潘宇炯，何志高，陳石秀，周 桂，周 昕，郁 超 （上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院, 上海 200032）

性腺功能減退癥是一種由多種原因引起的睪酮水平低于健康青年男子正常范圍的疾病，臨床癥狀為焦躁不安、健忘出汗、性功能減退等。從流行病學(xué)分析，該病在肥胖和糖尿病人群中發(fā)病較多；其次，多發(fā)病于中老年男性患者，也稱(chēng)遲發(fā)性性腺功能減退癥（LOH）[1]。目前，西醫(yī)治療男性肥胖和LOH 多以外源性和內(nèi)源性補(bǔ)充睪酮為主，治療手法單一，且存在諸多的爭(zhēng)議。例如，在臨床中，對(duì)于LOH 癥狀中失眠、潮熱、健忘、注意力不集中等精神心理癥狀，單純用睪酮補(bǔ)充治療（TST），癥狀改善不顯著[2-5]。中醫(yī)治療則根據(jù)患者在TST 過(guò)程中所表現(xiàn)的不同證候采用不同的治療方法，如心功能不全患者以補(bǔ)腎為主，情志精神患者以疏肝為主，生理體能欠佳者以健脾、補(bǔ)益為主等不同的治療方法[5]。

杞貞滋陰合劑（滬藥制備字Z20210006000），是上海市著名中醫(yī)周智恒教授的經(jīng)驗(yàn)方。該方中，君藥是熟地黃、黃芪，起滋陰補(bǔ)腎、益氣培元之功效；臣藥是枸杞子、女貞子、山茱萸，起補(bǔ)腎、澀精、固腎之功效；佐藥為沙苑子、當(dāng)歸，起益精養(yǎng)血之功效；鎖陽(yáng)陽(yáng)中求陰為使藥。全方共奏滋陰補(bǔ)腎、益氣生精之功效。前期臨床實(shí)驗(yàn)證明，杞貞滋陰合劑可以有效改善LOH 患者體能不濟(jì)、血管舒縮和睪酮水平低下等癥狀[6-7]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)“藥物-基因-靶點(diǎn)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)藥物作用機(jī)制的學(xué)科[8]。分子對(duì)接是通過(guò)受體和藥物分子之間的相互作用來(lái)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的方法。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，對(duì)杞貞滋陰合劑的作用機(jī)制進(jìn)行研究，以期為該制劑的后期開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 杞貞滋陰合劑化學(xué)成分檢索的整理與篩選

在中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMID）[9]、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）[10]、藥物成分靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)（HIT）[11]和文獻(xiàn)中檢索杞貞滋陰合劑的相關(guān)化學(xué)成分，再在TCMID，TCMSP，HIT，STITCH數(shù)據(jù)庫(kù)中查找有效活性成分的靶點(diǎn)，取STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)中化合物靶標(biāo)關(guān)聯(lián)度400 以上的靶標(biāo)[12]，并使用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因模塊對(duì)生物靶標(biāo)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，建立相關(guān)的化學(xué)成分靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 類(lèi)藥性的初步篩選

將化合物的物理化學(xué)特征與上市藥物特征進(jìn)行比較，采用Bickerton 等提出的有效的類(lèi)藥性評(píng)估指標(biāo)（quantitative estimate of druglikeness，QED）評(píng)估化學(xué)成分的類(lèi)藥性[13]。

參考DRUGBANK 上市藥物QED 值，選擇0.3為閾值篩選化合物。

1.3 基于二項(xiàng)分布算法的靶標(biāo)及化學(xué)成分的二次篩選

采用基于二項(xiàng)分布的富集評(píng)分算法來(lái)篩選核心方的作用靶標(biāo)[14]。

當(dāng)P<0.01 時(shí)，表明該靶標(biāo)基因被至少k個(gè)活性化合物同時(shí)作用是小概率事件，則該靶標(biāo)基因是核心方的主要作用靶標(biāo)基因，并將含有主要作用靶標(biāo)基因的化合物作為主要作用化合物。

