付信悅，張良偉*，劉姝菂，李金花，陳令新

（1．中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所，中國科學(xué)院海岸帶環(huán)境過程與生態(tài)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省海岸帶環(huán)境工程技術(shù)研究中心，山東 煙臺 264003；2．煙臺大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 煙臺 264005；3．中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

神經(jīng)遞質(zhì)是一類重要的化學(xué)信使分子，可將信息傳遞到其他神經(jīng)元、組織或器官，使機(jī)體完成特定的生物學(xué)反應(yīng)［1］。精密的神經(jīng)遞質(zhì)釋放和受體結(jié)合過程涵蓋學(xué)習(xí)、記憶、情緒調(diào)節(jié)、行為控制等多方面的功能，其調(diào)節(jié)異常與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神類疾病密切相關(guān)，包括缺氧缺血性腦病、運(yùn)動(dòng)障礙、癲癇及抑郁等［2］。測定神經(jīng)遞質(zhì)的濃度變化和空間分布是探索人類神經(jīng)系統(tǒng)的重要途徑，同時(shí)也可以為預(yù)防、診斷和治療神經(jīng)疾病提供關(guān)鍵依據(jù)。多種檢測方法被應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)的研究和分析，包括高效液相色譜（HPLC）、毛細(xì)管電泳（CE）、電化學(xué)（EC）、質(zhì)譜（MS）、紫外可見光譜（UV）、熒光光譜（FL）等技術(shù)。由于人體環(huán)境存在大量的內(nèi)源性成分干擾，且神經(jīng)遞質(zhì)常處于不斷更新變化和代謝的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)［3］，越來越多的研究人員正努力開發(fā)能夠?qū)崿F(xiàn)神經(jīng)遞質(zhì)高時(shí)空分辨率的檢測方法。熒光探針檢測技術(shù)因高度的選擇性、靈敏度和可視化優(yōu)勢得到了諸多關(guān)注，與分子醫(yī)學(xué)的結(jié)合也使其在神經(jīng)遞質(zhì)的生理功能和病理機(jī)制研究中發(fā)揮著重要作用。目前已有研究多種神經(jīng)遞質(zhì)檢測技術(shù)的相關(guān)綜述［4-5］，同時(shí)也有單一神經(jīng)遞質(zhì)類型特性及其相應(yīng)檢測方法的介紹［6-7］，但鮮有針對熒光探針檢測神經(jīng)遞質(zhì)的綜合性介紹。本文全面綜述了響應(yīng)型熒光探針檢測各類神經(jīng)遞質(zhì)的研究進(jìn)展，根據(jù)常見神經(jīng)遞質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)和功能將其分為6 類，即膽堿類、生物胺類、氨基酸類、神經(jīng)肽類、嘌呤類以及氣體，重點(diǎn)探討了多種神經(jīng)遞質(zhì)的熒光檢測方法，并通過對不同神經(jīng)遞質(zhì)的綜合分析，更深入地理解神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制，探討當(dāng)前熒光探針技術(shù)在神經(jīng)遞質(zhì)檢測領(lǐng)域存在的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展方向，以期為相關(guān)神經(jīng)疾病的診斷和治療提供新的視角和策略。

1 神經(jīng)遞質(zhì)主要分析方法

神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)構(gòu)功能復(fù)雜，開發(fā)針對性的檢測方法一直是神經(jīng)科學(xué)的重大課題，科學(xué)家們已經(jīng)嘗試了許多不同的方法來測定體內(nèi)外的神經(jīng)遞質(zhì)，相關(guān)分析技術(shù)也在不斷發(fā)展。

