苗紫昀，李志豪，王 杰*

（1．蘇州大學(xué) 材料與化學(xué)化工學(xué)部，江蘇 蘇州 215006；2．武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與安全研究所，湖北 武漢 430345）

細(xì)胞膜是包裹在細(xì)胞質(zhì)外層、平均厚度約10 nm 的一層質(zhì)膜，在維持細(xì)胞胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、為基本生命活動(dòng)提供反應(yīng)場(chǎng)所等方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞中，大約30%的蛋白質(zhì)分子與細(xì)胞膜直接相連，這些蛋白參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、能量交換等重要生理活動(dòng)，被稱為膜蛋白。根據(jù)功能的不同，膜蛋白可以分為受體蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖蛋白等［1-4］。其中，受體蛋白具有分子識(shí)別功能，可以結(jié)合特定的受體分子并將化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡妼W(xué)等信號(hào)［5-6］，進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分為載體蛋白與通道蛋白，負(fù)責(zé)大分子、小分子和離子等的主動(dòng)運(yùn)輸和協(xié)助擴(kuò)散。糖蛋白是一類含有寡糖鏈的蛋白質(zhì)，主要參與生物識(shí)別過(guò)程。蛋白的表達(dá)量、空間分布、組織結(jié)構(gòu)等與其生物學(xué)功能密切相關(guān)。例如血液中的紅細(xì)胞膜上會(huì)過(guò)表達(dá)整合素相關(guān)蛋白CD47，CD47 與巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α 結(jié)合后能夠激活下游信號(hào)通路，向巨噬細(xì)胞傳遞“別吃我”的信號(hào)從而阻止巨噬細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞的吞噬［7］；蛋白酪氨酸激酶7（PTK7）等多種膜蛋白會(huì)以團(tuán)簇的形式存在于細(xì)胞膜上，膜蛋白團(tuán)簇能夠提高其與受體的結(jié)合能力［8］。膜蛋白表達(dá)量、組織結(jié)構(gòu)等的異常往往與多種疾病密切相關(guān)［9-10］，例如卵巢癌、結(jié)腸癌、白血病等多種病變細(xì)胞表面會(huì)過(guò)表達(dá)CD47來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，從而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。膜蛋白在生命活動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，然而目前大部分膜蛋白的分子作用機(jī)制尚不明確。了解膜蛋白的空間分布、組織結(jié)構(gòu)等信息對(duì)生命活動(dòng)分子機(jī)制研究、疾病診斷治療等至關(guān)重要［11-12］。

目前膜蛋白的研究方法可以分為非原位方法和原位方法。蛋白質(zhì)印跡法、質(zhì)譜法是最常用的非原位膜蛋白定量分析方法，具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)勢(shì)［13］。然而，非原位膜蛋白分析方法需要將膜蛋白從細(xì)胞膜中提取出來(lái)，往往會(huì)損失膜蛋白在細(xì)胞上的結(jié)構(gòu)信息和空間分布信息。近年來(lái)，隨著化學(xué)標(biāo)記和成像技術(shù)的發(fā)展，研究者開發(fā)了多種基于不同原理和模式的化學(xué)探針用于膜蛋白的實(shí)時(shí)、原位分析。例如基于點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)能夠在糖蛋白上標(biāo)記熒光分子，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖蛋白空間分布和組織結(jié)構(gòu)的原位觀測(cè)［14］；利用核酸適體的選擇性識(shí)別功能能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)蛋白的特異性標(biāo)記，可對(duì)目標(biāo)蛋白的表達(dá)量、分布、聚集狀態(tài)等進(jìn)行原位研究［15］。膜蛋白原位成像探針與靶標(biāo)膜蛋白結(jié)合后可產(chǎn)生熒光、拉曼等信號(hào)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白分布和結(jié)構(gòu)變化的原位觀測(cè)，具有可視化、設(shè)計(jì)靈活、易于操作等優(yōu)勢(shì)。膜蛋白原位分析方法能夠保留生理狀態(tài)下膜蛋白的原始信息，在膜蛋白分子機(jī)制研究中具有廣闊的應(yīng)用前景。

本文將介紹近年來(lái)發(fā)展的膜蛋白原位分析方法，總結(jié)常規(guī)熒光成像技術(shù)和超分辨熒光成像技術(shù)在膜蛋白成像中的應(yīng)用進(jìn)展情況，并介紹電化學(xué)發(fā)光成像、核磁共振成像和表面增強(qiáng)拉曼散射成像在膜蛋白原位分析中的最新應(yīng)用進(jìn)展。最后，對(duì)膜蛋白成像領(lǐng)域的發(fā)展進(jìn)行總結(jié)，對(duì)存在的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行討論，旨在為膜蛋白成像探針的設(shè)計(jì)提供參考，推動(dòng)膜蛋白分子機(jī)制研究及膜蛋白在疾病診斷治療等領(lǐng)域的發(fā)展。

1 熒光成像

熒光成像具有靈敏度高、可視化、原位、無(wú)創(chuàng)等優(yōu)勢(shì)，在膜蛋白成像中具有廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，研究人員對(duì)熒光成像探針進(jìn)行不斷創(chuàng)新和優(yōu)化，顯著提高了膜蛋白熒光成像的靈敏度和特異性。同時(shí)，突破了衍射極限的超分辨熒光成像技術(shù)不斷發(fā)展，有效提高了膜蛋白空間分布和組織結(jié)構(gòu)的成像精度。這些成像探針和成像技術(shù)的發(fā)展，為膜蛋白的原位動(dòng)態(tài)成像提供了強(qiáng)有力的工具。本小節(jié)將對(duì)常見的膜蛋白熒光成像探針進(jìn)行概述，同時(shí)對(duì)超分辨熒光顯微技術(shù)在膜蛋白成像中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹。