1.4 疾病靶點(diǎn)篩選

在GENECARD 數(shù)據(jù)庫(kù)[15]的Malacard 模塊中查找“性腺功能減退癥”的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)，以得分雙倍中位數(shù)為篩選條件，在DisGeNet 數(shù)據(jù)庫(kù)查找“性腺功能減退癥疾病”的靶點(diǎn)數(shù)據(jù)。合并以上兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選結(jié)果，并刪除重復(fù)靶標(biāo)。最后，使用韋恩圖確定杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的主要靶標(biāo)，并使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)分析。

1.5 生物功能富集分析

將得到的97 個(gè)疾病靶標(biāo)進(jìn)行富集分析，其中，通路信息來(lái)自KEGG 通路數(shù)據(jù)庫(kù)[16]，基因本體GO富集分析信息數(shù)據(jù)來(lái)源于Gene Ontology 數(shù)據(jù)庫(kù)，再應(yīng)用超幾何分布模型評(píng)估靶標(biāo)基因群是否與特定的GO 及生物通路顯著關(guān)聯(lián)：

經(jīng)過(guò)錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（False discovery rate, FDR）[17]法調(diào)整的P值，反映了杞貞滋陰合劑靶標(biāo)或者疾病靶標(biāo)與通路或GO 的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度，本項(xiàng)目經(jīng)調(diào)整后的P值，以小于0.01認(rèn)為關(guān)聯(lián)顯著。

1.6 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

利用Cytoscape 軟件的插件評(píng)估篩選核心靶標(biāo)，組成核心網(wǎng)絡(luò)，評(píng)估杞貞滋陰合劑疾病KEGG關(guān)聯(lián)條目的關(guān)系。所有圖片中形狀大小、顏色深淺均以度值排序。

1.7 分子對(duì)接

取度值較高的核心靶點(diǎn)，導(dǎo)入PDB（https://www.pdbus.org/），篩選條件以X-RAY 下Resolution值小為首選標(biāo)準(zhǔn)，下載PDB 文件，使用PYMOL 軟件，去水、去配體后備用；從PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)下載活性成分，運(yùn)用AutoDock-Tools 軟件對(duì)受體蛋白及配體進(jìn)行加氫、平衡電荷等操作后，對(duì)處理好的活性化合物與靶蛋白進(jìn)行對(duì)接，并進(jìn)行能量計(jì)算，最終運(yùn)用PYMOL 軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 杞貞滋陰合劑活性成分和靶標(biāo)的篩選

通過(guò)TCMSP、TCMID、HIT 數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索獲得495 個(gè)活性化合物；然后在STITCH 數(shù)據(jù)庫(kù)中，篩選靶標(biāo)關(guān)聯(lián)度400 以上的靶標(biāo)，獲得靶標(biāo)7 627 個(gè)；再通過(guò)類(lèi)藥性分析，共得到246 個(gè)滿(mǎn)足類(lèi)藥性成分的化合物；并使用二項(xiàng)分布算法篩選核心方的作用靶標(biāo)，篩選得到701 個(gè)成分靶標(biāo)和213 個(gè)主要作用化合物。

通過(guò)GENECARD 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到1 051 個(gè)相關(guān)靶標(biāo)，通過(guò)DisGeNet 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選到305 個(gè)相關(guān)靶標(biāo)，合并刪除重復(fù)疾病靶標(biāo)后，共獲得1 085 個(gè)與性腺功能減退癥相關(guān)的疾病靶標(biāo)基因。結(jié)合杞貞滋陰合劑的701 個(gè)成分靶標(biāo)，使用韋恩圖確定杞貞滋陰合劑的96 個(gè)疾病靶標(biāo)和148 種活性化合物，見(jiàn)表1。