HPLC、CE 和EC 等技術(shù)均可用于生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的檢測［8］。如表1 所示，HPLC 較為常見［9］，且可與EC、MS、UV以及FL等不同檢測器結(jié)合使用，實(shí)現(xiàn)多種神經(jīng)遞質(zhì)的測量。Lendor等［10］使用固相微萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（SPME-HPLC-MS/MS）實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)遞質(zhì)的原位定量連續(xù)檢測。Zhang等［11］和Nováková 等［12］采用高效液相色譜-熒光（HPLC-FL）聯(lián)用方法測定神經(jīng)遞質(zhì)，檢出限（LOD）可低至nmol/L 級別。毛細(xì)管電泳也是檢測神經(jīng)遞質(zhì)的經(jīng)典方法［13］，毛細(xì)管電泳/電噴霧質(zhì)譜（CE/ESI-MS）技術(shù)［14］、毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測方法（CE-LIF）［15］、場放大樣本注射-毛細(xì)管電泳-電噴霧質(zhì)譜（FASI-CE-ESI-MS）方法［16］均能成功分離多種神經(jīng)遞質(zhì)。此外，電化學(xué)傳感可通過采用納米材料、微電機(jī)、晶體管并結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼（SERS）等多種策略來增強(qiáng)其在神經(jīng)遞質(zhì)檢測中的穩(wěn)健性、選擇性和靈敏度［17-21］。Ma等［22］2022年開發(fā)的微電極可實(shí)現(xiàn)100 nmol/L~25 μmol/L 多巴胺（DA）的檢測，LOD 為50 nmol/L。

表1 生物樣品中神經(jīng)遞質(zhì)的傳統(tǒng)檢測方法Table 1 Traditional methods for the detection of neurotransmitters in biological samples

雖然以上方法表現(xiàn)出對多種神經(jīng)遞質(zhì)的良好檢測性能（表1），但是由于神經(jīng)遞質(zhì)在生物體系中處于動(dòng)態(tài)變化狀態(tài)，加之樣品前處理過程較為復(fù)雜、繁瑣，檢測時(shí)往往易形成假陽性結(jié)果，因此，準(zhǔn)確測定生物樣品中的神經(jīng)遞質(zhì)仍然存在諸多挑戰(zhàn)。熒光探針具有原位、快速、可視化、非破壞性實(shí)時(shí)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)，能夠在復(fù)雜且快速變化的生物體系中實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的高時(shí)空分辨率檢測，精確反映物質(zhì)的真實(shí)動(dòng)態(tài)信息，有望成為精準(zhǔn)監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)的有效工具，解釋其在神經(jīng)系統(tǒng)中的精細(xì)調(diào)控機(jī)制。

2 響應(yīng)型熒光探針在神經(jīng)遞質(zhì)檢測中的應(yīng)用

響應(yīng)型熒光探針通過引入特異性識別基團(tuán)，可在特定條件下對目標(biāo)分析物產(chǎn)生可觀測的光學(xué)信號變化，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生化檢測、醫(yī)學(xué)診斷和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域［32-35］。響應(yīng)型熒光探針可以在生物體的局部理化環(huán)境中進(jìn)行特異性響應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)特定的用途，如靶向給藥、疾病診斷治療等，在分子醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也有較好的應(yīng)用前景［32，36-40］。因此利用響應(yīng)型熒光探針監(jiān)測神經(jīng)遞質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化，有助于更深入地理解神經(jīng)系統(tǒng)的功能和調(diào)控機(jī)制，推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)和相關(guān)領(lǐng)域的研究取得更大進(jìn)展。本部分將對不同類型神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)型分子熒光探針進(jìn)行重點(diǎn)介紹，同時(shí)對基于不同材料（例如熒光蛋白、量子點(diǎn)、納米材料等）的其它熒光探針進(jìn)行簡單概括。

2.1 膽堿類

膽堿是帶正電荷的四價(jià)堿基，是生物膜的組成成分和乙酰膽堿（ACh）的前體。ACh（圖1A）作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)參與自主神經(jīng)傳導(dǎo)［41］，乙酰膽堿酯酶（AChE）起著將ACh 水解成膽堿的關(guān)鍵作用，且特異性高，只分解以ACh 為核心的有限范圍的底物，因而AChE 的活性測量成為膽堿類神經(jīng)遞質(zhì)水平測量的間接策略［42］。AChE 的結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)活性位點(diǎn)：季銨基所在的陰離子位點(diǎn)和作為水解催化位點(diǎn)的酯基位點(diǎn)（圖1B）。

圖1 ACh的結(jié)構(gòu)（A）及AChE的結(jié)構(gòu)和活性位點(diǎn)殘基（B）［42］Fig.1 The structure of ACh（A） and the structure and active site residues of AChE（B）［42］

