董利軍 祁慧 楊宇航 毛星星 張國(guó)明 張少?zèng)_ 雷和田

深圳市眼科醫(yī)院 暨南大學(xué)附屬深圳眼科醫(yī)院 深圳市眼病防治研究所,深圳 518040

早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity,ROP)是一種由于視網(wǎng)膜發(fā)育障礙導(dǎo)致血管異常增生的潛在致盲眼病,早產(chǎn)兒數(shù)量的急劇增加使ROP已成為全球兒童盲的主要原因之一[1]。視網(wǎng)膜激光光凝是ROP的一線治療方案,但對(duì)Ⅰ區(qū)病變和急進(jìn)型后極部ROP治療效果欠佳[2]。隨著對(duì)ROP發(fā)病機(jī)制的深入研究,玻璃體腔注射抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)藥物已經(jīng)成為一種有效治療ROP的新手段[3]。但是,有大量文獻(xiàn)報(bào)道了注射抗VEGF藥物產(chǎn)生的不良事件,尤其是腎相關(guān)疾病,包括蛋白尿惡化、高血壓和血管凝血事件以及腎小球相關(guān)疾病[4-7]。ROP和腎損傷是氧化應(yīng)激反應(yīng)誘發(fā)的早產(chǎn)兒典型疾病,早產(chǎn)兒極易受到氧化應(yīng)激的影響,氧化劑和抗氧化劑之間的不平衡導(dǎo)致自由基水平升高,進(jìn)而對(duì)器官造成氧化損傷[8]。在大鼠氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變(oxygen-induced retinopathy,OIR)模型中,腎皮質(zhì)中VEGF-A和血小板衍生因子β的表達(dá)在出生第5天(P5)和P19時(shí)與Ⅰ期ROP和Ⅱ期ROP相似,表明高氧誘導(dǎo)腎臟生成受損的機(jī)制與ROP相似[9]。因此推測(cè)2種組織在高氧誘導(dǎo)下的病理變化可能有一定關(guān)聯(lián),而從代謝組學(xué)的角度探討OIR小鼠腎組織與血漿的代謝機(jī)制可能為相關(guān)研究和臨床工作提供新的思路。OIR模型是一種公認(rèn)的研究視網(wǎng)膜新生血管疾病的動(dòng)物模型[10-11]。OIR模型的高通量轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)大量的分子網(wǎng)絡(luò)和潛在的治療靶點(diǎn)[12-14]。然而,許多生命活動(dòng)發(fā)生在代謝物層面,如細(xì)胞信號(hào)釋放、能量傳遞、細(xì)胞間通信等都受代謝物調(diào)控[15]。因此,可通過(guò)代謝組學(xué)分析來(lái)識(shí)別疾病的病理過(guò)程[16]。代謝組學(xué)已廣泛應(yīng)用于ROP及其他視網(wǎng)膜病理性新生血管增生類疾病的研究中,如增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者玻璃體液和ROP患者血漿[11,17]、OIR動(dòng)物模型血漿及視網(wǎng)膜等樣本中代謝產(chǎn)物的差異研究等[18]。然而,臨床研究和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)氧代謝相關(guān)疾病可同時(shí)引起眼部和腎組織相似反應(yīng),但ROP與早產(chǎn)兒高氧導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制研究很少,其致病機(jī)制是否也相似需進(jìn)一步證實(shí)。本研究擬采用非靶向代謝組學(xué)方法分析OIR小鼠腎勻漿的代謝產(chǎn)物變化,結(jié)合OIR小鼠靶向代謝組學(xué)的的方式探討高氧導(dǎo)致的腎損傷及ROP病理性新生血管形成的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取16只7日齡健康SPF級(jí)C57/B6J小鼠及相應(yīng)母鼠,小鼠雌雄不限,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006]。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為OIR組和正常對(duì)照組,每組8只,采用常規(guī)飼料喂養(yǎng)小鼠,飼養(yǎng)于北京大學(xué)深圳研究生院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室[SYXKC(粵)2017-0172]。動(dòng)物飼養(yǎng)及使用均嚴(yán)格按照暨南大學(xué)倫理委員會(huì)要求,研究方案經(jīng)暨南大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào):20200401-54)。