表1 杞貞滋陰合劑的主要有效活性成分

2.2 杞貞滋陰合劑活性成分和靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)件圖

利用Cytoscape 軟件，以杞貞滋陰合劑的96 個(gè)疾病靶標(biāo)和148 種活性化合物，建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中，度值較高的化合物有棕櫚油、乙醇、槲皮素、木犀草素、山柰酚、果糖、硬脂酸等，見(jiàn)圖1。

2.3 杞貞滋陰合劑靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)件圖

通過(guò)STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Cytoscape 軟件，以疾病為靶標(biāo)進(jìn)行蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，圖中共有96 個(gè)節(jié)點(diǎn)，1 132 條邊，其中，度值排名前10 的靶標(biāo)是血清白蛋白（ALB）、INS、阿黑皮素原（POMC）、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6、FOS、ESR1，見(jiàn)圖2。

圖2 杞貞滋陰合劑疾病靶標(biāo)蛋白PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO 富集分析

對(duì)杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的靶標(biāo)基因進(jìn)行GO 富集分析，以P值小于0.01 為關(guān)聯(lián)顯著,以此進(jìn)行篩選，生物過(guò)程（BP）有1 792 條、細(xì)胞組件（CC）有31條、分子功能（MF）有79 條，并取P值前15 條的BP、CC、MF 分別制得條形圖。其中，MF 主要集中在受體激動(dòng)劑活性、激素活性、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性、G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等；CC 主要集中在分泌顆粒腔、細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合囊泡腔、囊泡腔、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔等；BP 主要集中在對(duì)肽類(lèi)激素的反應(yīng)、多細(xì)胞生物穩(wěn)態(tài)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)水平的反應(yīng)等，見(jiàn)圖3。

圖3 疾病靶點(diǎn)GO 富集分析(前10)

2.5 KEGG 富集分析

對(duì)杞貞滋陰合劑治療性腺功能減退癥的靶標(biāo)基因進(jìn)行GO 富集分析，以P值小于0.01 為關(guān)聯(lián)顯著,并以此進(jìn)行篩選，結(jié)果KEGG 信號(hào)通路的富集分析報(bào)告中，復(fù)方靶標(biāo)與性腺功能減退癥相關(guān)的有132 條信號(hào)通路，取P值前15 條信號(hào)通路，制得氣泡圖和核心網(wǎng)絡(luò)與前15 條通路的關(guān)系圖見(jiàn)圖4。

圖4 疾病靶點(diǎn)KEGG 富集分析圖

2.6 分子對(duì)接

根據(jù)“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析得到排名前17 的核心活性成分，剔除其中成藥性較差的，例如，乙醇、棕櫚油、果糖、硬脂酸等，最后選取槲皮素、山柰酚、木犀草素作為核心活性成分；從度值排名前8 的核心靶點(diǎn)中，剔除與槲皮素、山柰酚、木犀草素?zé)o密切度的ALB 和POMC，最后選取INS、TNF、AKT1、LEP、IGF1、IL-6 六個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。其中，對(duì)接得分（kcal/mol 值）絕對(duì)值>4.25代表結(jié)合活性一般，絕對(duì)值>5.0 代表結(jié)合活性較好，絕對(duì)值>7.0 代表結(jié)合活性較強(qiáng)[18]。由結(jié)果可知，主要核心靶點(diǎn)與核心化合物的結(jié)合值都超過(guò)了5.0，核心靶點(diǎn)TNF 和LEP 的結(jié)合值整體高于其他靶點(diǎn)，其中，LEP 與山柰酚的結(jié)合力較強(qiáng)，見(jiàn)表2、圖5。

圖5 部分蛋白和活性成分分子對(duì)接圖

表2 成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果

3 討論

睪酮已被證明是維持代謝穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子?，F(xiàn)代研究證明，睪酮與胰島素抵抗、血脂異常、炎癥細(xì)胞因子合成增加等因素密切相關(guān)[19-23]。因此，臨床治療LOH 除了補(bǔ)充睪酮，多以控制體重、改善胰島素抵抗的方法達(dá)到改善患者的血清睪酮水平和性功能的目的。