Sidhu 等［42］采用“乙酰膽堿模擬物”方法，設(shè)計(jì)合成了熒光探針1 來檢測AChE（圖2A），并通過引入季銨基作為酶的假底物更好地結(jié)合AChE 的活性中心。適當(dāng)?shù)木嚯x可使探針更好地模擬ACh 結(jié)構(gòu)，同時(shí)能夠在與酶相互作用中保持一定柔性，適應(yīng)酶活性位點(diǎn)的微小結(jié)構(gòu)變化，提高探針選擇性和效能。探針1 的設(shè)計(jì)考慮了季銨基和酯基之間的距離，并將其保持在2~3 個(gè)碳單元范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AChE 可催化水解熒光探針1 成為1a，實(shí)現(xiàn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（ICT）使熒光發(fā)射增強(qiáng)，LOD 為0.1 U/mL。Zhao 等［43］利用光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）建立了一種新型近紅外熒光探針2（圖2B），該探針本身熒光微弱，添加AChE 后熒光發(fā)生變化。在設(shè)計(jì)AChE 熒光探針時(shí)，常選擇氟硼吡咯（BODIPY）［44］、雙氰異佛酮和花菁類染料［45］作為熒光團(tuán)。Wei等［46］在雙氰異佛酮結(jié)構(gòu)與具有激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（ESIPT）效應(yīng)的苯并噻唑熒光團(tuán)偶聯(lián)的基礎(chǔ)上，選擇N，N-二甲基甲酰基作為AChE的識別單元，構(gòu)建了雙傳感機(jī)制的熒光探針3（圖2C）。在無AChE 的情況下，酚羥基被N，N-二甲基甲酰基保護(hù)，ESIPT 和ICT 過程受到抑制，熒光信號猝滅；與AChE 反應(yīng)脫保護(hù)后，酚羥基的供電子加強(qiáng)了ICT 效應(yīng)，并與苯并噻唑的ESIPT效應(yīng)協(xié)同作用，產(chǎn)生明顯的熒光信號，表現(xiàn)出較高的靈敏度和良好的選擇性，可實(shí)現(xiàn)生物體中內(nèi)源性AChE的原位成像。

圖2 AChE熒光探針結(jié)構(gòu)及響應(yīng)機(jī)制圖［42-43，46］Fig.2 The structures and response mechanism of AChE fluorescent probes［42-43，46］

碳量子點(diǎn)（CDs）、貴金屬納米顆粒、金屬有機(jī)骨架材料（MOF）等也被應(yīng)用于ACh 的檢測［47］。其檢測機(jī)理為：ACh經(jīng)AChE 催化反應(yīng)分解為膽堿和乙酸，產(chǎn)物膽堿經(jīng)膽堿氧化酶（ChOx）催化分解為H2O2，而CDs 和金納米顆粒（AuNCs）等材料的熒光可被H2O2猝滅［48］。Li 等［49］構(gòu)建了BSA-AuNCs 修飾的雙酶ACh 生物傳感器：牛血清白蛋白（BSA）可使Au3+還原為發(fā)光的AuNCs，而H2O2可使AuNCs 的熒光猝滅。該傳感器的檢測范圍為0.1~20 nmol/L，LOD 為5 pmol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.1%~2.1%。Martín等［50］通過共價(jià)鍵將含有ChOx 的AuNCs 與黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）連接，利用AuNCs 與FAD 之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）和氧氣（O2）對AuNCs熒光猝滅的協(xié)同作用，成功對ACh進(jìn)行了檢測，線性范圍為1~10 μmol/L，RSD為4.0%。另一方面，Wang等［51］通過合成Er-MOF作為電子給體，并以硫黃素T（ThT）作為受體，利用FRET 及ThT 與Er-MOF 之間的氫鍵和靜電相互作用，構(gòu)建了雙發(fā)射比例熒光傳感器，線性范圍為0~10 nmol/L，LOD 為0.492 nmol/L。此外，貴金屬納米顆粒的表面等離子體增強(qiáng)能量轉(zhuǎn)移也可以誘導(dǎo)熒光猝滅［52］，Mukhametshina 等［53］基于該機(jī)理，通過猝滅Tb（Ⅲ）中心發(fā)光實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)肌肉連接處釋放的內(nèi)源性ACh的定性檢測。