1.1 核酸探針

核酸適體是一類可以與離子、小分子、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等靶標(biāo)物高選擇性結(jié)合的DNA 或RNA 序列［16］，具有易于合成與修飾、分子量小、成本低等優(yōu)勢(shì)，在膜蛋白標(biāo)記與成像中吸引了廣泛關(guān)注。2019年，福州大學(xué)楊黃浩教授和李娟教授將代謝標(biāo)記技術(shù)與DNA自組裝技術(shù)相結(jié)合［17］，實(shí)現(xiàn)了膜蛋白糖基化修飾的成像分析。該方法首先利用糖代謝標(biāo)記技術(shù)在細(xì)胞膜糖蛋白上標(biāo)記疊氮基團(tuán)，然后利用帶有炔基的DNA探針與疊氮基反應(yīng)從而在糖蛋白上共價(jià)標(biāo)記DNA片段，接著通過(guò)核酸適體探針識(shí)別糖蛋白并與糖蛋白上的DNA 片段雜交，引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜上糖蛋白的原位成像。作者結(jié)合DNA 的精準(zhǔn)距離控制優(yōu)勢(shì)和HCR 的信號(hào)放大特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞表面PTK7 以及上皮細(xì)胞粘附分子（EpCAM）的糖基化檢測(cè)，并能靈敏地檢測(cè)藥物作用下膜蛋白糖基化水平的變化。這一工作實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞特定蛋白糖基化的可視化分析，對(duì)在細(xì)胞生理環(huán)境下闡明蛋白糖基化過(guò)程具有重要意義。

大多數(shù)核酸適體的靶蛋白在細(xì)胞膜表面高表達(dá)，但膜蛋白較高的分布密度與較快的運(yùn)動(dòng)速度導(dǎo)致很難在單分子水平上利用核酸適體對(duì)其進(jìn)行高精度的原位分析。針對(duì)這一問(wèn)題，湖南大學(xué)譚蔚泓教授和呂一帆教授提出了一種全新的“配體稀釋”策略來(lái)提高膜蛋白成像的精度（圖1）［18］。該策略采用大量非熒光標(biāo)記的核酸適體探針對(duì)熒光探針進(jìn)行稀釋，使少量的膜蛋白標(biāo)記上熒光探針，從而實(shí)現(xiàn)單分子水平的膜蛋白熒光成像。具體來(lái)說(shuō)，由于熒光探針和非熒光探針具有相同的識(shí)別區(qū)域，兩者對(duì)靶標(biāo)蛋白的識(shí)別呈現(xiàn)一個(gè)類似隨機(jī)取樣的過(guò)程，同時(shí)非熒光探針能夠“稀釋”熒光探針的成像效果。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠大時(shí)，相鄰兩個(gè)熒光探針之間的標(biāo)記信號(hào)即可被清晰地區(qū)分開來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)膜蛋白分子的成像。該研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了可以計(jì)算細(xì)胞表面受體密度的回歸模型，并進(jìn)一步通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬確定了核酸適體與膜蛋白的準(zhǔn)確結(jié)合位點(diǎn)和具體結(jié)合方式。此外，利用配體稀釋技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)膜蛋白的動(dòng)態(tài)分析，從而得到膜蛋白隨時(shí)間變化的分布信息，實(shí)現(xiàn)對(duì)高表達(dá)膜蛋白在活細(xì)胞膜表面的二維以及三維運(yùn)動(dòng)狀況分析。該設(shè)計(jì)為表征單分子膜蛋白提供了全新的思路，對(duì)于深入了解膜蛋白的空間分布、運(yùn)動(dòng)和相互作用模式具有重要意義。

圖1 基于配體稀釋策略的單分子膜蛋白熒光成像［18］Fig.1 Fluorescence imaging of monomolecular membrane proteins based on ligand dilution strategy ［18］

雖然研究者開發(fā)了大量熒光探針用于膜蛋白空間分布和運(yùn)動(dòng)行為的監(jiān)測(cè)，但要區(qū)分膜蛋白在水平、垂直等不同方向的運(yùn)動(dòng)仍然存在巨大挑戰(zhàn)［19-21］。2019 年，中國(guó)科學(xué)院劉聰教授和李明教授基于DNA 分子設(shè)計(jì)了一種單分子LipoFRET 探針，實(shí)現(xiàn)了對(duì)脂質(zhì)體膜上α-突觸核蛋白（α-syn）在垂直方向的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀測(cè)［22］。α-syn是路易小體的主要組分，其在細(xì)胞膜上的位置變化與帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)［23］。作者將長(zhǎng)度為10個(gè)核苷酸的單鏈DNA（ssDNA）錨定到脂質(zhì)體上，并在脂質(zhì)體內(nèi)包封5 mmol/L 臺(tái)盼藍(lán)溶液，ssDNA 片段的兩端分別用四甲基羅丹明（TAMRA）和膽固醇標(biāo)記。疏水性烷基部分可以自發(fā)地結(jié)合到脂質(zhì)雙層中，從而將DNA 錨定在膜上。該團(tuán)隊(duì)利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）技術(shù)，通過(guò)測(cè)量熒光強(qiáng)度與F0的比值得出垂直方向上的距離變化，證明了α-syn 在膜上的多種存在狀態(tài)，且方法不受α-syn 非結(jié)構(gòu)化尾端水環(huán)境的影響［22］。2021 年他們又通過(guò)測(cè)量熒光標(biāo)記分子的熒光強(qiáng)度或熒光壽命信號(hào)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜標(biāo)記位點(diǎn)在垂直方向上的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)［24］（圖2）。該課題組將全內(nèi)反射熒光顯微鏡和熒光壽命成像顯微鏡相結(jié)合對(duì)標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。當(dāng)熒光團(tuán)標(biāo)記的分子從膜的外表面移動(dòng)到膜的內(nèi)表面時(shí)，熒光團(tuán)和脂質(zhì)體內(nèi)猝滅劑之間的smFRET 過(guò)程會(huì)導(dǎo)致熒光的急劇變化。因此，熒光團(tuán)標(biāo)記的膜蛋白在細(xì)胞膜中的位置變化可以通過(guò)熒光強(qiáng)度或壽命變化來(lái)反映。該方法用于細(xì)胞膜上單個(gè)膜蛋白動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)時(shí)的精度可達(dá)1 nm，約等于細(xì)胞膜總厚度的十分之一，是目前已報(bào)道的原位分析活細(xì)胞膜蛋白在垂直方向運(yùn)動(dòng)的最精密方法。