本次研究，通過(guò)TCMSP、TCMID、HIT 等數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，并進(jìn)行類(lèi)藥性分析和二項(xiàng)分布算法篩選，共得到701 個(gè)成分靶標(biāo)和213 個(gè)主要作用化合物，再通過(guò)建立“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)其中與疾病關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的化合物是槲皮素、山柰酚、木犀草素等，主要作用的疾病靶點(diǎn)是AKT1、IL-6、IGF1、LEP 等。有研究表明，槲皮素可刺激cAMP 依賴(lài)性急性調(diào)節(jié)（Star）啟動(dòng)子的激活，增加Leydig 細(xì)胞生成睪酮[24]；山柰酚可以改善雄性小鼠生殖器官重量、精子質(zhì)量，減少睪丸組織損傷[25]；木犀草素能激活Star 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增加睪酮的產(chǎn)生[26]。又有研究表明，IL-6 炎癥細(xì)胞因子被釋放到血液中，可能抑制Leydig 細(xì)胞的發(fā)育[27]；AKT1 蛋白可通過(guò)磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的睪丸功能，而IGF1 可刺激多種AKT1 的活性[28]；LEP 可通過(guò)下丘腦PI3K/AKT 通路刺激GnRH 合成與釋放，從而影響血清睪酮水平[29]。

通過(guò)KEGG 富集分析共得到132 條通路，并篩選出P值排名前15 的通路，包括FOXO 通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路、胰島素抵抗、HIF-1 通路等。其中，缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF1）是參與細(xì)胞缺氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，并且在Leydig 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，而Leydig 細(xì)胞生成睪酮是雄性睪酮的主要來(lái)源，當(dāng)HIF1 上調(diào)時(shí)，睪酮水平顯著降低[30]。在FOXO 通路中，STAT3、IL-6、AKT1、IGF-1 廣泛參與了FOXO 的激活，F(xiàn)OXO 蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)胰島素或IGF-1 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的增殖[31]。綜上所述，杞貞滋陰合劑治療LOH 的主要活性成分和作用靶點(diǎn)主要涉及Leydig 細(xì)胞睪酮合成酶表達(dá)和改善胰島素抵抗。其中，Leydig 睪丸間質(zhì)細(xì)胞的功能和數(shù)量下降導(dǎo)致的雄激素缺乏是LOH的主要核心機(jī)制[32]。有研究表明，胰島素可通過(guò)刺激下丘腦促性腺激素釋放激素（GnRH）的產(chǎn)生和分泌，進(jìn)而刺激黃體生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）的生物合成，而LH 和FSH 是睪丸功能的重要激素調(diào)節(jié)因子[33]。中醫(yī)將糖尿病前期歸于“消渴” 等范疇?！督饏T要略》中消渴病篇提到：“男子消渴，小便反多，以飲一斗，小便一斗，腎氣丸主之?！蹦I陽(yáng)不足，則無(wú)力蒸騰氣化水液[34]，而杞貞滋陰合劑的創(chuàng)始者周智恒教授認(rèn)為L(zhǎng)OH 的病因正是腎氣衰、真水枯竭，該方正是有滋陰補(bǔ)腎、益氣生精之功效[6]。眾所周知，胰島素抵抗正是糖尿病的病理基礎(chǔ)。由上可見(jiàn)，杞貞滋陰合劑的中醫(yī)治療LOH的理論和胰島素抵抗的中醫(yī)治療理論相一致，也為本研究指出的杞貞滋陰合劑治療LOH 多涉及改善胰島素抵抗提供了理論依據(jù)。本研究為杞貞滋陰合劑治療性腺機(jī)能減退癥探索了新的防治思路，但由于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)來(lái)自于多平臺(tái)的數(shù)據(jù)收錄和總結(jié)，結(jié)果還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究做進(jìn)一步的驗(yàn)證，從而完善杞貞滋陰合劑治療LOH的作用機(jī)制。