2.2 生物胺類

生物胺類神經(jīng)遞質(zhì)，也稱為單胺類神經(jīng)遞質(zhì)（MNTs），是含有氨基（R-NH2）的帶電小分子，主要包括兒茶酚胺（CAs）、5-羥色胺（5-HT，血清素）和組胺（HA）；CAs 主要指去甲腎上腺素（NE）、腎上腺素和多巴胺（DA）［54］。MNTs 及其代謝產(chǎn)物在人體的神經(jīng)、心血管和內(nèi)分泌等組織系統(tǒng)中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，對情緒、情感、應(yīng)激行為和睡眠覺醒等生理活動(dòng)具有重要影響。MNTs含量的變化與人類多種疾病密切相關(guān)，是診斷阿爾茨海默癥、唐氏綜合征、抑郁癥和帕金森等疾病的重要依據(jù)［55］。

由于CAs結(jié)構(gòu)的相似性，在利用熒光進(jìn)行腎上腺素和NE的檢測時(shí)，往往不做區(qū)分，同時(shí)測定二者的含量［56-57］。而目前NE熒光探針的構(gòu)建有以下3種設(shè)計(jì)策略：

第一，基于氨基與醛基的縮合反應(yīng)（圖3A）［58］。Hettie 等［59］發(fā)展了一種含有醛基識別基團(tuán)的開啟型香豆素衍生物熒光探針4，其與氨基反應(yīng)形成亞胺離子，可使熒光增加5.3倍。

第二，基于鄰苯二酚基團(tuán)與苯硼酸的酯化反應(yīng)（圖3B）［60］。Zhang 等［61］基于喹諾酮類熒光團(tuán)構(gòu)建了高親和力的NE熒光探針5，其結(jié)構(gòu)中含有硼酸識別基團(tuán)，可與NE特異性結(jié)合，不受腎上腺素干擾。

第三，基于羥乙胺結(jié)構(gòu)的環(huán)化反應(yīng)（圖3C）。NE 的羥乙胺部分可以通過碳酸酯或其它雙鍵反應(yīng)成環(huán)。Yue等［62］利用該反應(yīng)機(jī)理開發(fā)了特異性探針6，Zhou等［54］利用含有磺酸基的花菁基團(tuán)構(gòu)建水溶性的紅色熒光探針7，實(shí)現(xiàn)了氟西?。ㄒ环N典型的抗抑郁藥）誘導(dǎo)體內(nèi)NE 升高的原位成像。并根據(jù)同一機(jī)理構(gòu)建了近紅外熒光探針8［63］。此外，他們利用NE 的羥乙胺結(jié)構(gòu)與吡喃鹽的特異加成反應(yīng)構(gòu)建特異性熒光探針9［64］，實(shí)現(xiàn)了比例熒光響應(yīng)。Yan等［65］通過在熒光團(tuán)中引入相鄰的醛基和酯基雙位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了探針10，其原理是醛基能夠迅速與氨基反應(yīng)，隨后與β-羥基進(jìn)行親核反應(yīng)形成五元環(huán)；在酯基的另一個(gè)鄰位引入甲氧基，可增加空間位阻，實(shí)現(xiàn)對NE的快速和特異性熒光檢測。

基于DA 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，Zhao等［66］利用硼缺電子的特性將其與DA 的兩個(gè)羥基基團(tuán)結(jié)合，設(shè)計(jì)合成了比例熒光探針11，隨著DA 的加入，11a 逐漸生成（圖4A），體系在484 nm 處的熒光強(qiáng)度降低，388 nm處的熒光強(qiáng)度增加。該探針對多種潛在干擾物均無熒光響應(yīng)，選擇性強(qiáng)，檢測范圍為10~600 nmol/L，LOD為14.6 nmol/L。

圖4 DA熒光探針構(gòu)建策略及相應(yīng)探針結(jié)構(gòu)［66-67］Fig.4 Construction strategy of DA fluorescent probes and structures of corresponding probes［66-67］