圖2 FRET探針用于垂直方向上膜蛋白位置成像的示意圖［24］Fig.2 Diagram of a FRET probe for the imaging position of a membrane protein in the vertical direction［24］

1.2 蛋白質(zhì)探針

抗體具有良好的特異性識(shí)別功能，在膜蛋白的免疫熒光標(biāo)記方面得到了廣泛應(yīng)用。目前的膜蛋白免疫熒光分析技術(shù)已經(jīng)非常成熟，本小節(jié)不再介紹傳統(tǒng)的免疫熒光成像方法。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）是一種發(fā)生于供體和受體分子之間的非輻射能量轉(zhuǎn)移過(guò)程［25］。在該過(guò)程中，受體分子的激發(fā)光譜和供體分子的發(fā)射光譜相互重疊且兩分子之間的距離在合適的范圍內(nèi)時(shí)，供體的激發(fā)態(tài)能量能夠傳遞給受體分子并使受體分子發(fā)出熒光［26-27］。FRET效率與供體和受體之間的距離變化密切相關(guān)，通過(guò)對(duì)FRET 探針進(jìn)行合理設(shè)計(jì)，使探針與靶標(biāo)膜蛋白結(jié)合之后觸發(fā)供體和受體之間的距離變化，進(jìn)而引起探針熒光信號(hào)的改變，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)膜蛋白的成像。湖南大學(xué)姚守拙院士課題組利用半合成綠色熒光蛋白（GFP）劈裂片段之間的高親和力和自發(fā)組裝能力設(shè)計(jì)了FRET探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞膜蛋白酶的活性［28］。該探針包括一個(gè)截短的GFP 片段和一個(gè)合成肽（P）兩個(gè)部分。其中，P 是由GFP11 鏈（GFP 的第11個(gè)β鏈）、蛋白酶底物序列和四甲基羅丹明（TAMRA）依次連接組成的結(jié)構(gòu)，GFP1-10（GFP 的第1 到10 個(gè)β鏈）和肽P 可以自發(fā)組裝成一個(gè)完整的GFP（圖3）。由于TAMRA 的激發(fā)光譜與GFP 的發(fā)射光譜重疊，此時(shí)便形成了一對(duì)以重組GFP 為供體、TAMRA 為受體的FRET 對(duì)。為了達(dá)到原位檢測(cè)的效果，作者在探針GFP1-10的N端引入定位細(xì)胞膜的多肽序列蜂毒肽（MIP）。當(dāng)細(xì)胞表面存在靶蛋白酶時(shí)，靶蛋白酶會(huì)對(duì)特定的底物位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別并水解，使得TAMRA 遠(yuǎn)離GFP 并導(dǎo)致FRET 效率下降。FGFP/FTAMRA比值的變化可以動(dòng)態(tài)反映膜蛋白酶催化反應(yīng)和酶活性，還能夠監(jiān)測(cè)該酶在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平。

圖3 半合成熒光蛋白組裝的FRET探針用于膜蛋白分析的示意圖［28］Fig.3 Schematic diagram of FRET probe assembled with semi synthetic fluorescent protein for membrane protein analysis［28］

