌體在緩解IDD進(jìn)程中的作用及機(jī)制

作為細(xì)胞間交流的有效物質(zhì),外泌體內(nèi)容物的多樣性影響著外泌體功能的多樣性,調(diào)節(jié)著細(xì)胞從核酸復(fù)制、轉(zhuǎn)錄到蛋白質(zhì)合成、修飾等眾多細(xì)胞功能事件。外泌體磷脂雙分子層膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性保證其內(nèi)容物在運(yùn)輸過程中不易被破壞[17],從而確保了外泌體在細(xì)胞中發(fā)揮作用的有效性和及時(shí)性。外泌體結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)單性與穩(wěn)定性,為“工程化”外泌體在臨床中的廣泛應(yīng)用提供了可能。

隨著社會(huì)人口的老齡化,LBP在社會(huì)人群中的負(fù)面影響越來越引起重視。IDD作為L(zhǎng)BP的主要病因,其發(fā)生機(jī)制尚不明確。目前認(rèn)為,IDD的發(fā)病因素主要與衰老、機(jī)械因素、化學(xué)因素和遺傳因素息息相關(guān)。椎間盤微環(huán)境中的氧化應(yīng)激和炎癥因子等加速了髓核細(xì)胞(NPC)凋亡和ECM分解,從而降低了椎間盤結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,引起椎間盤突出癥、椎管狹窄癥等。因此,如何緩解NPC的凋亡、避免ECM降解,成為緩解甚至逆轉(zhuǎn)IDD的關(guān)鍵點(diǎn)[18-19]。本文將結(jié)合外泌體的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制,從多角度闡述外泌體對(duì)NPC功能的影響,為外泌體在IDD臨床治療中的應(yīng)用提供參考。

2.1 外泌體抑制NPC氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。多項(xiàng)研究表明氧化應(yīng)激是IDD發(fā)生發(fā)展的重要因素,能夠引起NPC凋亡和炎性因子、MMP等促ECM分解代謝產(chǎn)物的表達(dá)和釋放增加。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞程序性死亡方式,被認(rèn)為是NPC減少的主要方式之一。線粒體損傷產(chǎn)生的ROS是細(xì)胞內(nèi)源性氧化應(yīng)激的主要來源,最終引起NPC內(nèi)源性凋亡和ECM降解。越來越多的研究表明,通過抑制氧化應(yīng)激可以有效抑制NPC在各種應(yīng)激條件下的凋亡水平,并在動(dòng)物模型中緩解IDD進(jìn)展[20]。Hu等[21]將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體(BMSCs-Exos)與壓力模型SD大鼠的NPC共培養(yǎng),隨后通過CCK-8分析、MDA分析、TUNEL染色、JC-1染色、DCFH-DA分析等發(fā)現(xiàn),隨著BMSCs-Exos濃度升高(0、20、50、100 μg/mL),壓力模型大鼠退變NPC的細(xì)胞活力顯著增強(qiáng);同時(shí),壓力誘導(dǎo)的線粒體損傷明顯減輕,ROS生成也顯著降低?？梢夿MSCs-Exos能有效減輕壓力對(duì)NPC的毒性作用,減輕細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷,抑制壓力引起的NPC凋亡。

2.2 外泌體抑制NPC內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum,ER)是蛋白質(zhì)合成與折疊的場(chǎng)所,同時(shí)也參與維持鈣離子平衡。細(xì)胞內(nèi)環(huán)境紊亂會(huì)導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊與未折疊蛋白聚集以及鈣離子平衡紊亂。新近研究表明,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與椎間盤退變的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Xiang等[22]在健康成年人尿液中挑選出CD29、CD44、CD73陽(yáng)性的尿源性干細(xì)胞(urine-derived stem cells,USCs),并提取出大小在50～100 nm,且CD63和TSG101標(biāo)志蛋白高表達(dá)的外泌體,與壓力條件下造模的NPC共培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),外泌體共孵育組中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白(GRP78和GRP94)及其相關(guān)蛋白表達(dá)水平顯著下降,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的凋亡調(diào)節(jié)因子(CHOP)表達(dá)降低,NPC凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-12的表達(dá)明顯降低。上述結(jié)果表明USCs能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有效緩解壓力誘導(dǎo)下NPC的凋亡,伴隨著未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)的分支蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇依賴性激酶1α(IRE1α)的磷酸化水平降低,以及蛋白激酶B(Akt)和細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化水平升高。他們隨后對(duì)大鼠進(jìn)行為期0、4、8周的壓力造模,同時(shí)進(jìn)行或不進(jìn)行外泌體注射治療,最后通過MRI、CT掃描和特征性TOCSY二維光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn),外泌體的體內(nèi)注射具有良好的抑制NPC凋亡作用?？偟膩碚f,USCs能通過Akt和ERK信號(hào)通路來抑制壓力誘導(dǎo)下髓核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激和凋亡,從而在體內(nèi)有效地減輕椎間盤退變。

