趙 敏，隗予榮，楊雁冰，袁 荃

（武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072）

熒光成像可以非侵入性的方式獲取細(xì)胞、組織的關(guān)鍵信息，為醫(yī)學(xué)診斷、疾病治療和生物學(xué)機(jī)制研究提供重要的指導(dǎo)作用［1］。熒光成像具有可視化、測(cè)量速度快、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高和破壞性低等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為從生物組織中獲取細(xì)胞或亞細(xì)胞分辨率分子事件的有力可視化工具［2-6］。生物組織成分復(fù)雜，常規(guī)熒光探針的光學(xué)信號(hào)與生物體背景熒光壽命相同，生物組織會(huì)產(chǎn)生背景熒光和光散射干擾，影響靶標(biāo)檢測(cè)的準(zhǔn)確性，降低成像的信噪比和靈敏度［7-8］。因此，減少生物組織的自發(fā)熒光和光散射的干擾，對(duì)提高生物成像的信噪比和靈敏度具有重要意義［9-12］。

延遲發(fā)光能夠有效避免生物樣品的自發(fā)熒光干擾，顯著提高生物成像的信噪比和靈敏度［13］。PLNPs 是一種在激發(fā)光停止后仍能持續(xù)發(fā)光的納米材料，這種材料通過(guò)內(nèi)部缺陷快速儲(chǔ)存能量然后緩慢釋放能量［14］。當(dāng)發(fā)光中心在高能光激發(fā)下，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，此過(guò)程中部分電子會(huì)被陷阱捕獲而保留，在熱激活等物理作用下被捕獲的電子緩慢釋放重新躍遷回基態(tài)時(shí)，形成長(zhǎng)余輝發(fā)光［15］。在停止激發(fā)后的幾秒到幾小時(shí)內(nèi)，甚至數(shù)天內(nèi)仍能檢測(cè)到長(zhǎng)余輝發(fā)光［16］。因此，在納秒級(jí)別的自體熒光和激發(fā)光散射消失后再收集余輝發(fā)光，可以避免光學(xué)成像中的背景熒光和光散射干擾，顯著提高成像信噪比和靈敏度。PLNPs雖然在生物成像方面具有顯著的優(yōu)勢(shì)，但實(shí)際應(yīng)用過(guò)程對(duì)材料的發(fā)光強(qiáng)度、余輝性能和組織穿透能力等方面均提出了較高的要求。PLNPs 的合成對(duì)其材料性能至關(guān)重要。通過(guò)選擇合適的合成方法和調(diào)控合成過(guò)程的參數(shù)可獲得余輝強(qiáng)度高、衰減時(shí)間長(zhǎng)的PLNPs，這也使得PLNPs成為長(zhǎng)時(shí)間尺度生物成像的理想選擇，能夠被應(yīng)用于細(xì)胞示蹤或腫瘤監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。此外，通過(guò)設(shè)計(jì)能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，可獲得具有X射線激發(fā)的近紅外（NIR）區(qū)域發(fā)射的PLNPs，以增強(qiáng)長(zhǎng)余輝信號(hào)的組織穿透能力。

本文從合成和生物成像應(yīng)用兩個(gè)方面系統(tǒng)介紹了近年來(lái)PLNPs 的最新研究進(jìn)展。主要總結(jié)了PLNPs 的合成方法；概括了PLNPs 在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是在指紋成像、細(xì)胞和活體成像中的應(yīng)用進(jìn)展；進(jìn)一步探討了PLNPs 在生物成像領(lǐng)域面臨的挑戰(zhàn)并對(duì)其未來(lái)進(jìn)行了展望。本文旨在為PLNPs的合成和生物成像應(yīng)用提供有價(jià)值的信息，為未來(lái)PLNPs在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 長(zhǎng)余輝納米粒子的合成方法

PLNPs的合成方法包括“自上而下”和“自下而上”法?！白陨隙隆狈ㄊ菍⒋蟪叽绲奈镔|(zhì)通過(guò)物理研磨或化學(xué)蝕刻工藝獲得納米級(jí)的材料。這類方法的優(yōu)勢(shì)是可獲得多種立體或平面結(jié)構(gòu)，并保持原有的疏松多孔結(jié)構(gòu)。缺點(diǎn)是在刻蝕過(guò)程中會(huì)有損耗，得到的材料微觀形貌通常難以調(diào)控?！白韵露稀狈ㄊ峭ㄟ^(guò)弱相互作用將一些小尺寸的結(jié)構(gòu)單位組裝成更大、更復(fù)雜的納米結(jié)構(gòu)。這類方法制備的PLNPs形貌和大小均一，分散性和生物相容性好。