利用基因編輯技術(shù)使目標(biāo)蛋白與熒光蛋白融合是在原生細(xì)胞環(huán)境中原位觀察目標(biāo)蛋白的最常用技術(shù)之一，熒光蛋白融合技術(shù)在膜蛋白成像方面也得到了大量的應(yīng)用。然而，并不是所有的蛋白質(zhì)都能與熒光蛋白融合，而且熒光蛋白還可能導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)量、表達(dá)位置和功能的異常。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，愛丁堡大學(xué)Lynne 教授團(tuán)隊(duì)基于非共價(jià)瞬時(shí)相互作用利用短肽將熒光蛋白短暫地結(jié)合到目標(biāo)蛋白質(zhì)上進(jìn)行成像觀測(cè)，該方法可以應(yīng)用于不能與熒光蛋白直接融合的蛋白質(zhì)［29］。短肽標(biāo)簽非共價(jià)標(biāo)記技術(shù)比常規(guī)熒光蛋白融合技術(shù)對(duì)目標(biāo)蛋白產(chǎn)生的干擾小，僅標(biāo)記5 個(gè)殘基肽即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的成像，非常適用于對(duì)修飾特別敏感的蛋白質(zhì)原位研究。該團(tuán)隊(duì)選擇釀酒酵母中的3 種不能與熒光蛋白直接融合的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sit1、Agp1和Bap2）作為研究模型，將螺旋狀肽101B 融合到目標(biāo)膜蛋白的C 端，膜蛋白上的螺旋狀肽101B 通過(guò)肽-肽相互作用與標(biāo)記螺旋狀肽101A 的黃綠色熒光蛋白（101AmNG）相結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白的原位成像研究。他們還將短肽標(biāo)簽非共價(jià)標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)的熒光蛋白融合技術(shù)進(jìn)行了對(duì)比，發(fā)現(xiàn)膜蛋白Sit1 直接與mNG 融合時(shí)mNG 不能定位到膜上，膜蛋白Agp1 和Bap2 直接與mNG 融合同樣會(huì)干擾膜定位效果；而利用膜蛋白C 端的螺旋狀肽101B 與101A-mNG 的肽-肽相互作用進(jìn)行膜蛋白成像時(shí)得到了良好的膜定位效果（圖4）。此外，通過(guò)改變螺旋狀肽的種類，該方法還可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜上多種膜蛋白的同時(shí)原位成像。

圖4 傳統(tǒng)的熒光蛋白融合技術(shù)示意圖（左圖）及其對(duì)膜蛋白的成像效果（右圖）（A）；基于肽-肽相互作用的非共價(jià)熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)示意圖（左圖）及其對(duì)膜蛋白的成像效果（右圖）［29］（B）Fig.4 Schematic diagram of traditional fluorescent protein fusion techniques（left） and the corresponding membrane protein imaging results（right）（A），schematic diagram of non-covalent fluorescent protein labeling technology based on peptide-peptide interaction（left）and the corresponding membrane protein imaging results（right） ［29］（B）

1.3 肽核酸探針

通常來(lái)說(shuō)，抗體的分子量相對(duì)較大，在標(biāo)記膜蛋白時(shí)會(huì)存在潛在的空間位阻與交聯(lián)現(xiàn)象，可能會(huì)對(duì)膜蛋白的成像精度和功能造成影響。為了避免這一問(wèn)題，德國(guó)柏林洪堡大學(xué)Seitz 課題組利用肽核酸（Peptide nucleic acid，PNA）實(shí)現(xiàn)了高精度的多重膜蛋白成像［30］。PNA 是一種人工合成的化學(xué)分子，其結(jié)構(gòu)與DNA 類似，但缺少磷酸基團(tuán)。因此，PNA 與核酸、蛋白質(zhì)等分子之間不會(huì)發(fā)生靜電排斥作用，且PNA 能夠與靶標(biāo)分子高親和性結(jié)合［31］。此外，PNA的分子量較小，僅有2 kDa，對(duì)蛋白質(zhì)的功能影響較小。在該工作中，研究者首先通過(guò)基因編輯技術(shù)在靶標(biāo)膜蛋白上共表達(dá)受體多肽，肽核酸偶聯(lián)的多肽分子能夠與膜蛋白上的受體多肽特異性結(jié)合，從而在膜蛋白上特異性標(biāo)記肽核酸分子。進(jìn)一步，肽核酸分子能夠與熒光標(biāo)記的DNA 分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)膜蛋白的原位成像。PNA 具有較高的抗核酸酶穩(wěn)定性，膜蛋白上的PNA 探針能夠在生理環(huán)境下長(zhǎng)期穩(wěn)定存在。作者利用該方法對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和B型內(nèi)皮素受體（ETBR）進(jìn)行了PNA標(biāo)記，整個(gè)反應(yīng)可以在1 min之內(nèi)完成。結(jié)果表明，PNA標(biāo)簽探針用于膜蛋白成像時(shí)具有良好的分辨率。PNA 為膜蛋白成像提供了結(jié)合力強(qiáng)、標(biāo)記簡(jiǎn)單高效的標(biāo)簽分子，可與多種染料分子聯(lián)合使用，在多種膜蛋白的同時(shí)成像中具有重要的應(yīng)用前景。此外，該P(yáng)NA 標(biāo)簽技術(shù)為多模態(tài)成像提供了一個(gè)便利的平臺(tái)，通過(guò)在互補(bǔ)DNA 分子上標(biāo)記拉曼分子、電化學(xué)發(fā)光分子等可以實(shí)現(xiàn)對(duì)膜蛋白的拉曼成像和電化學(xué)發(fā)光成像。