1.1.2主要試劑及儀器 甲醇、甲酸、乙腈(北京索萊寶科技有限公司);L-2-氯苯丙氨酸、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、4%多聚甲醛、Triton X-100、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)(廣州哲泰生物科技有限公司);異凝集素(Isolectin B4,IB4)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);抗熒光淬滅封片劑(北京索萊寶科技有限公司)。動(dòng)物氧箱(YCP1600,長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司);全自動(dòng)樣品快速研磨儀(Wonbio-E,上海萬(wàn)柏生物科技有限公司);臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-16MS,上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司);冷凍濃縮離心干燥器(LNG-T98,太倉(cāng)市華美生化儀器廠);超聲波清洗機(jī)(F-060SD,深圳福洋科技集團(tuán)有限公司);QEplus高分辨質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技公司);ACQUITY UPLC I-Class plus高效液相色譜儀、ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm,1.8 μm色譜柱(美國(guó)Waters公司);AX激光掃描共聚焦顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2 方法

1.2.1OIR小鼠模型的建立 取OIR組小鼠,根據(jù)參考文獻(xiàn)[19]中OIR的方法制備OIR模型,自P8起,將小鼠及其母鼠置于(75±2)%的動(dòng)物氧箱中,每隔2 d更換墊料、飼料、水和母鼠,高氧環(huán)境下連續(xù)飼養(yǎng)5 d后(P12)更換至正常環(huán)境中繼續(xù)飼養(yǎng)5 d(P17)。正常對(duì)照組8只小鼠于正常環(huán)境飼養(yǎng)至出生后第17天(P17)。

1.2.2小鼠視網(wǎng)膜鋪片IB4染色觀察視網(wǎng)膜血管增生情況 根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]中的方法,各組小鼠于P17行CO2安樂死,取出小鼠視網(wǎng)膜后用PBS清洗血漬,吸水紙吸去多余水分,置于4%多聚甲醛中固定30 min,轉(zhuǎn)移至0.5% Triton X-100中破膜過(guò)夜,PBS清洗3次并于體視顯微鏡下清除黏附雜質(zhì),轉(zhuǎn)移至1%BSA溶液稀釋的IB4染色劑(1∶200)中避光孵育過(guò)夜。將染色后的視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移至凹形載玻片,并于視網(wǎng)膜中心3:00、6:00、9:00、12:00方向1 mm處切開分成4個(gè)象限平鋪于載玻片上,避光滴加4 ℃預(yù)冷的冰甲醇固定10 min,重復(fù)操作2次。預(yù)冷PBS漂洗3次后吸干多余PBS,滴加抗熒光淬滅封片劑封片后用激光掃描共聚焦顯微鏡采集圖像。

1.2.3小鼠血漿氨基酸類代謝物的靶向代謝組學(xué)分析 各組小鼠于P17通過(guò)眼眶內(nèi)眥靜脈采血500 μl,采集的血液存放于EDTA抗凝管內(nèi),離心半徑10 cm,4 ℃下3 000 r/min離心10 min,取上清血漿保存于-80 ℃中,用于靶向代謝組學(xué)測(cè)定。4 ℃條件下融化血漿樣品,在100 μl血漿樣品中加入400 μl無(wú)水乙腈,劇烈振蕩30 s,室溫下靜置10 min,4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min,收集上清液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾,取150 μl濾液進(jìn)行靶向代謝組學(xué)測(cè)定。儀器參數(shù)設(shè)置如下:流動(dòng)相為80%乙腈(15.4 mol/L)的等溫洗脫;流速為140 μl/min。中性氨基酸采用中性損失掃描進(jìn)行掃描,中性損失片段的質(zhì)荷比(mass-to-charge ratio,m/z)為102 Da,掃描范圍為m/z 140到m/z 280。?；鈮A分析采用前體掃描方法進(jìn)行,子離子為m/z 85 Da片段,掃描范圍為m/z 210到m/z 502。甘氨酸、鳥氨酸、精氨酸和檸檬酸采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