1.1 自上而下法

“自上而下”法是從大尺寸材料出發(fā)，逐步分解為納米材料的方法。這種方法包括高溫固相法和溶膠凝膠法。“自上而下”法制備的長(zhǎng)余輝材料通常為塊狀化合物，需要經(jīng)過(guò)物理處理（例如研磨）將塊狀熒光粉研磨成納米熒光粉。由于涉及高溫處理，得到的PLNPs通常具有較強(qiáng)的持續(xù)發(fā)光性能。

1.1.1 高溫固相法最早誕生的長(zhǎng)余輝材料合成方法是高溫固相法，主要原理是基于固體粉末在高溫焙燒條件下進(jìn)行固相反應(yīng)。通常按比例稱量一定純度的固態(tài)原料粉末，與助熔劑混和均勻后，在特定氣體氛圍和溫度中灼燒，再經(jīng)過(guò)研磨或蝕刻等工藝獲得納米級(jí)的材料。這種方法操作簡(jiǎn)便，在反應(yīng)條件控制、原料和還原劑以及助熔劑的選擇方面都很成熟，因此被廣泛地用于制備長(zhǎng)余輝材料。目前，該方法已被用于合成Sr2MgSi2O7∶Eu2+，Dy3+、SrxAl2O4∶Eu2+，Dy3+、Y2O2S∶Ti4+，Mg2+、CaTiO3∶Pr3+、CaxMgSi2O5+x∶Dy3+等多種長(zhǎng)余輝材料［17-18］。但由于納米化過(guò)程需要進(jìn)行高溫退火處理，材料的晶型容易被破壞，產(chǎn)物形貌和尺寸難以控制，通常制備的材料缺乏尺寸均一性。

1.1.2 溶膠凝膠法溶膠-凝膠法是指反應(yīng)物在特定環(huán)境下水解生成溶膠，熱處理使溶劑揮發(fā)獲得具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，進(jìn)一步采用適當(dāng)?shù)墓に囂幚砩杉{米材料。這種方法很容易制備發(fā)光強(qiáng)度高、結(jié)晶度好和尺寸分布均一的PLNPs。Zheng 等［19］通過(guò)溶膠凝膠法合成了具有NIR-I 和NIR-II 發(fā)射的Mg-GeO3∶Mn2+，Yb3+，Li+的長(zhǎng)余輝納米粒子，Yb3+離子的摻雜不僅能作為陷阱中心增強(qiáng)Mn2+在680 nm 的NIR-I長(zhǎng)余輝發(fā)射，也可以提供產(chǎn)生~1 000 nm 的NIR-II的發(fā)光中心，Li+的摻雜還可以大大提高Yb3+的NIR-II余輝發(fā)射。除了離子摻雜的方式外，調(diào)節(jié)反應(yīng)過(guò)程中的原料組成和配比、反應(yīng)溫度和pH值等條件也可改善余輝發(fā)光。例如Homayoni等［20］采用溶膠-凝膠法合成了Sr2MgSi2O7∶Eu2+，Dy3+PLNPs，通過(guò)優(yōu)化溫度、pH 值和煅燒時(shí)間，發(fā)現(xiàn)在室溫及pH 4.0 條件下合成并在1 050 ℃退火下制備的樣品具有很強(qiáng)的持續(xù)發(fā)光，這為優(yōu)化PLNPs 的性質(zhì)以及促進(jìn)其實(shí)際應(yīng)用提供了良好的途徑。溶膠-凝膠法還用于CaMgSi2O6∶Eu2+，Mn2+，Pr3+、Sr1.6Mg0.3Zn1.1Si2O7∶Eu2+，Dy3+、Ca1.86Mg0.14ZnSi2O7∶Eu2+，Dy3+、Sr2MgSi2O7∶Eu2+，Dy3、LiGa5O8∶Cy3+和Zn2.94Ga1.96Ge2O10∶Cy3+，Pr3+等多種長(zhǎng)余輝納米粒子的合成［21-24］，是一種非常普適性的PLNPs合成方法。

1.2 自下而上法

相較于“自上而下”法，“自下而上”法可以通過(guò)調(diào)節(jié)反應(yīng)條件來(lái)調(diào)控納米材料的形貌和均勻性，通?？梢杂糜谥苽淞捷^小、生物相容性好的PLNPs?！白陨隙隆狈ㄖ饕ㄈ軇岱?、高溫?zé)岱纸夥ê湍０宸ǖ取?/p>