南京大學(xué)鄭鵬教授和李喆教授提出了一種利用工程蛋白連接酶OaAEP1 的催化作用將目標(biāo)蛋白與PNA精確偶聯(lián)的方法［32］。在該方法中，目標(biāo)蛋白的N末端修飾了氨基酸GL二肽，PNA 的C末端修飾氨基酸NGL三肽。OaAEP1催化目標(biāo)蛋白上的GL二肽與PNA上的NGL三肽反應(yīng)產(chǎn)生具有3-氨基酸連接體NGL 的目標(biāo)蛋白-PNA 綴合物。這種方法可以準(zhǔn)確地將PNA 修飾到目標(biāo)蛋白的N 末端，能夠在對(duì)蛋白質(zhì)功能干擾最小的情況下精確控制偶聯(lián)位點(diǎn)。該團(tuán)隊(duì)選取EGFR 作為目標(biāo)蛋白，首先，PNA 通過(guò)OaAEP1 的催化反應(yīng)錨定在EGFR 上；然后在DNA 折紙納米結(jié)構(gòu)的一側(cè)標(biāo)記PNA，另一側(cè)標(biāo)記單鏈DNA 分子，單鏈DNA 與熒光標(biāo)記的短鏈互補(bǔ)DNA 片段相結(jié)合，即可使DNA 折紙納米結(jié)構(gòu)標(biāo)記上熒光分子。進(jìn)一步，通過(guò)DNA折紙納米結(jié)構(gòu)上的PNA與細(xì)胞膜EGFR上PNA之間的相互作用將DNA折紙納米結(jié)構(gòu)與EGFR 相連接，實(shí)現(xiàn)對(duì)EGFR 的原位熒光成像（圖5）。此外，該團(tuán)隊(duì)還證明對(duì)EGFR 的熒光標(biāo)記可以利用DNA 鏈置換反應(yīng)進(jìn)行擦除，具體方法為用一段長(zhǎng)鏈DNA 置換下DNA 折紙納米結(jié)構(gòu)上熒光標(biāo)記的短鏈DNA片段。

圖5 酶催化的PNA連接技術(shù)用于膜蛋白的可擦除熒光成像示意圖［32］Fig.5 Schematic illustration of enzymatic catalyzed PNA ligation technology for erasable fluorescence imaging of membrane proteins［32］

近年來(lái)，超分辨熒光成像技術(shù)在膜蛋白原位分析方面得到了大量應(yīng)用。膜蛋白的尺寸較小，通常在10 nm 左右［33］。因此，常規(guī)的熒光顯微鏡無(wú)法精確地觀察膜蛋白的空間分布和組織結(jié)構(gòu)。超分辨熒光顯微鏡具有非常高的空間分辨率，可以實(shí)現(xiàn)單分子定位和成像［34］。中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所王宏達(dá)研究員發(fā)展了一種高特異性的小分子肽對(duì)細(xì)胞膜上EpCAM 進(jìn)行標(biāo)記，并利用直接隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)（dSTORM）超分辨熒光顯微鏡對(duì)其進(jìn)行成像分析［35］。結(jié)果表明，EpCAM 蛋白以聚集形態(tài)分布于人乳腺癌細(xì)胞膜上（圖6）?；诔上窠Y(jié)果，該團(tuán)隊(duì)創(chuàng)新性地提出從膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的角度來(lái)研究細(xì)胞間有序相互作用機(jī)制的策略，并進(jìn)一步推測(cè)膜的結(jié)構(gòu)可能決定了細(xì)胞之間的相互作用方式。由于膜蛋白中存在底物結(jié)合位點(diǎn)，王宏達(dá)研究員團(tuán)隊(duì)在保留底物特異性識(shí)別能力和生物活性的同時(shí)，用有機(jī)染料修飾小底物，形成小型熒光探針，用于膜蛋白的超分辨成像?；陬愃频牟呗裕?6］，該團(tuán)隊(duì)以膜蛋白分泌起源作為切入點(diǎn)，利用超分辨顯微鏡對(duì)EGFR 從合成、分泌到轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)膜上的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行了直接、高分辨率的成像觀測(cè)，實(shí)現(xiàn)了整個(gè)過(guò)程中亞細(xì)胞層面EGFR 的分布和組織結(jié)構(gòu)分析。

圖6 雙色dSTORM技術(shù)用于EpCAM和CD9的超分辨熒光成像［35］Fig.6 Dual-color-dSTORM technology for super-resolution imaging of EpCAM and CD9［35］

有機(jī)熒光小分子在細(xì)胞水平的膜蛋白成像中發(fā)揮了重要作用，極大推動(dòng)了細(xì)胞生理活動(dòng)分子機(jī)制相關(guān)研究的進(jìn)展。在組織水平和活體水平進(jìn)行膜蛋白成像是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)，將有助于理解膜蛋白與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移、惡化等的相關(guān)性，從而為腫瘤診斷和治療提供指導(dǎo)。但熒光小分子在組織和活體水平的膜蛋白成像中存在自發(fā)熒光干擾，導(dǎo)致成像靈敏度和分辨率降低。長(zhǎng)余輝納米材料和上轉(zhuǎn)換納米材料則在消除組織自發(fā)熒光干擾方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［37］。長(zhǎng)余輝納米材料能夠在激發(fā)光關(guān)閉后持續(xù)發(fā)光，而組織自發(fā)熒光壽命短、在激發(fā)光關(guān)閉后迅速消失，故在自發(fā)熒光消失后采集長(zhǎng)余輝發(fā)光信號(hào)能夠有效避免自發(fā)熒光的干擾，顯著提高成像靈敏度和分辨率［38-39］。上轉(zhuǎn)換納米材料能夠被808 nm 或980 nm的近紅外光激發(fā)，而生物組織中的熒光團(tuán)不能被激發(fā)，因此上轉(zhuǎn)換納米材料也能夠避免組織的自發(fā)熒光干擾［40］。此外，近年來(lái)開發(fā)的近紅外-近紅外稀土下轉(zhuǎn)換材料也能夠有效消除自發(fā)熒光干擾，在深層組織膜蛋白成像中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)［41］。長(zhǎng)余輝納米材料、上轉(zhuǎn)換納米材料和近紅外-近紅外稀土下轉(zhuǎn)換材料能夠?yàn)榻M織水平和活體水平的膜蛋白成像提供強(qiáng)有力的工具。