1.2.4液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)小鼠腎組織中代謝物 用CO2將小鼠安樂死,用滅菌手術(shù)剪及鑷子開腹并取出腎組織,用預(yù)冷PBS洗去血漬,吸干表面水漬,裝入無(wú)菌EP管,用液氮速凍15 min,于-80 ℃保存。取30 mg小鼠腎組織置于1.5 ml EP管中,分別加入20 μl含0.06 mg/ml的L-2-氯苯丙氨酸甲醇溶液和400 μl 80%甲醇溶液,置于-20 ℃中預(yù)冷2 min后用功率為60 Hz的研磨機(jī)研磨2 min,置于冰水中超聲(超聲功率500 W,頻率40 kHz)提取10 min,于-20 ℃中靜置30 min。4 ℃條件下13 000 r/min離心10 min,取300 μl上清液裝入LC-MS進(jìn)樣小瓶中揮干,用300 μl體積分?jǐn)?shù)20%甲醇渦旋30 s,超聲3 min進(jìn)行復(fù)融,-20 ℃靜置2 h,4 ℃條件下13 000 r/min離心10 min,取150 μl上清液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾后轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶,進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatograph mass spectrometer,LC-MS)檢測(cè)。所有樣本的提取液等體積混合制備成質(zhì)控樣本。

采用ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 um)色譜柱,保持柱溫為45 ℃,進(jìn)樣體積為2 μl;流動(dòng)相中水相為0.1%甲酸水溶液,有機(jī)相為含有0.1%甲酸的乙腈溶液,流速為0.35 ml/min。采用梯度洗脫:0.01～2 min,5%有機(jī)相;2～4 min,5%～30%有機(jī)相;4～8 min,30%～50%有機(jī)相;8～10 min,50%～80%有機(jī)相;10～14 min,80%～100%有機(jī)相;14～15 min,100%有機(jī)相;15～15.1 min,100%～5%有機(jī)相;15.1～16 min,5%有機(jī)相。樣品質(zhì)譜信號(hào)采集采用正負(fù)離子掃描模式,離子源為電噴霧電離離子源(ESI),正負(fù)離子噴霧電壓分別設(shè)定為3 800 V和-3 000 V,正負(fù)離子輔助鞘氣流速和輔助氣體流量分別設(shè)定為40 Arb、10 Arb和35 Arb、8 Arb。毛細(xì)管溫度為320 ℃,輔助燃?xì)饧訜崞鳒囟葹?50 ℃,質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1 200 Da,全毫秒分辨率和MS/MS分辨率為70 000和17 500,階梯式NCE梯度為10、20、40 eV。

1.2.5采用生物信息學(xué)法分析腎組織中的差異代謝物 采用代謝組學(xué)處理軟件Progensis QI v2.3對(duì)LC-MS獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行基線過(guò)濾、峰識(shí)別、積分、保留時(shí)間校正、峰對(duì)齊和歸一化,根據(jù)精確質(zhì)量數(shù)(誤差小于5個(gè)ppm)、二級(jí)碎片以及同位素分布對(duì)化合物進(jìn)行鑒定,采用METLIN、Lipidmaps(v2.3)和人代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(Human Metabolome Database,HMDB)及上海鹿明生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析。根據(jù)化合物定性結(jié)果評(píng)分對(duì)提取的數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選,將高于36分的化合物合并成1個(gè)包含保留時(shí)間、m/z、峰強(qiáng)度和樣品信息的數(shù)據(jù)矩陣。