除羥基外，DA 的氨基作為反應(yīng)位點(diǎn)也被用于熒光探針構(gòu)建。Deng 等［67］制備了綠色熒光蛋白熒光探針12，其內(nèi)酯結(jié)構(gòu)可增強(qiáng)熒光發(fā)射，而DA 的氨基可以打開內(nèi)酯生成12a（圖4B），破壞共軛結(jié)構(gòu)使熒光強(qiáng)度降低。

以CDs及其摻雜的納米結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的熒光探針在DA的實(shí)時(shí)檢測中表現(xiàn)出高選擇性、高靈敏度和快速響應(yīng)的特性［68］。Baruah 等［69］構(gòu)建了CDs 進(jìn)行DA 傳感，LOD 為33 μmol/L。Tian 等［70］制備了硼/氮共摻雜的CDs，LOD 為7.88 μmol/L。Tiwari 等［71］采用CDs 和氮摻雜碳點(diǎn)作為熒光探針檢測人血清中的DA，LOD 為5.54 μmol/L，檢測濃度范圍為3.3~500 μmol/L。Si 等［72］還構(gòu)建了基于FRET 的稀土摻雜上轉(zhuǎn)換納米顆粒（UCNPs）-AgNPs 納米探針用于DA 檢測，發(fā)現(xiàn)UCNPs 發(fā)射強(qiáng)度與DA 濃度之間存在良好線性關(guān)系。Chaiendoo 等［73］基于堿性介質(zhì)中DA 可氧化產(chǎn)生聚多巴胺（PDA）的原理，構(gòu)建了一種PDA 包被的CDs 探針用于DA 檢測，其獨(dú)特的傳感機(jī)制使之具有較強(qiáng)的選擇性，檢測范圍為1.0~10.0 μmol/L，LOD為0.22 μmol/L。

5-HT由色氨酸產(chǎn)生，主要分布于動(dòng)物的胃腸道、血小板和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。其相應(yīng)的血清素能神經(jīng)元幾乎遍布于大腦和脊髓的每一個(gè)結(jié)構(gòu)，能利用至少16 種不同的受體亞型進(jìn)行信號作用［74］。目前，已有文獻(xiàn)報(bào)道了不同受體亞型5-HT1［75-77］、5-HT2［78］、5-HT3［79］和5-HT5［80］、5-HT6［81］的熒光探針。Wang等［82］基于Mn 摻雜的ZnS 量子點(diǎn)印跡聚合物 （QDs@SiO2@MIPs）構(gòu)建了用于5-HT 檢測的熒光探針，當(dāng)5-HT 與探針結(jié)合時(shí)，QDs@SiO2@MIPs 的氨基與5-HT 的羥基形成配合物導(dǎo)致熒光猝滅。該材料具有較高的選擇性，印跡因子為5.96，檢測范圍為50~500 ng/mL，LOD 為0.69 ng/mL，適用于人血清中5-HT的檢測。

HA 作為一類重要的MNTs，廣泛參與免疫、消化和神經(jīng)信號的調(diào)控［83］，但其分子調(diào)控機(jī)制尚不清楚。Oshikawa 等［84］設(shè)計(jì)了基于花菁染料的Co（Ⅱ）復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了基于HA 誘導(dǎo)的熒光信號開啟檢測，可用于肥大細(xì)胞中HA 的測定。Wang 等［85］基于離子液體（IL）修飾的量子點(diǎn)和分子印跡技術(shù)合成了QDs@IL@MIP，用于HA熒光傳感檢測，線性范圍為 0.449~2.249 mmol/L，LOD為0.11 mmol/L。

2.3 氨基酸類

雖然氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)在化學(xué)上屬于生物胺的范疇，但其仍被歸為單獨(dú)的一類。Dalangin 等［86］總結(jié)了所有常規(guī)氨基酸以及一些最主要的非常規(guī)氨基酸在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用，其中包括20種常規(guī)氨基酸以及β-丙氨酸和γ-氨基丁酸，有重要的參考價(jià)值。