2 電化學(xué)發(fā)光（ECL）成像

ECL是指電化學(xué)反應(yīng)后發(fā)光分子激發(fā)態(tài)的能量弛豫和電子躍遷所引起的光輻射過(guò)程。與熒光相比，ECL 不依賴于外部光源，能夠有效避免背景熒光干擾和光漂白干擾。因此，ECL 成像顯著提高了膜蛋白分析的信噪比和靈敏度，在膜蛋白原位分析中具有廣泛的應(yīng)用［42］。雖然ECL 成像具有靈敏度高等一系列優(yōu)勢(shì)，但由于電化學(xué)發(fā)光分子信號(hào)微弱，使用ECL 顯微鏡觀察活細(xì)胞上的單個(gè)蛋白質(zhì)仍然是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)。2021年，南京大學(xué)鞠熀先教授團(tuán)隊(duì)基于雙分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移策略設(shè)計(jì)了一種共反應(yīng)劑內(nèi)嵌的ECL 叔胺共軛聚合物點(diǎn)（TEA-Pdots），實(shí)現(xiàn)了人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）的單分子ECL 成像（圖7）［43］。該團(tuán)隊(duì)以TEA-Pdots 聚合物點(diǎn)作為標(biāo)記材料，無(wú)需外加共反應(yīng)劑即能實(shí)現(xiàn)ECL 成像。TEA-Pdots 聚合物點(diǎn)的ECL 強(qiáng)度是傳統(tǒng)分子間電子轉(zhuǎn)移體系的132 倍，其ECL 效率甚至高于經(jīng)典的釕聯(lián)吡啶-共反應(yīng)劑體系，為高靈敏度、無(wú)共反應(yīng)劑的膜蛋白ECL成像提供了新的思路。另外，TEA-Pdots 較弱的細(xì)胞毒性和強(qiáng)的共反應(yīng)劑嵌入ECL發(fā)射有利于成像系統(tǒng)在單個(gè)活細(xì)胞上進(jìn)行膜蛋白的成像分析。這一工作為細(xì)胞上單個(gè)HER2蛋白的分析提供了強(qiáng)有力的工具。2022 年，復(fù)旦大學(xué)劉寶紅教授團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種新型Ru（bpy）32+嵌入的金屬有機(jī)框架（MOF）材料作為ECL 納米發(fā)光單元，以提高ECL 成像的精度和靈敏度，從而實(shí)現(xiàn)單分子水平上的生物分子監(jiān)測(cè)［44］。作為一種重要的多孔材料，MOF 具有可調(diào)節(jié)的孔隙率和可定制的化學(xué)性質(zhì)，在分子存儲(chǔ)、藥物控釋和催化領(lǐng)域得到了廣泛研究。研究表明基于MOF的復(fù)合材料表現(xiàn)出優(yōu)異的電化學(xué)性能。受電化學(xué)中限域效應(yīng)的啟發(fā)，劉寶紅教授團(tuán)隊(duì)將Ru（bpy）32+分子負(fù)載在具有多孔通道結(jié)構(gòu)的Zr基MOF內(nèi)部（圖8），以形成的RuMOFs 作為單個(gè)ECL 納米發(fā)射體；進(jìn)一步將Sgc8 核酸適體修飾在RuMOFs 的表面構(gòu)建ECL 納米探針，用于靶向細(xì)胞膜表面的PTK7 蛋白。該團(tuán)隊(duì)使細(xì)胞在電極表面上生長(zhǎng)，然后與RuMOFs-Sgc8 共孵育，通過(guò)Sgc8與PTK7膜蛋白的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對(duì)PTK7的標(biāo)記。在犧牲劑三丙胺參與氧化還原反應(yīng)并產(chǎn)生足夠的電勢(shì)后，通過(guò)ECL 顯微鏡收集RuMOFs-Sgc8 產(chǎn)生的ECL 信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞膜表面PTK7 蛋白的成像，且單個(gè)ECL 點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)分子。該團(tuán)隊(duì)對(duì)CCRF-CEM 細(xì)胞、HeLa 細(xì)胞和Ramos細(xì)胞上的PTK7蛋白進(jìn)行成像研究，在CCRF-CEM 細(xì)胞和HeLa細(xì)胞上觀察到了密集的ECL斑點(diǎn)，說(shuō)明PTK7蛋白在這兩種細(xì)胞表面高表達(dá)。而在Ramos細(xì)胞上觀察到了稀疏的ECL斑點(diǎn)，斑點(diǎn)數(shù)量約為CCRF-CEM 細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的五分之一，說(shuō)明PTK7在Ramos細(xì)胞上低表達(dá)。該ECL方法測(cè)得的PTK7蛋白在不同細(xì)胞上表達(dá)量的趨勢(shì)與傳統(tǒng)免疫分析技術(shù)測(cè)試的結(jié)果一致，表明了該單分子ECL 策略在原位可視化分析膜蛋白分布和表達(dá)量中的有效性和準(zhǔn)確性。

圖7 基于TEA-Pdots的細(xì)胞膜HER2 ECL成像示意圖［43］Fig.7 Schematic illustration of TEA-Pdots for ECL microimaging of HER2 on cell membrane［43］

圖8 基于RuMOFs的細(xì)胞膜PTK7 ECL成像示意圖［44］Fig.8 Schematic illustration of ECL imaging of membrane protein based on RuMOFs［44］