對(duì)數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析,首先采用無(wú)監(jiān)督的主成分分析(principal component analysis,PCA)來(lái)觀察各組腎組織樣本之間的總體分布和整個(gè)分析過(guò)程的穩(wěn)定性;然后采用有監(jiān)督的偏最小二乘法分析(partial least-squares-discriminant analysis,PLS-DA)及正交偏最小二乘法分析(orthogonal partial least-squares-discriminant analysis,OPLS-DA)區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異,在此過(guò)程中用參數(shù)R2X、解釋率R2Y和預(yù)測(cè)率Q2進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)(response permutation testing,RPT)法考察模型質(zhì)量,防止模型過(guò)擬合。根據(jù)OPLS-DA模型得到變量權(quán)重值(variable importance of projection,VIP),以VIP>1為篩選條件評(píng)估2個(gè)組之間有差異的代謝產(chǎn)物及其倍數(shù)變化(fold change,FC)。

1.2.6腎組織代謝產(chǎn)物KEGG富集通路分析 對(duì)篩選得到的差異代謝物利用其KEGG ID在KEGG(http://www.kegg.jp)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析,應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出與整個(gè)背景相比,在顯著性差異表達(dá)代謝物中顯著富集的代謝通路,以P≤0.05為閾值,滿足此條件的代謝通路為在差異代謝物中顯著富集的代謝通路,P值越小,則該代謝通路的富集越顯著。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 2個(gè)組小鼠視網(wǎng)膜血管分布及無(wú)灌注區(qū)相對(duì)面積比較

視網(wǎng)膜鋪片IB4染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照組P17小鼠視網(wǎng)膜血管均勻分布于整個(gè)視網(wǎng)膜,血管走行正常;OIR組小鼠視網(wǎng)膜中央出現(xiàn)大面積的無(wú)灌注區(qū),與血管區(qū)界限明顯,其分界處形成大量新生血管簇,血管走行紊亂(圖1)。OIR組視網(wǎng)膜無(wú)灌注區(qū)相對(duì)面積為(25.16±3.50)%,明顯大于正常對(duì)照組的(0.63±0.30)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.07,P<0.001)。

圖1 2個(gè)組小鼠視網(wǎng)膜血管分布及定量分析(標(biāo)尺=500 μm,IB4) A:正常對(duì)照組小鼠視網(wǎng)膜血管分布正常 B:OIR組小鼠視網(wǎng)膜血管迂曲,中央?yún)^(qū)可見大面積無(wú)灌注區(qū)

2.2 2個(gè)組小鼠腎組織差異代謝產(chǎn)物差異及其倍數(shù)比較

PCA結(jié)果顯示,OIR組與對(duì)照組小鼠的腎組織樣本主成分PC1和PC2上投影的得分在坐標(biāo)軸上相距較遠(yuǎn),樣本之間總體區(qū)分明顯。OPLS-DA模型中R2X cum為0.578,R2Y cum為0.978,Q2 cum為0.857,均大于0.5,表明該模型與數(shù)據(jù)擬合良好,具有較好的預(yù)測(cè)能力。循環(huán)交互驗(yàn)證和RPT驗(yàn)證OPLS-DA模型中的R2和Q2分別為0.9和-0.488,所有R2和Q2均低于原始值,表明模型不存在過(guò)度擬和。OPLS-DA評(píng)分圖顯示,OIR組和正常對(duì)照組代謝產(chǎn)物分別位于模型投影左側(cè)和右側(cè)且相距較遠(yuǎn),表明2個(gè)組間小鼠代謝產(chǎn)物明顯不同(圖2)。

圖2 2個(gè)組小鼠腎組織代謝產(chǎn)物分析圖 A:PCA表達(dá)的代謝產(chǎn)物總體分布圖 B:OPLS-DA測(cè)試的代謝輪廓圖 C:RPT的反應(yīng)排序圖 藍(lán)色矩形和紅色三角分別代表正常對(duì)照組小鼠腎組織樣本和OIR組腎組織小鼠樣本

OPSL-DA模型載荷圖顯示,代謝物磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、左旋異亮氨酸、左旋組氨酸、2-羥基苯丙烯酸權(quán)重較大,可能是缺氧條件下導(dǎo)致血管增生的主要因子,而OPLS-DA S-plot圖顯示,PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、左旋異亮氨酸與主成分具有良好的相關(guān)性(圖3)。