目前為止，興奮性氨基酸中最常見的是谷氨酸（Glu），已被確定為中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)。Pilicer等［87］構(gòu)建的探針13（圖5）可以識別包括Glu在內(nèi)的19種手性化合物。Zhao等［88］利用吡哆醛-5′-磷酸（PLP）和手性1，2-二氨基環(huán)己烷，構(gòu)建了基于BODIPY 熒光團(tuán)的D-Glu探針14，探針的PLP 部分可以從環(huán)己烷的氨基上離去并與D-Glu結(jié)合，此過程中存在顯著熒光變化，檢測范圍為0~0.5 mmol/L。

圖5 氨基酸響應(yīng)型熒光探針的結(jié)構(gòu)［87-88，92-93］Fig.5 The structures of responsive fluorescent probes for amino acid［87-88，92-93］

γ-氨基丁酸（GABA）能夠誘導(dǎo)突觸前后神經(jīng)元的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)變化，參與多種代謝活動(dòng)。用于GABA檢測的熒光探針相對較少，Masharina 等［89］合成了一種半合成融合蛋白GABA-Snifit，其在500~700 nm 范圍內(nèi)顯示出與GABA 濃度相關(guān)的熒光發(fā)射光譜，可以實(shí)現(xiàn)微摩爾到毫摩爾濃度的GABA 檢測。Marvin等［90］利用環(huán)狀排列的熒光蛋白，發(fā)展了一種新的GABA 熒光報(bào)告基因（iGABASnFR）變體，并在培養(yǎng)的神經(jīng)元和小鼠腦切片中觀察到線粒體對GABA的攝取和釋放。

氨基酸的氨基具有高反應(yīng)性，而香豆素、羅丹明和BODIPY 等熒光團(tuán)憑借穩(wěn)定的熒光特性被廣泛用于氨基酸檢測熒光探針的構(gòu)建［91］。探針15（圖5）在香豆素結(jié)構(gòu)上修飾了可與氨基反應(yīng)的醛基，可實(shí)現(xiàn)對谷氨酸、天冬氨酸等氨基酸的熒光檢測［92］。熒光胺（16）是一種用于伯胺檢測的商業(yè)化熒光探針，在生化分析中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。Motoyoshiya 等［93］在熒光胺的基礎(chǔ)上構(gòu)建了探針17，該探針在與甘氨酸、苯丙氨酸和丙氨酸的反應(yīng)性以及加合物的熒光強(qiáng)度方面優(yōu)于熒光胺。

目前，關(guān)于氨基酸響應(yīng)型熒光探針的研究相對較少，該類探針可用于氨基酸在細(xì)胞內(nèi)含量變化的監(jiān)測、探索其間的相互作用機(jī)制以及相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)理。由于氨基酸結(jié)構(gòu)相似且功能復(fù)雜，需要深入理解不同氨基酸特性及其在不同生物環(huán)境中的行為，以更好地開發(fā)出適用于特定需求、高特異性、高靈敏度的熒光探針。

2.4 神經(jīng)肽類

神經(jīng)肽由通過肽鍵連接在一起的兩個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸組成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在且作用復(fù)雜［5］。盡管許多開創(chuàng)性研究為神經(jīng)肽傳遞的功能作用提供了重要見解，但很多基本問題在很大程度上仍未得到探索，包括神經(jīng)肽在神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)中釋放的時(shí)間和地點(diǎn)，在健康和疾病中釋放的時(shí)空動(dòng)態(tài)，以及神經(jīng)肽具體的調(diào)節(jié)機(jī)制。Qian 等［94］總結(jié)了已報(bào)道的可視化神經(jīng)肽傳遞的光學(xué)工具，包括熒光蛋白標(biāo)記的神經(jīng)肽、基于細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)熒光工程報(bào)告基因（CNiFER）、受體激活測定（Tango）、基于G 蛋白偶聯(lián)受體（GRAB）活化熒光探針等，并概述了其設(shè)計(jì)原理、特性、優(yōu)勢和潛在局限性。這些工具可以提供亞秒級分辨率的神經(jīng)肽傳遞光學(xué)成像，并具有在體內(nèi)應(yīng)用的潛力。