1.2.1 溶劑熱法溶劑熱反應(yīng)是基于溶劑的特殊性質(zhì)，將幾種前驅(qū)體溶解在密閉體系的溶劑中，在超臨界條件（如一定溫度和壓力）下進(jìn)行特定反應(yīng)來(lái)獲得所需產(chǎn)物。通過(guò)調(diào)控反應(yīng)條件（pH 值、時(shí)間、溫度等），可有效控制PLNPs的發(fā)光性質(zhì)。這種方法是基于溶劑的熱力學(xué)性質(zhì)，各種溶劑的性質(zhì)相互影響，溶解在溶劑中的反應(yīng)物的化學(xué)反應(yīng)活性大大提高。這使得反應(yīng)能夠在較低的反應(yīng)條件下發(fā)生，具有反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)［25］。采用溶劑熱法可以合成ZnGa2O4∶Cy3+、Zn2SnO4∶Cy3+，Eu2+、ZnGa2O4∶Cy3+，Eu2+等多種納米粒子［3，26-28］。本課題組采用水熱法直接合成了發(fā)紅光的Zn1+xGa2-2xGexO4∶Cy3+PLNPs，通過(guò)改變PLNPs 的組成配比調(diào)節(jié)材料的余輝發(fā)光強(qiáng)度和衰變時(shí)間［2］。Zhou 等［29］在反應(yīng)體系中加入油酸作為表面活性劑，優(yōu)化了ZnGa2O4∶Cy3+（ZGC） PLNPs 的合成。Li 等［30］通過(guò)溶劑熱法合成了L-半胱氨酸介導(dǎo)的聚集金納米粒子和PLNPs 的雙信號(hào)納米探針。Wei 等［31］通過(guò)調(diào)整溶劑中的甲醇含量，調(diào)控了近紅外ZGC PLNPs 的尺寸和發(fā)光性質(zhì)（圖1A），最高余輝時(shí)間可達(dá)20 h。Verelst 等［25］利用種子介導(dǎo)法合成了粒徑可控的ZGC PLNPs（圖1B）。最近，Zhang 等［32］用溶劑熱法開發(fā)了一種新型的Cs2Na0.9Ag0.1LuCl6∶Cy3+PLNPs（圖1C），這種PLNPs 能夠被X 射線激發(fā)，有望用于體內(nèi)深層次組織成像。

1.2.2 高溫?zé)岱纸夥ǜ邷責(zé)岱纸夥磻?yīng)是指在高溫下，溶解在有機(jī)表面活性劑中的有機(jī)金屬鹽前驅(qū)體快速成核并逐漸形成納米粒子的反應(yīng)過(guò)程。通過(guò)調(diào)節(jié)溶劑種類、反應(yīng)溫度、摻雜離子和pH 值等條件，可以控制PLNPs 的余輝性能和尺寸大小。這種方法反應(yīng)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單、可操控性強(qiáng)，但制備產(chǎn)量較低。本課題組采用高溫?zé)岱纸夥ê铣闪肆蜓趸|長(zhǎng)余輝納米材料，通過(guò)摻雜不同的稀土粒子Eu3+、Dy3+和Tb3+，分別獲得了發(fā)射紅色、黃色和綠色長(zhǎng)余輝發(fā)光［33］。高溫?zé)岱纸夥ㄒ彩呛铣煞€(wěn)定的小尺寸、單分散納米顆粒的最佳方法之一。本課題組［9］還基于金屬乙酰丙酮酸前體，采用高溫?zé)岱纸夥ê铣闪顺。? nm）納米點(diǎn)ZnGa2O4∶Alx，Cr（x=0.025、0.05、0.075、0.1），這種材料尺寸均一、分散性好、余輝發(fā)光強(qiáng)；通過(guò)控制Al3+的摻雜可調(diào)節(jié)PLNPs 的發(fā)光強(qiáng)度和余輝衰減時(shí)間。該方法還可用于ZnGa2O4∶Scx，Cr、ZnS∶Cy和CaF2等多種長(zhǎng)余輝納米點(diǎn)的控制合成，具有良好的普適性。將長(zhǎng)余輝納米點(diǎn)與脂質(zhì)體組裝能構(gòu)建具有良好生物相容性的復(fù)合生物成像平臺(tái)，有望推動(dòng)其在生物成像和藥物遞送等生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用。