2.3 外泌體調(diào)節(jié)NPC自噬

自噬(autophagy)是一種細(xì)胞內(nèi)重要的分解代謝過程。在炎癥、營(yíng)養(yǎng)缺乏、壓力條件下,正常水平的自噬通過降解和回收受損成分、有毒蛋白和細(xì)胞器,有助于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)量控制和維持細(xì)胞存活。研究發(fā)現(xiàn),增強(qiáng)的自噬流能有效降低細(xì)胞IL-6,IL-1β和TNFα的表達(dá)和分泌,抑制細(xì)胞衰老和凋亡[23]。研究表明,外泌體能夠促進(jìn)自噬流水平,增加P62蛋白的表達(dá)[24]。Luo等[25]采用叔丁基過氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,TBHP)進(jìn)行IDD造模并收集正常軟骨終板干細(xì)胞(CESC)外泌體與退變軟骨終板干細(xì)胞外泌體,發(fā)現(xiàn)相比于退變組,正常組的CESC外泌體能夠通過PI3K/Akt自噬通路顯著增強(qiáng)NPC自噬活性,降低NPC凋亡水平。

2.4 外泌體抑制NPC的炎性小體激活

焦亡(pyroptosis)是細(xì)胞程序性死亡的一種形式,可被多種炎性小體激活。而炎性小體一旦激活,可導(dǎo)致多種促炎物質(zhì),如IL-1β和IL-18等炎性因子不斷釋放,并影響多種ECM分解代謝酶,如MMP、解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs,ADAMTs)的表達(dá),從而促進(jìn)蛋白聚糖和膠原蛋白的分解代謝,進(jìn)而影響IDD進(jìn)程。細(xì)胞焦亡過程會(huì)伴隨著細(xì)胞質(zhì)膜破壞和大量炎性因子分泌,因此抑制細(xì)胞焦亡是對(duì)抗炎性損傷的重要手段[26]。

Zhang等[27]研究發(fā)現(xiàn),脂多糖可以誘導(dǎo)NLRP3介導(dǎo)的髓核細(xì)胞焦亡,同時(shí)引起cleaved Caspase-1、IL-18、IL-1β和NLRP3水平顯著上升。他們對(duì)MSCs與LPS誘導(dǎo)的髓核組織進(jìn)行共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),MSCs能有效抑制NPC焦亡進(jìn)程;當(dāng)加入GW4869共培養(yǎng)48 h后,MSCs外泌體分泌被抑制,其對(duì)NPC焦亡的抑制作用被消除。而進(jìn)一步研究證實(shí),MSCs外泌體中miRNA-410水平極高,miRNA-410能直接與NLRP3炎性小體結(jié)合并抑制其下游信號(hào),從而阻止細(xì)胞內(nèi)焦亡反應(yīng),抑制IDD進(jìn)展。

2.5 外泌體促進(jìn)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞轉(zhuǎn)化

隨著再生醫(yī)學(xué)、干細(xì)胞治療、基因工程研究的不斷深入,誘導(dǎo)全能干細(xì)胞分化成特定組織細(xì)胞,從而治療組織缺損、組織變異和組織退變等相關(guān)疾病,一直是臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。Zhang等[28]篩選出富含miR-15a的間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體,并將其與退變NPC共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)ADAMTS4/5及MMP-3/-13蛋白轉(zhuǎn)錄和翻譯水平顯著下降,伴隨著蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白mRNA及蛋白水平顯著上升。進(jìn)一步研究表明,miR-15a可直接通過PI3K/Akt和Wnt3a/β-catenin軸調(diào)節(jié)MMP-3水平,從而抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)ECM的生成并抑制ECM降解。他們通過甲苯胺藍(lán)染色證實(shí),miRNA-15a能夠促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化。Luo等[29]研究發(fā)現(xiàn),軟骨終板干細(xì)胞源性外泌體在0、20、40 μg/mL水平下與軟骨終板干細(xì)胞共培養(yǎng)后,趨化因子、SOX9、Ⅱ型膠原蛋白、Ⅰ型膠原蛋白和Acan的表達(dá)水平升高。他們發(fā)現(xiàn)外泌體可通過自分泌形式增強(qiáng)軟骨終板細(xì)胞的侵襲、遷移和分化能力。軟骨終板干細(xì)胞外泌體可有效提高軟骨終板干細(xì)胞中HIF-1α水平,通過促進(jìn)Wnt信號(hào)傳導(dǎo)、增加GATA結(jié)合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor,TGF-β)的表達(dá),促進(jìn)軟骨終板干細(xì)胞向NPC轉(zhuǎn)化。