圖3 2個(gè)組小鼠腎組織代謝產(chǎn)物OPLS-DA模型的載荷圖和S-plot圖 A:載荷圖 圖中每個(gè)點(diǎn)代表一種代謝物,代謝物距離載荷圖中心的距離越遠(yuǎn),載荷值越接近于-1或1,即該代謝產(chǎn)物作用愈大 B:S-plot圖 橫坐標(biāo)是組間比較的代謝產(chǎn)物與影響的特征值,縱坐標(biāo)是代謝產(chǎn)物得分。代謝產(chǎn)物越靠近右上角和左下角,表示組間差異越顯著

依據(jù)OPLS-DA模型第一主成分VIP>1為篩選標(biāo)準(zhǔn),共篩選出組間差異代謝物236個(gè),其中表達(dá)上調(diào)134個(gè),下調(diào)102個(gè)(圖4)。

圖4 2個(gè)組小鼠腎組織差異代謝產(chǎn)物火山圖 圓點(diǎn)越大提示VIP值越大,VIP值≥1且遠(yuǎn)離坐標(biāo)軸原點(diǎn)者為優(yōu)先考慮的潛在生物標(biāo)志物 VIP:變量權(quán)重值;FC:倍數(shù)變化

2.3 2個(gè)組小鼠腎組織差異代謝物的鑒定及分層聚類分析

對(duì)篩選的VIP值>1結(jié)合t檢驗(yàn)中P<0.05的差異代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)在HMDB、Lipidmaps、METLIN以及自建庫(kù)進(jìn)行比對(duì)鑒定,得到26種有意義的化合物(表1)。OIR組小鼠腎組織中甘油磷脂類化合物PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0和PC22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0代謝產(chǎn)物表達(dá)上調(diào),PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)和PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])代謝產(chǎn)物表達(dá)下調(diào)。氨基酸類代謝物精氨酸、鳥氨酸、哌可酸和羥基賴氨酸代謝產(chǎn)物水平升高。

表1 2個(gè)組小鼠腎組織中主要差異代謝產(chǎn)物比較Table 1 Comparison of main differential metabolites in mouse kidney tissue between OIR group and normal control group代謝物分子式VIPLog2(FC)P值PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)C42H78NO8P23.10-0.76a<0.000 1PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])C43H78NO8P21.87-0.92a0.000 5L-isoleucineC6H13NO221.590.26b0.000 53,4-dihydro-2H-1-benzopyran-2-oneC9H8O220.680.25b0.000 42-hydroxycinnamic acidC9H8O313.310.16b0.004 4L-histidinolC6H11N3O12.82-0.15a0.000 4PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0C28H50NO7P11.380.27b0.000 8PC 22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0C30H50NO7P10.890.38b0.001 7L-pipecolic acidC6H11NO29.080.28b0.000 3L-histidineC6H9N3O24.960.25b<0.000 1phosphoglycolic acidC2H5O6P3.910.10b0.000 4oxypurinolC5H4N4O23.890.32b0.001 2guanosineC10H13N5O53.49-0.74a0.000 2L-ornithineC5H12N2O23.470.46b0.001 015-methylpalmitateC17H34O22.89-0.14a0.000 3N-acetylmannosamineC8H15NO62.630.28b0.002 05-hydroxylysineC6H14N2O32.290.53b0.000 3guanineC5H5N5O2.21-0.70a0.000 12,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-olC17H32O2.12-0.16a0.001 6N-acetyl-D-glucosamineC8H15NO61.840.37b0.000 3L-arginineC6H14N4O27.330.28b0.001 1L-glutamineC5H10N2O31.680.75b0.004 5hypoxanthineC5H4N4O9.430.13b0.010 0L-prolineC5H9NO210.700.22b0.003 9adenosine monophosphateC10H14N5O7P2.05-0.27a0.033 8adenosineC10H13N5O42.01-0.40a0.045 3 注:P值表示富集顯著性 a:下調(diào)產(chǎn)物;b:上調(diào)產(chǎn)物 VIP:變量權(quán)重值;FC:倍數(shù)變化 Note:P value indicated enrichment significance a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expression VIP:variable importance of projection;FC:fold change