1.2.3 模板法模板法是通過(guò)物理、化學(xué)或生物手段，將PLNPs 的前驅(qū)體沉積到模板的孔中或其表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)納米材料的尺寸、形態(tài)和結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)調(diào)控。常用的模板有介孔二氧化硅、碳納米球等。介孔二氧化硅納米粒子因其易于控制的合成、超高的比表面積、巨大的孔體積和良好的生物相容性而被廣泛用于生物學(xué)、藥物遞送和醫(yī)學(xué)研究，以及用于包裹各種藥物、功能分子和造影劑。將PLNPs 負(fù)載到介孔二氧化硅的孔道內(nèi)，可以避免粒子團(tuán)聚及過(guò)度生長(zhǎng)，增加材料的比表面積，為材料的進(jìn)一步表面修飾和藥物裝載奠定基礎(chǔ)。Lin 等［34］以介孔二氧化硅為模板合成了mSiO2@Zn0.6Ca0.4Ga2O4∶Cy3+，Yb3+（mSiO2@ZCGO）PLNPs，材料尺寸約為69 nm，這種材料在兩個(gè)近紅外窗口（Cr3+的～696 nm 和Yb3+的～1 000 nm）均表現(xiàn)出持續(xù)的發(fā)光。在紫外激發(fā)下Cr3+和Yb3+的余輝發(fā)射分別持續(xù)超過(guò)120 min 和10 min。這種mSiO2@ZCGO 能夠受X 射線激發(fā)產(chǎn)生余輝發(fā)射，有望用于深層組織生物成像。以介孔二氧化硅為模板還可合成SiO2@Zn2SiO4∶Mn2+、SiO2@SrMgSi2O6∶Eu2+，Dy3+、SiO2@CaMgSi2O6∶Eu2+，Pr3+，Mn2+、Gd2O3@mSiO2@CaTiO3∶Pr3+、Zn1.1Ga1.8Ge0.1O4∶Cy3+，Eu3+@SiO2、SiO2@CaTiO3∶Pr3+和mSiO2@Gd3Ga5O12∶Cy3+，Nd3+等多種長(zhǎng)余輝探針［35］。碳球也是理想的模板，Wang 等［36］以碳球作為模板，用水熱法在碳球上包覆一層長(zhǎng)余輝物質(zhì)，通過(guò)高溫使碳?xì)饣懦?，制備出尺寸均勻、比表面積大、負(fù)載能力強(qiáng)、發(fā)光效率高的中空PLNPs（圖2A~H）。這種方法可以改善中空PLNPs 的水溶性和生物相容性，有望實(shí)現(xiàn)載藥-緩釋功能于一體的癌癥靶向治療［37］。

圖2 以介孔二氧化硅為模板合成mSiO2@ZCGO的示意圖（A）；介孔二氧化硅（B）和mSiO2@ZCGO（C）的TEM圖；mSiO2@ZCGO的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖［34］（D）；以碳球?yàn)槟０搴铣煽招慕t外PLNPs的示意圖（E）；不同直徑的碳球?yàn)榍膀?qū)體合成的空心PLNPs的TEM圖［36］（F-H）Fig.2 Schematic diagram showing the preparation of mSiO2@ZCGO（A）；Transmission electron microscope（TEM） images of mSiO2（B） and mSiO2@ZCGO（C）；HRTEM image of mSiO2@ZCGO［34］（D）；Schematic illustration for the preparation of hollow near-infrared PLNPs with carbon spheres（E）；TEM images of hollow PLNPs synthesized with carbon spheres of different diameters［36］（F-H）

2 長(zhǎng)余輝納米粒子在生物成像中的應(yīng)用

近年來(lái)，合成方法的不斷發(fā)展和優(yōu)化促進(jìn)了長(zhǎng)余輝納米粒子的尺寸、形態(tài)以及發(fā)光性能的改善，極大提高了PLNPs 的光學(xué)性能，有效促進(jìn)了PLNPs 在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用。PLNPs 在激發(fā)光停止后仍能持續(xù)發(fā)光的特性使其能夠有效消除背景熒光干擾，具備高靈敏度和高信噪比等優(yōu)勢(shì)，在生物成像和疾病診療等領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。目前，PLNPs 已被廣泛用于指紋成像、細(xì)胞成像和活體成像等領(lǐng)域，可用于協(xié)助刑偵探案、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵分子水平事件，促進(jìn)生物學(xué)機(jī)制研究和疾病的診療。表1匯總了幾種常見的長(zhǎng)余輝納米粒子及其在生物醫(yī)學(xué)成像方面的應(yīng)用。

表1 典型的長(zhǎng)余輝納米粒子及其生物成像應(yīng)用Table 1 Typical persistent luminescence nanoparticles and their applications in bioimaging