2.6 外泌體通過circRNA/miRNA調(diào)控IDD

miRNA是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中、長(zhǎng)度約為20～24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼RNA分子,可以調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)水平。miRNA主要是與靶基因mRNA的3′ UTR通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯,進(jìn)行基因表觀遺傳學(xué)修飾和調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白表達(dá)及信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo),是基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子。circRNA是一種閉環(huán)結(jié)構(gòu)的ncRNA,其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且不易受RNA外切酶的影響,廣泛存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及外泌體中。circRNA最常見作用是與miRNA結(jié)合,抑制相關(guān)miRNA功能,從而有效調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)及功能。miRNA/circRNA廣泛存在于外泌體中。由于細(xì)胞穩(wěn)態(tài)不同、存在環(huán)境差別和細(xì)胞種類差異,miRNA/circRNA在外泌體中表達(dá)量及類型也千差萬(wàn)別[30-31]。多項(xiàng)研究表明,外泌體能有效保護(hù)miRNA/circRNA在細(xì)胞傳遞過程中的穩(wěn)定性,miRNA/circRNA也能有效抑制NPC凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制炎性反應(yīng),從而促進(jìn)ECM合成,緩解IDD。因此,外泌體憑借其包含的miRNA/circRNA,在治療IDD上具有良好的臨床應(yīng)用前景。

Yuan等[32]研究發(fā)現(xiàn),人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cell,hucMSC)外泌體包裹的miR-26a-5p能夠下調(diào)甲基化轉(zhuǎn)移酶14(METT14)表達(dá),降低NLRP3、IL-1β和IL-18表達(dá)水平,抑制細(xì)胞焦亡及炎性反應(yīng),從而緩解IDD進(jìn)程。Xu等[33]研究發(fā)現(xiàn),來源于富含血小板血漿的包裹miR-141-3p的外泌體與過氧化氫(H2O2)誘導(dǎo)的退變NPC共培養(yǎng)后,miR-141-3p能夠與Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(keap1) mRNA的3′ UTR結(jié)合,降低keap1的表達(dá),引起核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)從keap1-Nrf2復(fù)合小體中釋放并從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)位,從而發(fā)揮其抗氧化的生物學(xué)功能,最終抑制NPC凋亡;體內(nèi)研究也表明,miR-141-3p可以通過keap1-Nrf2通路延緩IDD進(jìn)展。Zhang等[34]的研究發(fā)現(xiàn),自噬可以促進(jìn)NPC來源外泌體的分泌,其包裹的miR-27a可靶向MMP-13,并抑制MMP-1、3、9、13以及ADAMTs 4、5基因的表達(dá),最終增加蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá),促進(jìn)ECM穩(wěn)定性。Xie等[35]分離包裹miR-31-5p的間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體,并將其與TBHP造模的退變NPC共培養(yǎng)。他們發(fā)現(xiàn)miR-31-5p顯著降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活作用轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)的表達(dá)水平,同時(shí),NPC凋亡相關(guān)蛋白和鈣化相關(guān)蛋白顯著下降,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志性表達(dá)產(chǎn)物下調(diào)。包裹miR-31-5p的外泌體能通過ATF6/ER-Stress通路減輕髓核細(xì)胞凋亡及鈣化,維持NPC活性,減緩IDD進(jìn)展,從而對(duì)椎間盤組織起到保護(hù)作用。