分層聚類分析結(jié)果顯示,相較于正常對(duì)照組,OIR組腎組織中氨基酸類代謝物精氨酸、鳥氨酸、哌可酸、脯氨酸和羥基賴氨酸含量及甘油磷脂類化合物PC 14∶1(9Z)/20∶2(11Z,14Z)、PE P-18∶0/20∶4(6E,8Z,11Z,14Z)(5OH[S])含量均明顯升高,PC 20∶4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0∶0、PC 22∶6(4Z,7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0∶0含量及嘌呤類(鳥嘌呤、羥嘌醇)和脂肪酸類(15-棕櫚酸甲酯、2,6,8,12-tetramethyl-2,4-tridecadien-1-ol)含量均降低(圖5)。

圖5 2個(gè)組小鼠主要差異代謝產(chǎn)物聚類熱圖 垂直軸代表代謝產(chǎn)物,水平軸代表不同樣本組。紅色表示代謝產(chǎn)物含量最高,藍(lán)色表示含量最低,軸上的分叉越近說(shuō)明相似度越高 OIR:氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變;WT:野生型

2.4 2個(gè)組小鼠腎組織中差異代謝產(chǎn)物KEGG通路富集

差異代謝物KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,差異代謝產(chǎn)物的前10個(gè)富集通路主要涉及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘌呤代謝、癌癥中的膽堿代謝、氨酰-tRNA生物合成、mTOR信號(hào)通路、精氨酸生物合成、蛋白質(zhì)消化吸收、嗎啡成癮、癌癥中的中心碳代謝、cGMP-PKG信號(hào)通路(圖6)。

圖6 2個(gè)組小鼠主要差異代謝產(chǎn)物排名前20 KEGG富集通路氣泡圖 富集因子越大,提示富集程度越高;氣泡點(diǎn)越大,說(shuō)明該通路上發(fā)生變化的代謝物越多

2.5 小鼠血漿氨基酸類代謝產(chǎn)物的靶向鑒定

根據(jù)VIP值結(jié)合t檢驗(yàn)P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)小鼠血漿氨基酸類代謝產(chǎn)物在HMDB、Lipidmaps、METLIN以及自建庫(kù)比對(duì)鑒定得到11種具有明顯差異的主要氨基酸類代謝物。與正常對(duì)照組比較,OIR組小鼠血漿內(nèi)天冬酰胺和丁酰肉堿的代謝水平降低,纈氨酸、酪氨酸、亞油基肉堿、半胱氨酸、十四碳二烯酰肉堿、丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和癸二烯酰肉堿的代謝水平明顯升高(表2)。KEGG通路分析表明,這些代謝產(chǎn)物主要富集在氨酰-tRNA生物合成,精氨酸生物合成,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝,泛酸和CoA生物合成,癌癥中的中心碳代謝,纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等信號(hào)通路(圖7)。

圖7 2個(gè)組小鼠血漿主要差異代謝產(chǎn)物聚類熱圖和KEGG通路分析 A:小鼠血漿主要差異代謝產(chǎn)物聚類熱圖 B:代謝通路富集圖 WT:野生型;OIR:氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變