2.5 嘌呤類

嘌呤類神經(jīng)遞質(zhì)主要作為神經(jīng)調(diào)節(jié)劑起作用，包括腺苷和三磷酸腺苷（ATP）。ATP 作為嘌呤類神經(jīng)遞質(zhì)中最受關(guān)注的一種，由腺嘌呤、核糖和3 個(gè)磷酸基團(tuán)組成，是細(xì)胞中的主要能量來源，是活細(xì)胞中的通用能量貨幣，也是參與三磷酸循環(huán)、離子通道和神經(jīng)傳遞、細(xì)胞分裂、DNA 合成等多種生物過程的信號介質(zhì)。此外，ATP的異常與缺血、低血糖帕金森病和心血管疾病等密切相關(guān)［95］。

基于ATP 的特殊形式，即具有3 個(gè)帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)、芳香族腺苷、核糖和多羥基，熒光探針可以通過帶負(fù)電荷的ATP 磷酸鹽和帶正電荷的識別基團(tuán)之間的靜電相互作用、電負(fù)性原子與核糖之間的共價(jià)鍵、大共軛結(jié)構(gòu)與腺嘌呤之間的π-π 相互作用對ATP進(jìn)行檢測。近些年發(fā)表了許多關(guān)于ATP熒光檢測的綜述：Wu等［95］根據(jù)熒光分子的不同結(jié)構(gòu)，將用于ATP檢測的熒光探針分為：基于金屬離子配合物、締合物、聚噻吩、生物分子以及多位點(diǎn)相互作用的熒光探針5類，同時(shí)概括了各類探針的優(yōu)勢。Huang 等［96］對細(xì)胞器靶向熒光ATP 探針在活細(xì)胞和體內(nèi)的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。他們根據(jù)探針的細(xì)胞器靶向能力將其分為不同類別，這些探針通過引入親脂性陽離子、弱堿性基團(tuán)和疏水部分，在靶向線粒體、溶酶體和細(xì)胞膜等細(xì)胞器方面取得了顯著進(jìn)展。其中，探針與ATP 之間的相互作用涉及靜電相互作用、氫鍵相互作用、π-π堆積相互作用、開環(huán)反應(yīng)以及它們的組合。另一方面，Jun等［97］介紹了基于不同識別策略進(jìn)行分類的ATP熒光探針，包括與三磷酸部分的靜電相互作用、與核堿基的π-π 堆積相互作用，以及與糖附近的二醇結(jié)合等，為該領(lǐng)域的研究提供了詳細(xì)且有益的參考。

Tamima 等［98］構(gòu)建的含有二吡啶配體的苯并香豆素染料的鋅（Ⅱ）復(fù)合物熒光探針18 可以可逆地與ATP 快速結(jié)合，特異性好。Sun 等［99］基于ATP 氫鍵和羅丹明基團(tuán)之間的π-π 相互作用開發(fā)的一種雙光子熒光探針19（圖6），可以通過與羅丹明衍生物的反應(yīng)引起熒光變化實(shí)現(xiàn)對ATP 的檢測，檢測范圍為2~5 mmol/L，LOD為0.01 mmol/L。

圖6 ATP結(jié)構(gòu)、用于開發(fā)ATP探針的3種不同的相互作用及相應(yīng)的探針［98-99］Fig.6 ATP structure，three different interactions used to develop ATP probes and corresponding probes［98-99］

2.6 氣 體

一氧化氮（NO）、一氧化碳（CO）和硫化氫（H2S）是3 種重要的氣態(tài)神經(jīng)遞質(zhì)，通過不同機(jī)制發(fā)揮相似的生物效應(yīng)，如這3 種氣體均具備血管擴(kuò)張作用，有助于促進(jìn)血管生成和血管重塑，同時(shí)也具備抗炎以及消炎作用［100］，熒光探針在探究這些神經(jīng)遞質(zhì)的復(fù)雜作用方面表現(xiàn)出一定的潛力。