3 外泌體與生物材料結(jié)合的新發(fā)展

目前,越來越多的研究表明,不同干細(xì)胞來源的外泌體能夠顯著延緩IDD進(jìn)展。外泌體對(duì)于抑制NPC凋亡、代謝紊亂、ECM降解等作用亦日趨明確。通過干細(xì)胞來源的外泌體途徑治療IDD雖有效果,但無法避開干細(xì)胞外泌體被體內(nèi)清除和破壞的弊端。干細(xì)胞來源外泌體無法在體內(nèi)持久發(fā)揮作用是外泌體在臨床治療應(yīng)用中遇到的一大阻礙,找到一種合適的方法促進(jìn)外泌體的緩釋并減少其降解,成為外泌體研究的熱點(diǎn)方向。水凝膠(hydrogel)是一種親水類聚合物,具有通過共價(jià)鍵和氫鍵作用交聯(lián)形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[36]。水凝膠具有良好的生物相容性、較大的比表面積以及良好的生物可控性,是藥物和生物化學(xué)產(chǎn)物良好的載體,同時(shí)具有良好的生物支撐性[37]。水凝膠優(yōu)良的特性,提示了其在臨床治療領(lǐng)域發(fā)揮作用的可能性。生物材料與外泌體的強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合,為抑制NPC凋亡和ECM代謝紊亂,延緩IDD進(jìn)展打開了新的思路。

Xing等[38]采用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSC)制備表達(dá)外泌體標(biāo)志蛋白ALIX、TSG101的外泌體,同時(shí)采用新型方法制備了一種具有良好熱敏性、脫細(xì)胞成分的ECM水凝膠,這種新型水凝膠不含有毒的交聯(lián)劑,其特性更類似于髓核組織。他們將富集得到的外泌體固定于ECM水凝膠上,形成富含脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體的熱敏脫細(xì)胞ECM水凝膠(dECM@exo)。這種外泌體水凝膠在37℃時(shí)具有高粘度,同時(shí)其緩釋曲線表明,在28 d里dECM@exo逐漸釋放了大部分的外泌體,這表明其具有良好的緩釋性和持續(xù)性。他們將dECM@exo與NPC共培養(yǎng),并進(jìn)行免疫熒光、細(xì)胞活力測(cè)試和熒光染色等實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)dECM@exo具有良好的生物相容性。而MMP13作為ECM降解的主要分解代謝酶之一,dECM@exo能有效抑制其表達(dá),從而減少ECM降解。dECM@exo還降低了NLRP3、cleaved Caspase-1、NT-GSDMD和IL-1β的表達(dá),并降低了細(xì)胞焦亡水平。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,他們通過針刺進(jìn)行大鼠尾巴退變?cè)炷?在培養(yǎng)0、4、8、16周后進(jìn)行椎間盤高度和免疫組化等檢測(cè),發(fā)現(xiàn)dECM@exo能夠有效地維持椎間盤高度、抑制蛋白聚糖和Ⅱ型膠原蛋白分解,從而顯著延緩IDD進(jìn)程。

4 總結(jié)與展望

目前的研究顯示,外泌體具有良好的抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗細(xì)胞外基質(zhì)降解、促進(jìn)干細(xì)胞分化、促細(xì)胞增殖的作用。外泌體還能通過非編碼RNA的細(xì)胞間遞送,進(jìn)行表觀遺傳修飾并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)及細(xì)胞功能。在IDD的治療中,外泌體能夠通過多種途徑抑制NPC凋亡并維持ECM合成和分解的穩(wěn)定。雖然外泌體具有抑制IDD進(jìn)展的作用,但其具體機(jī)制尚不完全明確。部分研究表明,外泌體具有“雙刃劍”功能,既可延緩?fù)俗冞M(jìn)程,也可能加重退變[12],主要取決于外泌體來源的細(xì)胞。同時(shí),如何有效地篩選、制備、存儲(chǔ)和運(yùn)輸外泌體,也是外泌體研究的一大難題。其次,如何保證外泌體在椎間盤高滲、低氧環(huán)境下保持活性并長(zhǎng)期有效釋放,從而持續(xù)發(fā)揮抵抗退變進(jìn)展的作用,目前尚未得到答案。令人振奮的是,通過外泌體與生物技術(shù)有效結(jié)合,將外泌體與生物材料進(jìn)行優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),提高了外泌體在臨床實(shí)際應(yīng)用的可能性。相信隨著對(duì)外泌體作用機(jī)制的不斷研究,外泌體在治療椎間盤退變及其他醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景將更加光明。