2.1 指紋成像

指紋可以提供許多人體信息，在法醫(yī)鑒定、醫(yī)療診斷等領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注［3］。指紋識(shí)別是一種操作簡(jiǎn)單、安全性高的生物鑒別技術(shù)。利用人體指紋形態(tài)的專有性、不可更改性與基因相關(guān)性，指紋識(shí)別可以用于身份驗(yàn)證、遺傳信息識(shí)別和篩查等領(lǐng)域［47］。此外，利用指紋中殘留外源性物質(zhì)的物理、化學(xué)和生物性質(zhì)能夠提供指紋中所攜帶的社會(huì)信息［48］。潛指紋（Latent fingerprints，LFP）是指手指在接觸汗液、灰塵或者油脂后，殘留在干凈表面上的指紋。LFP 具有肉眼不可見性，需要外部技術(shù)使其可視化。采用顯色劑可以成像LFP，分辨出指紋中一些歧點(diǎn)、孤立點(diǎn)、環(huán)點(diǎn)和短紋等獨(dú)特細(xì)節(jié)，這些信息可作為個(gè)人識(shí)別的基礎(chǔ)。盡管LFP 成像已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是實(shí)際樣本比較復(fù)雜、容易受到背景信號(hào)的干擾，獲得的LFP 圖像嚴(yán)重模糊、信噪比和靈敏度低。PLNPs 具有激發(fā)/發(fā)射分離的特征，在背景信號(hào)消失之后收集余輝信號(hào)能夠有效消除復(fù)雜背景的干擾，有望獲得清晰的指紋圖像。本課題組制備了羧基功能化的Zn2GeO4∶Ga，Mn（ZGO∶Ga，Mn） PLNPs 用于潛指紋的時(shí)間門控成像［3］。PLNPs 表面的羧基形成的活性酯與LFP 中氨基酸中氨基反應(yīng)可以標(biāo)記LFP。這種方法能夠消除背景熒光的干擾，獲得高清晰度的LFP圖像（圖3A-D），由于氨基酸的高穩(wěn)定性，該方法還能檢測(cè)留存多日的陳舊指紋。該策略具有一定的通用性，在PLNPs 上修飾刀豆蛋白A 后，可實(shí)現(xiàn)LFP 中糖蛋白的檢測(cè)和成像。為使得LFP 的檢測(cè)更加便捷和方便，我們課題組［4］進(jìn)一步發(fā)展了以羧基功能化的Zn2GeO4∶Mn（ZGO∶Mn-COOH） PLNPs 為顯色劑的一種無(wú)背景、易于操作的pH 介導(dǎo)的LFP 成像方法。在一定的酸性環(huán)境下，ZGO∶Mn-COOH PLNPs 帶負(fù)電荷，酸性環(huán)境下LFP 中的蛋白質(zhì)和氨基酸在質(zhì)子化后帶正電，帶負(fù)電的ZGO∶Mn-COOH 很容易通過(guò)靜電作用與質(zhì)子化的指紋脊結(jié)合。將含有ZGO∶Mn-COOH PLNPs 的特定酸性溶液儲(chǔ)存在便攜式噴霧器中，在檢測(cè)LFP 時(shí)只需向基底上噴灑這種酸性溶液，就能有效地去除背景熒光干擾，獲得清晰的LFP圖像。

圖3 紫外光激發(fā)前后撲克牌和飲料罐上的指紋圖像（A）；PLNPs在指紋成像中的穩(wěn)定性以及光滑和粗糙基底上的指紋圖像（B）；商業(yè)染料和長(zhǎng)余輝探針標(biāo)記指紋的共定位三維共聚焦成像（C）；LFP中糖蛋白的檢測(cè)［3］（D）Fig.3 Photos of fingerprints on playing cards and soft drink cans with and without UV stimulation（A）；Luminescent images of fingerprints aged at different time periods；fingerprint images on smooth and rough surfaces（B）；3D confocal images of fingerprints marked with commercial dyes and persistent luminescence probes（C）；Detection of glycoprotein in LFP［3］（D）

2.2 細(xì)胞成像

細(xì)胞是生物體的基本組成單元，細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)需要依靠大量蛋白和分子，觀察細(xì)胞內(nèi)各種蛋白或分子的圖像以及動(dòng)態(tài)變化對(duì)于分子診斷、疾病機(jī)制研究和疾病診斷等具有重要作用。細(xì)胞本身成分復(fù)雜，主要由大量的有機(jī)物組成，易產(chǎn)生干擾熒光信號(hào)，影響成像的靈敏度和準(zhǔn)確性。PLNPs 能夠避免熒光信號(hào)的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)不同生物活性分子的可視化監(jiān)測(cè)，直觀地獲得目標(biāo)分子的空間分布和動(dòng)態(tài)變化信息。在PLNPs 表面修飾靶向識(shí)別基團(tuán)（抗體、適配體和受體）［49］，能夠增強(qiáng)PLNPs 的靶向識(shí)別能力。目前，采用PLNPs 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了谷胱甘肽［50］、多巴胺［51-52］等多種小分子以及蛋白質(zhì)［3，53-57］、核酸［58-59］等生物分子的成像。Lyu 等［60］通過(guò)采用適配體標(biāo)記近紅外PLNPs 實(shí)現(xiàn)了外泌體蛋白的檢測(cè)，通過(guò)改變適體序列可以檢測(cè)不同的外泌體蛋白，有望用于癌癥診斷。PLNPs 不僅能實(shí)現(xiàn)單一標(biāo)志物的檢測(cè)，還能實(shí)現(xiàn)多種標(biāo)志物的生物傳感。Feng 等［61］為了實(shí)現(xiàn)多種癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物成纖維細(xì)胞活化蛋白α（FAPα）的生物傳感和生物成像，在Au 涂覆的ZnGa2O4∶Cr3+0.004表面上修飾Cy5.5-KGPNQC-SH，使其猝滅熒光，從而建立了余輝共振能量轉(zhuǎn)移體系（圖4A），實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜樣本中FAPα 的高靈敏檢測(cè)（圖4B）。此外，PLNPs 還能用于可視化細(xì)胞遷移等生物進(jìn)程，為長(zhǎng)時(shí)間觀測(cè)腫瘤病灶轉(zhuǎn)移提供有力的支撐。Liu等［62］使用PEG修飾的PLNPs跟蹤了25天的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)的過(guò)程，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在3天之內(nèi)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。Zhao 等［63］開發(fā)了近紅外ZnGaGe∶Eu2+，Cr3+PLNPs 探針，在材料表面修飾4-羧基苯基硼酸使其具有受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，用于監(jiān)測(cè)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程。除了追蹤癌細(xì)胞的遷移外，PLNPs 還被應(yīng)用于樹突細(xì)胞和干細(xì)胞等正常細(xì)胞的遷移。Harizaj 等［64］使用脂質(zhì)包被的近紅外LiGa5O8∶Cr3+PLNPs 實(shí)現(xiàn)了體內(nèi)樹突狀細(xì)胞遷移的可視化檢測(cè)。Xia 等［65］使用聚L-賴氨酸修飾的Cr3+/Eu3+共摻雜Zn1.1Ga1.8Ge0.104PLNPs跟蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的遷移過(guò)程，成像時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30天。