目前關(guān)于NO 熒光探針的設(shè)計(jì)途徑主要包括利用過渡金屬配合物的置換反應(yīng)［101］、芳香基團(tuán)仲胺亞硝化反應(yīng)［102］、Hantzschester 芳構(gòu)化反應(yīng)［103］、形成Se-NO 鍵［104］、芳香伯胺還原［105］以及形成重氮環(huán)［106］。Wang 等［107］合成了一種基于BODIPY 的熒光探針20（圖7），可以定位在溶酶體中檢測NO。Han 等［108］構(gòu)建了比例熒光探針21對NO進(jìn)行檢測，纖維化肝臟的高粘性環(huán)境限制了分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，增強(qiáng)了熒光信號，使得熒光發(fā)生紅色到橙色的轉(zhuǎn)變。

圖7 氣體神經(jīng)遞質(zhì)熒光探針結(jié)構(gòu)［107-108，113］Fig.7 The structures of fluorescent probes for gas neurotransmitters［107-108，113］

CO 熒光探針大多基于金屬配合物［109-111］，Liu 等［112］對利用金屬配合物檢測CO 的熒光探針的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，主要介紹了兩種不同的方法：一是金屬配合物既用作CO熒光響應(yīng)的受體，也用作信號單元；二是在CO存在下，金屬配合物催化弱熒光發(fā)射的有機(jī)前體進(jìn)行氫化羧化、羰基化和疊氮羰基化從而得到強(qiáng)熒光衍生物。

針對H2S 熒光探針的報(bào)道較多，本研究小組在H2S、SO2、多硫化氫（H2Sn，n>1）等生物體系內(nèi)活性硫組分的代謝、成像以及信號傳導(dǎo)方面進(jìn)行了大量研究［113-118］，其反應(yīng)機(jī)制主要包括H2S 的親核加成、H2S 對二硝基苯醚或其它離去基團(tuán)的硫解、H2S 介導(dǎo)的疊氮化物或硝基還原為胺、H2S 置換銅沉淀［119-122］。Li 等［123］詳細(xì)介紹了親核加成、還原、銅離子沉淀等多種檢測H2S 的方法。Zhao 等［124］和Quan等［125］合成的基于BODIPY的熒光探針可實(shí)現(xiàn)H2S的快速響應(yīng)。Chen等［126］和Wang等［127］將基于香豆素-半菁和花菁骨架的線粒體靶向熒光探針用于H2S 檢測。探針22 通過將響應(yīng)基團(tuán)2-噻吩甲酰氯與菁染料熒光團(tuán)相結(jié)合，利用H2S的親核反應(yīng)和相應(yīng)單元的水解對H2S進(jìn)行檢測［113］。

3 總結(jié)與展望

本綜述主要介紹了響應(yīng)型熒光探針在神經(jīng)遞質(zhì)檢測領(lǐng)域的應(yīng)用與研究進(jìn)展。神經(jīng)遞質(zhì)作為神經(jīng)系統(tǒng)重要的信號傳遞分子，在神經(jīng)科學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中具有重要作用。通過設(shè)計(jì)合理的熒光探針，可以實(shí)現(xiàn)對神經(jīng)遞質(zhì)的高靈敏度、高選擇性、高特異性檢測，為研究神經(jīng)遞質(zhì)的分布、釋放、信號通路等提供強(qiáng)有力的工具。已有研究中針對不同類型的神經(jīng)遞質(zhì)，包括膽堿類、生物胺類、氨基酸類、神經(jīng)肽類以及氣體，均有相應(yīng)的熒光探針被開發(fā)，這些探針在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出優(yōu)異性能，有助于更深入地理解神經(jīng)遞質(zhì)的功能和調(diào)控機(jī)制。

然而，部分神經(jīng)遞質(zhì)（如氨基酸）的結(jié)構(gòu)和作用位點(diǎn)存在相似之處，需要實(shí)現(xiàn)更高水平的選擇性和特異性；另一方面，疾病的發(fā)生往往涉及多種神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，開發(fā)出能夠同時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測多種神經(jīng)遞質(zhì)的探針，將在臨床醫(yī)學(xué)上具有重要意義。這促使新一代的探針向更加靈敏、特異、快速以及多功能的方向發(fā)展，并可能需要借助人工智能和機(jī)器學(xué)習(xí)幫助篩選有意義的信息，為神經(jīng)遞質(zhì)研究提供更優(yōu)秀的解法，發(fā)揮熒光探針在分子醫(yī)學(xué)中的重要作用。