3 核磁共振成像（MRI）

核磁共振譜是在原子級(jí)分辨率下分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、相互作用和動(dòng)力學(xué)的強(qiáng)有力方法［45］。核磁共振信號(hào)對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)環(huán)境的細(xì)微變化非常敏感，這使其成為研究細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的強(qiáng)有力工具，在膜蛋白成像中具有重要的應(yīng)用。動(dòng)脈粥樣硬化可導(dǎo)致大多數(shù)心血管疾病，同濟(jì)大學(xué)劉中民教授、陳炳地研究員和復(fù)旦大學(xué)王鶴研究員提出利用巨噬細(xì)胞膜包裹的Fe3O4（Fe3O4@M）對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)行早期診斷［46］。Fe3O4是一種典型的MRI造影劑，整合素α4β1在巨噬細(xì)胞膜上高度表達(dá)，將巨噬細(xì)胞膜包裹在Fe3O4納米顆粒表面能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表面血管粘附分子-1（VCAM-1）的特異性識(shí)別，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的成像。動(dòng)脈粥樣硬化大鼠注射Fe3O4@M后24 h在主動(dòng)脈根部觀察到明顯的MR信號(hào)。作者還制備了聚乙二醇改性的Fe3O4（Fe3O4@PEG）作為對(duì)照，注射了Fe3O4@PEG 的動(dòng)脈粥樣硬化大鼠中觀察到的MR 信號(hào)無(wú)顯著變化。這些結(jié)果表明Fe3O4@M 可靶向細(xì)胞表面的VCAM-1 并實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊成像。

水通道蛋白4（AQP4）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要水通道蛋白之一，是膠質(zhì)瘤的重要生物標(biāo)志物，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活動(dòng)和功能中發(fā)揮著重要作用。由于AQP4 是一種大分子膜蛋白，難以通過(guò)常規(guī)磁共振波譜（MRS）等磁共振成像技術(shù)進(jìn)行分析。浙江大學(xué)白瑞良及山東省立醫(yī)院劉英超團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)AQP4 能夠介導(dǎo)水分子跨膜運(yùn)輸，且單個(gè)AQP4分子每秒能夠介導(dǎo)大量（~2.4 pL）水分子通過(guò)細(xì)胞膜（膠質(zhì)瘤細(xì)胞體積約為10 pL）。基于這些特點(diǎn)，該團(tuán)隊(duì)提出了一種AQP4 磁共振成像的新技術(shù)——跨膜水交換的動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)MRI，即通過(guò)測(cè)量AQP4介導(dǎo)的水分子跨膜流出速率kio對(duì)AQP4分子進(jìn)行特異性定位，改造動(dòng)態(tài)對(duì)比增強(qiáng)磁共振成像技術(shù)，實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤內(nèi)AQP4 的無(wú)創(chuàng)、高分辨、定量成像［47］。這種非侵入性的成像技術(shù)為無(wú)創(chuàng)評(píng)估膠質(zhì)瘤不同亞區(qū)域AQP4的生物活性提供了新的手段。

4 表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）成像

SERS 是指拉曼活性分子在特定基底表面時(shí)拉曼散射信號(hào)能夠顯著增強(qiáng)的現(xiàn)象。SERS 成像具有靈敏度高、易于操作、可實(shí)現(xiàn)多重分析等優(yōu)勢(shì)，在膜蛋白研究中具有良好的應(yīng)用前景［48］。南京郵電大學(xué)汪聯(lián)輝教授和宋春元教授利用SERS方法對(duì)癌細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞或干細(xì)胞結(jié)合時(shí)膜蛋白的二聚化過(guò)程進(jìn)行了監(jiān)測(cè)［49］。該團(tuán)隊(duì)通過(guò)鄰近雜交介導(dǎo)催化發(fā)夾組裝（CHA）策略將基于AuNPs 的雙重識(shí)別探針和SERS標(biāo)簽連接，同時(shí)對(duì)單個(gè)活細(xì)胞上膜蛋白的同源二聚體進(jìn)行成像，提出了一種具有高靈敏度和特異性的單個(gè)活細(xì)胞膜蛋白二聚化SERS 成像策略?；贑HA 的網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)組裝可以形成大量表面增強(qiáng)拉曼散射熱點(diǎn)并產(chǎn)生強(qiáng)烈的表面拉曼散射增強(qiáng)效果，顯著提高蛋白成像靈敏度。如圖9 所示，適配體序列T-Met-1和T-Met-2可以特異性識(shí)別并獨(dú)立結(jié)合間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子（Met）二聚體中的兩個(gè)單體，同時(shí)兩條序列末端還能通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)進(jìn)行雜交并觸發(fā)CHA 反應(yīng)，進(jìn)一步組裝得到網(wǎng)絡(luò)納米結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)拉曼散射信號(hào)。該團(tuán)隊(duì)選擇來(lái)源于人前列腺癌細(xì)胞的Met 陽(yáng)性和TβRⅡ陽(yáng)性細(xì)胞系DU145 作為細(xì)胞模型，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以通過(guò)誘導(dǎo)Met二聚化來(lái)激活Met受體，在添加基于AuNPs的探針后，獲得SERS信號(hào)。該方法可以準(zhǔn)確識(shí)別膜蛋白二聚化相關(guān)的單個(gè)或多個(gè)信號(hào)通路，在細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究中具有重要的應(yīng)用前景。

圖9 基于鄰近雜交介導(dǎo)催化發(fā)夾組裝的SERS探針用于膜蛋白二聚化成像的示意圖［49］Fig.9 Schematic diagram of membrane protein dimerization imaging based on proximity hybridization mediated catalytic hairpin assembly［49］