3 討論

ROP是一種以視網(wǎng)膜缺血、病理性新生血管形成為特點(diǎn),發(fā)生于早產(chǎn)兒和低出生體重兒的不可逆致盲視網(wǎng)膜病變,主要特征是玻璃體中VEGF表達(dá)水平上調(diào),但其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn),大鼠OIR模型中同時(shí)存在高氧誘導(dǎo)的腎生成受損機(jī)制,認(rèn)為其可能是由活性氧和VEGF-A引起的微血管生成改變所致[9]。VEGF在維持正常腎功能方面也起著至關(guān)重要的作用,從足細(xì)胞釋放的VEGF與腎小球毛細(xì)血管上的VEGF受體2相互作用,促進(jìn)內(nèi)皮孔的完整性和維持由此產(chǎn)生的腎小球屏障功能[21],而缺氧會(huì)誘導(dǎo)VEGF分泌,充足和適量VEGF的產(chǎn)生和血管生成對(duì)腎臟和眼組織正常功能的維持是必要的,但高水平的VEGF會(huì)導(dǎo)致血管過(guò)度生成,從而導(dǎo)致ROP、糖尿病視網(wǎng)膜病變和腎病等的發(fā)生[22-24]。而以O(shè)IR小鼠為研究對(duì)象,用代謝組學(xué)的方法探尋高氧導(dǎo)致腎損傷的機(jī)制,可以從人體的整合醫(yī)學(xué)角度為ROP的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。

本研究中,OIR小鼠腎組織勻漿中氨酰-tRNA生物合成相關(guān)的代謝物表達(dá)增多。已有研究顯示,ROP患者和OIR模型大鼠的血漿中、OIR模型小鼠的視網(wǎng)膜勻漿中氨酰-tRNA生物合成通路代謝物發(fā)生變化[17,20,25]。同時(shí)有研究報(bào)道白內(nèi)障合并糖尿病患者房水中氨酰-tRNA生物合成通路代謝物發(fā)生變化[26]。在秀麗隱桿線蟲的正向遺傳篩選得到的編碼氨酰-tRNA合成酶的基因合成酶的rrt-1,敲除rrt-1和大多數(shù)其他編碼氨酰-tRNA合成酶的基因,可以使動(dòng)物免于缺氧誘導(dǎo)的死亡[27]。因此,高氧誘導(dǎo)腎損傷的發(fā)病可能與氨酰-tRNA的生物合成有關(guān)。

表2 OIR組與正常對(duì)照組小鼠血漿主要氨基酸類差異代謝物比較Table 2 Comparison of differential amino acid metabolites in mouse plasma between OIR group and control group代謝物分子式VIPLog2FCP值asparagineH2NCOCH2CH(NH2)CO2H3.21-0.28a0.003 7 valine(CH3)2CHCH(NH2)CO2H2.620.62b0.000 7tyrosine4-(HO)C6H4CH2CH(NH2)CO2H2.541.04b0.000 7linoleylcarnitineC25H45NO42.430.66b0.000 5cysteineHSCH2CH(NH2)CO2H2.320.61b0.002 6butyrylcarnitineC11H21NO42.26-0.58a0.002 8tetradecadienoylcarni-tineC21H41NO42.160.84b<0.000 1alanineC3H7NO21.840.99b0.001 3citrullineC6H13N3O31.700.24b0.004 2 tryptophanC11H12N2O21.320.39b0.004 3decadienoylcarnitineC17H29NO41.070.20b0.046 9 注:a:下調(diào)產(chǎn)物;b:上調(diào)產(chǎn)物 OIR:氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變;VIP:變量權(quán)重值;FC:倍數(shù)變化 Note:a:down-regulation of expression;b:up-regulation of expression OIR:oxygen-induced reti-nopathy;VIP:variable importance of projection;FC:fold change

本研究中,OIR組小鼠腎組織勻漿中精氨酸、鳥氨酸、谷氨酸和脯氨酸表達(dá)增多,這4種氨基酸是“精氨酸和脯氨酸代謝途徑”的重要組成部分。Lu等[18]認(rèn)為精氨酸和脯氨酸代謝是造成大鼠血管增生的主要途徑。Wang等[28]研究結(jié)果表明,GCN2/ATF4通路通過(guò)氨基酸介導(dǎo)的VEGF表達(dá)促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管生成,而限制氨基酸通過(guò)GCN2/ATF4途徑誘導(dǎo)血管生成能夠調(diào)節(jié)VEGF和H2S的產(chǎn)生[29]。此外,氨基酸剝奪能夠誘導(dǎo)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞株VEGF的表達(dá)[30]。因此,氨基酸及其相關(guān)途徑可能在高氧誘導(dǎo)腎損傷的發(fā)病中發(fā)揮重要作用,而在OIR小鼠血漿樣本靶向氨基酸代謝組學(xué)中,精氨酸生物合成通路同樣富集大量差異代謝物,表明在高氧誘導(dǎo)下腎損傷與視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制可能具有相似性。進(jìn)一步的研究需要揭示氨基酸代謝的功能和機(jī)制以及這些交叉參與的途徑在視網(wǎng)膜新生血管中的作用。