圖4 ∶ZnGa2O4∶Dy3+@MPA@Au的制備過(guò)程示意圖（A）；U87MG、MDA-MB-435和AD293細(xì)胞與PLNPs探針共孵育后的體外細(xì)胞成像（B）［61］Fig.4 Schematic diagram of the preparation process of ∶ZnGa2O4@MPA@Au（A）；Fluorescence images of U87MG，MDA-MB-435 and AD293 cells incubated with PLNPs probe（B）［61］

2.3 活體成像

活體成像能直觀地追蹤研究對(duì)象的生物過(guò)程，在腫瘤診斷和手術(shù)導(dǎo)航中必不可少?；铙w環(huán)境中目標(biāo)分子的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)和高時(shí)空分辨成像對(duì)于理解生物體內(nèi)的細(xì)胞分子功能、信號(hào)傳遞以及基因表達(dá)等生理過(guò)程非常重要，對(duì)致病機(jī)制研究、疾病診斷和治療等具有重要意義。但活體成像受到組織吸收、散射和自發(fā)熒光的嚴(yán)重干擾。PLNPs 是一種非常理想的活體成像材料，它能夠有效消除生物體內(nèi)自發(fā)熒光干擾，具有較高的成像靈敏度［66］。在實(shí)際應(yīng)用中，體內(nèi)環(huán)境較復(fù)雜，對(duì)PLNPs的分散性、穩(wěn)定性、靶向性和生物相容性均提出了較高的要求。對(duì)PLNPs 進(jìn)行表面修飾和功能化，有望獲得粒徑均一、生物相容性好和具有靶向識(shí)別能力強(qiáng)的長(zhǎng)余輝納米探針，對(duì)組織成像［67-70］、病灶轉(zhuǎn)移［71-75］、成像引導(dǎo)的治療［76-80］等方面具有重大意義。

與可見光相比，近紅外光在穿透皮膚、脂肪和粘液等生物組織時(shí)的散射較少，不易被生物樣品吸收，在生物組織中的穿透能力強(qiáng)。NIR 區(qū)域主要分為兩個(gè)部分，即NIR-I（650~900 nm）和NIR-II（1 000~1 450 nm）。NIR-I 發(fā)射的PLNPs 無(wú)需原位激發(fā)，具有高信噪比、低散射和深層組織穿透能力等優(yōu)點(diǎn)，在活體診療領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注［81-82］。Abdukayum 等［83］通過(guò)Pr3+/Cr3+共摻雜合成了具有NIR-I 發(fā)光的Zn2.94Ga1.96Ge2O10∶Cr3+，Pr3+PLNPs，修飾聚乙二醇可提高PLNPs的生物相容性和水溶性，與多肽生物偶聯(lián)后有望用于長(zhǎng)期體內(nèi)靶向腫瘤成像。與NIR-I 發(fā)射的PLNPs 相比，具有NIR-II 發(fā)射特征的PLNPs 能進(jìn)一步降低散射現(xiàn)象，生物體自發(fā)熒光背景噪聲幾乎消失，在提升成像信噪比、圖像清晰度和穿透深度等方面更有優(yōu)勢(shì)［84］。Lin 等［85］用溶劑熱液固溶液和鹽微乳液法合成MgGe0.8Ga0.2O3∶Yb3+PLNPs，該材料可用X射線反復(fù)激發(fā)產(chǎn)生NIR-II長(zhǎng)余輝發(fā)光，余輝光能夠穿透厚度約為3.9 mm的生物組織。除了單一近紅外發(fā)射外，多生物窗口發(fā)射的長(zhǎng)余輝納米探針也被報(bào)道。Chen等［86］報(bào)道了一種CaTiO3∶Pr3+多波段長(zhǎng)余輝探針，可被極弱可見光激發(fā)，首次同時(shí)實(shí)現(xiàn)了三個(gè)生物成像窗口（可見光，NIR-I 和NIR-II）的成像（圖5）。