2023 年，南京師范大學(xué)王琛教授課題組開發(fā)了一種厚度可調(diào)的核殼結(jié)構(gòu)Au@MOF 納米探針，在Au納米顆粒上構(gòu)建的Cu（Ⅱ）苯-1，3，5-三羧酸鹽（Cu-BTC）多孔殼能夠有效負(fù)載拉曼信號(hào)分子，通過(guò)在納米探針表面修飾抗體即可用于膜蛋白識(shí)別。該納米探針具有良好的特異性和穩(wěn)定性，可用于癌細(xì)胞表面蛋白質(zhì)表達(dá)水平的精確成像［50］。SERS 的增強(qiáng)效果主要取決于兩個(gè)因素，其中電磁機(jī)制（EM）增強(qiáng)起主要作用，化學(xué)機(jī)制（CM）增強(qiáng)起次要作用。EM是指Ag、Au、Cu等貴金屬納米結(jié)構(gòu)在特定波長(zhǎng)下表現(xiàn)出局域表面等離子體共振，當(dāng)探針?lè)肿优c貴金屬納米結(jié)構(gòu)直接接觸時(shí)，分子振動(dòng)的弱拉曼信號(hào)得到顯著改善。EM 已被廣泛用于拉曼信號(hào)增強(qiáng)。CM 是指電子從半導(dǎo)體納米結(jié)構(gòu)的費(fèi)米能級(jí)到分析物最高占據(jù)分子軌道的轉(zhuǎn)移可以顯著提高拉曼信號(hào)的強(qiáng)度。該研究中，Cu-BTC 與拉曼報(bào)告分子之間的分子相互作用除EM 外，還有獨(dú)特的CM增強(qiáng)。Cu-BTC 殼還可以有效提高Au 納米顆粒在復(fù)雜生物環(huán)境中的分散性和穩(wěn)定性。在激光照射下，Cu-BTC 和拉曼信號(hào)分子之間的電子轉(zhuǎn)移可以實(shí)現(xiàn)額外的化學(xué)SERS增強(qiáng)。該團(tuán)隊(duì)將MCF-7 細(xì)胞與3 種SERS 納米探針（摩爾比為1∶1∶1）共孵育，3 種類型納米探針特征峰相對(duì)應(yīng)的拉曼信號(hào)同時(shí)存在于細(xì)胞中且分布不同（圖10）。這些高性能SERS 納米探針被成功應(yīng)用于細(xì)胞表面αvβ3、HER1 和HER2 蛋白的同時(shí)和特異性成像，展示了它們?cè)诙喟悬c(diǎn)檢測(cè)和SERS多通道成像方面的潛力。

圖10 基于EM/CM增強(qiáng)的SERS探針用于癌細(xì)胞表面多種蛋白的成像示意圖［50］Fig.10 Schematic diagram of EM/CM-enhanced SERS probes for multiplexed imaging membrane proteins［50］

5 總結(jié)與展望

膜蛋白在生命活動(dòng)中發(fā)揮了重要作用，是基礎(chǔ)生命科學(xué)研究和疾病診斷治療中至關(guān)重要的靶標(biāo)分子。近年來(lái)，研究人員發(fā)展的多種成像方法實(shí)現(xiàn)了膜蛋白表達(dá)量、空間分布、組織結(jié)構(gòu)的原位分析，對(duì)揭示膜蛋白的作用機(jī)制、發(fā)展有效的疾病診療方法等具有重要意義。本文主要介紹了熒光成像、電化學(xué)發(fā)光成像、磁共振成像和表面增強(qiáng)拉曼散射成像在膜蛋白原位分析中的應(yīng)用。熒光成像靈敏度高、技術(shù)成熟、成本低，在膜蛋白成像中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是近年來(lái)超分辨熒光成像技術(shù)的發(fā)展大大提高了膜蛋白空間分布和組織結(jié)構(gòu)成像的精確度。然而熒光成像也面臨探針光漂白、自發(fā)熒光干擾、難以進(jìn)行多種膜蛋白同時(shí)成像等問(wèn)題的困擾。電化學(xué)發(fā)光無(wú)需激發(fā)光源，光學(xué)背景干擾小，然而大多數(shù)電化學(xué)發(fā)光分子信號(hào)較弱，一定程度上限制了電化學(xué)發(fā)光成像的靈敏度。核磁共振技術(shù)近幾年也被用于膜蛋白成像，具有空間分辨率高等優(yōu)勢(shì)，其在膜蛋白成像中的應(yīng)用仍處于起步階段。表面增強(qiáng)拉曼散射的突出特點(diǎn)是可實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)蛋白的同時(shí)分析，然而貴金屬納米結(jié)構(gòu)固有的尺寸會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白的成像精度造成干擾。

雖然研究者開發(fā)了多種膜蛋白成像技術(shù)，但當(dāng)前膜蛋白成像研究仍然存在一定的挑戰(zhàn)：（1）目前的成像技術(shù)往往只能進(jìn)行膜蛋白的半定量分析，需要提高膜蛋白定量的準(zhǔn)確性；（2）抗體、核酸適體、蛋白質(zhì)和納米探針的尺寸會(huì)影響膜蛋白的定位和成像精度；（3）成像探針與膜蛋白結(jié)合后可能會(huì)影響膜蛋白的空間分布和組織結(jié)構(gòu)。未來(lái)單分子定位超分辨成像技術(shù)、無(wú)標(biāo)記成像技術(shù)等的快速發(fā)展有望解決上述問(wèn)題，為膜蛋白的原位、定量、高靈敏、高分辨率成像帶來(lái)新的機(jī)遇。