本研究結(jié)果還顯示,OIR組小鼠血漿中蛋白質(zhì)的消化與吸收通路發(fā)生改變,與既往對(duì)ROP患者血漿和OIR小鼠視網(wǎng)膜的代謝組學(xué)分析結(jié)果一致[17-18,31]。蛋白質(zhì)的消化和吸收在促進(jìn)早產(chǎn)兒發(fā)育和降低早產(chǎn)兒患病風(fēng)險(xiǎn)方面起著重要作用[32]。本研究還發(fā)現(xiàn)OIR小鼠腎勻漿中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)代謝產(chǎn)物大量富集,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是在長(zhǎng)期進(jìn)化中形成的高度保守的一大基因家族編碼的一類跨膜蛋白,含有負(fù)責(zé)多種底物跨細(xì)胞膜運(yùn)輸?shù)哪さ鞍?。這些底物包括代謝產(chǎn)物、藥物、毒素、內(nèi)源性脂類、多肽、核苷酸和甾醇[33]。在低氧狀態(tài)下,已證實(shí)其對(duì)P-糖蛋白編碼基因(ABCB1)的調(diào)節(jié)作用[34]。而ABCA1基因也在低氧誘導(dǎo)下在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[35],其已經(jīng)被證實(shí)能夠通過(guò)介導(dǎo)ABCA1基因表達(dá)來(lái)抑制黑色素瘤血管生成和發(fā)展[36]。

同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn),OIR小鼠腎組織嘌呤代謝途徑中代謝物發(fā)生變化,而在ROP相關(guān)的代謝物研究中未見報(bào)道,而嘌呤代謝途徑可能與糖尿病微血管并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)[37]。本研究中代謝物腺苷含量降低,次黃嘌呤和黃嘌呤含量升高,嘌呤代謝循環(huán)中,腺苷被轉(zhuǎn)化成腺嘌呤,然后脫氨形成肌苷,肌苷被轉(zhuǎn)化為次黃嘌呤,次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下被轉(zhuǎn)化為黃嘌呤,黃嘌呤也是黃嘌呤氧化酶的底物,可增加超氧化物的生成。而超氧化物能夠刺激機(jī)體新生血管生成[38]。

總之,本研究確定了OIR小鼠腎組織勻漿中代謝譜的變化。通過(guò)生物信息學(xué)分析,ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、嘌呤代謝途徑、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸生物合成和蛋白質(zhì)的消化與吸收是與發(fā)生改變的代謝物相關(guān)的主要KEGG途徑。這些代謝物以及涉及的代謝途徑,可能參與了腎損傷和視網(wǎng)膜新生血管疾病的病理過(guò)程。然而本研究中未能同時(shí)綜合分析OIR小鼠血漿、視網(wǎng)膜以及腎勻漿樣本代謝產(chǎn)物,不利于發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的腎損傷和ROP發(fā)病機(jī)制之間的關(guān)聯(lián),還要通過(guò)化合物誘導(dǎo)以及基因敲除的方式在后續(xù)研究中對(duì)本研究篩選到的代謝物以及代謝通路進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)一步探討其具體的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明董利軍:參與醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、文章撰寫;祁慧、楊宇航、毛星星:參與實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù);張國(guó)明、張少?zèng)_:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文指導(dǎo);雷和田:參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、論文審閱及定稿