PLNPs 可有效避免光散射和組織自發(fā)熒光干擾，增強(qiáng)成像的靈敏度和信噪比。目前PLNPs 的激發(fā)光主要是紫外光或可見光，這些激發(fā)光的組織穿透深度有限［87］。相比之下，X 射線波長(zhǎng)短、能量高，具有深層組織穿透能力，可激活具有大帶隙的PLNPs 產(chǎn)生高強(qiáng)度的長(zhǎng)余輝發(fā)光。X 射線激發(fā)近紅外發(fā)射的PLNPs 的出現(xiàn)促進(jìn)了活體深層次成像邁向新臺(tái)階［88-89］。Zheng 等［19］制備了X 射線激發(fā)的MgGeO3∶Mn2+，Yb3+，Li+（MGO） PLNPs，材料形貌均勻，尺寸為50~100 nm。使用軟X 射線可以有效地激發(fā)MGO PLNPs 產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的NIR-I/II 發(fā)光，這種PLNPs 修飾葉酸后能夠有效靶向炎癥RAW264.7 細(xì)胞，在炎癥模型小鼠體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)炎癥細(xì)胞的長(zhǎng)期觀測(cè)。通過(guò)在長(zhǎng)余輝材料中摻雜Cr3+，有望實(shí)現(xiàn)在X射線激發(fā)下發(fā)射近紅外光余輝。Yang等［90］通過(guò)在ZGO PLNPs中引入一定量的Cr3+和Er3+離子，獲得在低劑量X 射線激發(fā)下可以發(fā)射近紅外光的PLNPs。隨后，Lu 等［91］開發(fā)了由X 射線激發(fā)的LaAlO3（LAO）PLNPs，通過(guò)摻雜Cr3+改變?nèi)毕輵B(tài)的電子能量轉(zhuǎn)移過(guò)程，使得LAO PLNPs 從深紅色調(diào)制到NIR-II/III 窗口。這些工作為深層組織近紅外成像造影劑的開發(fā)提供了重要指導(dǎo)。

無(wú)論是可見光還是近紅外光，余輝成像都屬于熒光成像的范疇，這種成像模式通常只能實(shí)現(xiàn)平面和細(xì)胞水平的單一模式成像，難以實(shí)現(xiàn)到大范圍、跨尺度、多模態(tài)的成像，獲得的解剖和生理信息的能力有限。將近紅外余輝成像與其他醫(yī)學(xué)成像技術(shù)如計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）、正電子發(fā)射斷層掃描（PET）和磁共振成像（MRI）等相結(jié)合，構(gòu)建多模式生物成像技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)對(duì)生命體整體結(jié)構(gòu)的全方位可視化過(guò)程的觀測(cè)，對(duì)重大復(fù)雜疾病的研究具有重要意義。Zou等［92］通過(guò)大孔-介孔二氧化硅材料構(gòu)建了多功能雜化介孔PLNPs，用于長(zhǎng)期體內(nèi)近紅外長(zhǎng)余輝、MRI 和PET 成像，以及化療和近紅外長(zhǎng)余暉敏化光動(dòng)力治療。Pei 等［93］報(bào)道了一系列X 射線激發(fā)的NIR-Ⅱ稀土摻雜NaYF4∶3 % Er@NaGdF4-（18F）PLNPs，除了NaYF4∶3% Er發(fā)光中心提供的長(zhǎng)余輝信號(hào)外，引入標(biāo)記的NaGdF4外殼在增強(qiáng)余輝強(qiáng)度的同時(shí)還能提供T1增強(qiáng)的磁共振成像功能。此外，在材料合成時(shí)摻雜具有特殊功能的離子有助于合成一體化多功能的多模式成像探針。例如，將18F-摻雜到NaGdF4殼層中能促進(jìn)材料的PET 成像功能。Bi3+離子作為CT成像的造影劑，Li等［94］通過(guò)設(shè)計(jì)合成新型Bi2Ga4O9∶Cr PLNPs，實(shí)現(xiàn)了長(zhǎng)余輝熒光和CT的雙模式成像。

目前，PLNPs 用于活體成像依然面臨著生物相容性、藥代動(dòng)力學(xué)和生物安全性等問(wèn)題，充分了解和解決這些問(wèn)題可以極大地促進(jìn)PLNPs 在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的臨床轉(zhuǎn)化。目前已經(jīng)有許多細(xì)胞系用于評(píng)估PLNP 的體外細(xì)胞毒性，結(jié)果表明大多數(shù)PLNPs 無(wú)明顯的細(xì)胞毒性［35］。Zhang 等［95］選擇了3 種類型的細(xì)胞評(píng)估聚乙二醇化PLNP 的體外風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果表明，聚乙二醇化PLNPs 對(duì)3 種不同細(xì)胞系的細(xì)胞活力、細(xì)胞膜損傷、氧化應(yīng)激和凋亡無(wú)顯著影響。PLNPs 在體內(nèi)的分布和代謝對(duì)其毒性有重要影響。通常情況下，納米顆粒會(huì)被單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（即肝臟和脾臟）快速吸收，但通過(guò)調(diào)控材料表面的性質(zhì)有望獲得改善，例如在材料表面修改聚乙二醇可防止蛋白質(zhì)吸附在納米顆粒表面，顯著減少體外巨噬細(xì)胞的攝取。Zhang等［95］發(fā)現(xiàn)靜脈注射10 mg/kg聚乙二醇化PLNPs后，PLNPs大部分積聚在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中，并且可以通過(guò)消化系統(tǒng)逐漸排出體外。Richard 等［96-97］報(bào)道了納米粒子的粒徑、表面分布和理化性質(zhì)對(duì)PLNPs 體內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊?。結(jié)果表明，掩蔽電荷、增加氨基硅烷密度、減小粒徑可以減少肝臟對(duì)PLNPs 的捕獲，有效增加PLNPs 在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間。這些研究均表明通過(guò)改善PLNPs 的表面性質(zhì)、電荷和粒徑大小有望促進(jìn)PLNPs在體內(nèi)生物醫(yī)學(xué)成像研究的臨床轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論與展望

PLNPs 具有在激發(fā)光停止后持續(xù)發(fā)光的特殊性質(zhì)，能夠有效消除背景熒光干擾和散射光，被廣泛用于高信噪比、高靈敏生物成像，有希望獲得更精細(xì)的生物結(jié)構(gòu)信息。本文總結(jié)了目前常見的幾種PLNPs 的合成方法并分析了各方法的優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)PLNPs 在生物成像領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了總結(jié)和概括?，F(xiàn)有的合成方法主要基于“自上而下”的高溫固相法和溶膠凝膠法，以及“自下而上”的溶劑熱法、高溫?zé)岱纸夥ê湍０宸?。其中，在生物成像領(lǐng)域應(yīng)用較為普遍的方法主要有溶膠凝膠法和溶劑熱法；高溫?zé)岱纸夥ㄍǔＳ糜诤铣闪捷^小的PLNPs；模板法更適用于成像和載藥等多功能一體的復(fù)合材料構(gòu)建。這些方法的總結(jié)為探索適合生物成像的PLNPs 的制備提供了指導(dǎo)意見。盡管采用當(dāng)前技術(shù)所合成的PLNPs 能滿足大多數(shù)生物成像的需求，但是依然需要探索合成余輝發(fā)光強(qiáng)度高、衰減時(shí)間長(zhǎng)的PLNPs 合成方法。未來(lái)有望通過(guò)探索微調(diào)晶體中的缺陷來(lái)增強(qiáng)PLNPs 的持續(xù)發(fā)光性能，進(jìn)一步改善成像的信噪比和靈敏度，獲得更大時(shí)間尺度的生物成像。為了順應(yīng)將來(lái)多模式成像的需求，合成多模式于一體的PLNPs 依然是未來(lái)發(fā)展的一個(gè)重要方向。但目前多模式PLNPs 主要依靠模版或不同功能的材料復(fù)合實(shí)現(xiàn)功能的集成，這種集成方式的化學(xué)鍵作用力弱、整體結(jié)構(gòu)不均勻。因此，在今后需要探索合成一體化的多功能PLNPs，利用摻雜元素以及本身的特殊結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)多功能化。盡管目前有許多報(bào)道表明PLNPs 對(duì)于大部分細(xì)胞系的毒性較低，但依然需要更為詳細(xì)的毒性病理性研究，進(jìn)一步研究PLNPs 對(duì)基因、蛋白質(zhì)的影響或評(píng)估其生物轉(zhuǎn)化。此外，本文還探索了PLNPs 在生物成像領(lǐng)域的研究進(jìn)展，主要概括了PLNPs 在指紋成像、細(xì)胞成像以及活體成像領(lǐng)域的最新研究進(jìn)展。為了實(shí)現(xiàn)深層次的組織成像，高能量X 射線激發(fā)近紅外發(fā)射的長(zhǎng)余輝成像將會(huì)成為未來(lái)生物成像領(lǐng)域探索的熱點(diǎn)。然而，這方面的探索還處于起步階段，應(yīng)用范圍也主要局限于腫瘤細(xì)胞成像領(lǐng)域，在未來(lái)需要探索更為豐富的組織成像對(duì)象，使PLNPs應(yīng)用于更為廣闊的生物成像領(lǐng)域。