賴騰強(qiáng)，謝 娜，吳伯文，盛子煊，林文輝

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福州 350007；2.武平縣農(nóng)鑫食用菌專業(yè)合作社，福建 龍巖 364309）

靈芝（Ganodermn lucidum）為我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，也是我國(guó)目前研究和開(kāi)發(fā)較多的藥用菌［1］。靈芝含有多糖類、三萜類、核苷類、生物堿、氨基酸及微量元素等多種活性物質(zhì)［2］，其中多糖和三萜類化合物是靈芝的主要活性成分。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有扶正固本，防治呼吸道疾病，調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)心腦血管，調(diào)節(jié)血糖，減輕、延緩糖尿病并發(fā)癥，提高免疫力，輔助治療腫瘤等功效。

枇杷葉[Eriobotrya japonica(Thunb.) Lindl.]是傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)常用中草藥，藥用歷史悠久［3］。目前從枇杷葉中分離的化學(xué)成分主要有黃酮類、三萜酸類、倍半萜類、多酚類等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，枇杷葉具有抗炎、止咳作用，臨床常用于治療急慢性呼吸道等疾?。?］。此外，枇杷葉還有抗腫瘤、抗病毒、降血糖、保肝利膽、清除氧自由基、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用。

靈芝有2 000 多年的食用歷史，有延年益壽的功效，但我國(guó)食用過(guò)靈芝的人群還不到百分之一，長(zhǎng)期食用的人更少，且以老年人養(yǎng)生為主。我國(guó)枇杷葉資源十分豐富，但沒(méi)有得到有效利用，甚至成為植物垃圾，對(duì)環(huán)境造成污染。目前關(guān)于枇杷葉、靈芝的加工利用研究多集中在藥用方面，而在養(yǎng)生食品方面的研究較少。2014年枇杷葉被批準(zhǔn)為新食品原料［4］，2019年對(duì)靈芝開(kāi)展藥食同源物質(zhì)管理試點(diǎn)工作［5］，極大地推動(dòng)了枇杷葉、靈芝在養(yǎng)生食品方面的發(fā)展，相關(guān)新產(chǎn)品層出不窮，功能性開(kāi)發(fā)方面也得到拓展。本研究以枇杷葉為主料，利用靈芝菌來(lái)發(fā)酵枇杷葉，通過(guò)發(fā)酵、加工技術(shù)將發(fā)酵后的枇杷葉制成養(yǎng)生茶，為枇杷葉的深加工提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 原料

發(fā)酵原料：干枇杷葉（條狀）、PDA 培養(yǎng)基、小米（帶殼）、玉米粉、甜葉菊（粉狀）等。

靈芝菌種：共10 個(gè)菌株，詳見(jiàn)表1。

表1 菌株編號(hào)與來(lái)源

1.2 研制工藝

1.2.1 工藝流程

靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶工藝流程如圖1 所示，主要包含靈芝母種制備、靈芝原種制備、枇杷葉發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵茶處理工藝、發(fā)酵茶檢驗(yàn)方法、發(fā)酵茶成品包裝等流程。

圖1 靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶工藝流程

1.2.2 工藝說(shuō)明

（1）靈芝母種制備

采用PDA 培養(yǎng)基，蒸餾水1 000 mL，pH 值自然。1.8 cm×18 cm 試管做容器，用試管塞封口，制作試管斜面，斜面長(zhǎng)8 cm。采用高壓滅菌，壓力0.11 MPa、溫度121℃，滅菌30 min。在超凈工作臺(tái)內(nèi)按無(wú)菌要求接種，取0.5 cm×0.5 cm 母種菌塊接種在試管斜面中間，在溫度25℃培養(yǎng)箱中暗光培養(yǎng)，菌絲長(zhǎng)滿斜面（圖2a）即成母種，放置于冰箱低溫保藏或用于接種原種。

（2）靈芝原種制備

采用小米作為基質(zhì)，料水比為1∶1.2，pH 值自然。用350 mL 的廣口組培瓶做容器，裝入量為料高2～3 cm，按料水比加水，用塑料蓋封口。滅菌、接種、培養(yǎng)同母種制備；取1.5 cm×1.5 cm 母種菌塊接種在組培瓶料面中間，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；菌絲長(zhǎng)滿（圖2b）后即成原種，放置于冰箱低溫保藏或用于接種枇杷葉。

（3）枇杷葉發(fā)酵培養(yǎng)

選用無(wú)病蟲(chóng)害的成熟枇杷葉，按干葉∶水=1∶1.5 加水混合，pH 值自然。充分均勻吸收水分后用17 cm×33 cm×0.05 cm 的聚丙烯塑料袋裝料，料高12 cm，用套環(huán)封口。滅菌、接種、培養(yǎng)同母種制備；將小米原種攪碎，取小米原種接種到枇杷葉培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（圖2c）；待菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基時(shí)終止發(fā)酵（圖2d）。

（4）發(fā)酵茶處理工藝

挑選菌絲濃白、無(wú)污染的發(fā)酵茶（圖2e），取出菌質(zhì)攤開(kāi)在搪瓷盤中（圖2f）在110～120℃溫度下烘至六七成干，即發(fā)酵茶不黏手時(shí)進(jìn)行初包揉；再于90～100℃溫度下烘1.5 h，烘至發(fā)酵茶有微感刺手時(shí)進(jìn)行復(fù)包揉處理。采用“低溫慢烤”，70～80℃溫度下烘干，稍經(jīng)攤涼即可（圖2g）。

（5）發(fā)酵茶檢驗(yàn)方法

根據(jù)GB/T 5009.57—2003茶葉衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法對(duì)靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶進(jìn)行衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)。

（6）發(fā)酵茶成品包裝

經(jīng)衛(wèi)生檢驗(yàn)后，可直接用茶葉袋包裝成茶，或與金線蓮、山楂、紅棗、枸杞等復(fù)配成養(yǎng)生茶（圖2h），也可粉碎加工制作成袋泡茶。

1.3 研制方法

1.3.1 靈芝菌株篩選

將10 個(gè)靈芝菌株接種到PDA 培養(yǎng)基上，在25℃的培養(yǎng)箱中暗光培養(yǎng)，每處理重復(fù)5次。觀測(cè)各菌株的萌發(fā)時(shí)間、滿管時(shí)間、菌絲長(zhǎng)速、菌絲長(zhǎng)勢(shì)等，以萌發(fā)早、滿管快、長(zhǎng)速快、長(zhǎng)勢(shì)好的菌株作為發(fā)酵菌株。

1.3.2 枇杷葉配方篩選

為盡可能保持枇杷葉的風(fēng)味，只適當(dāng)添加少量的其他輔料，設(shè)計(jì)3 個(gè)配方：配方A，枇杷葉100% ；配方B，枇杷葉99%+玉米粉1%；配方C，枇杷葉99%+甜葉菊1%。

將小米原種接種到枇杷葉培養(yǎng)基上，在25℃的培養(yǎng)箱中暗光培養(yǎng)，每處理重復(fù)5 次。當(dāng)菌絲蓋面并向下深入2～3 cm，畫(huà)線做起始線，當(dāng)菌絲即將滿袋時(shí)，畫(huà)線做終止線；用直尺測(cè)量起始線與終止線之間的距離，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。觀測(cè)各菌株的萌發(fā)時(shí)間、蓋面時(shí)間、滿袋時(shí)間、菌絲長(zhǎng)勢(shì)等。

對(duì)經(jīng)1.2.2（4）處理工藝得到的靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶，取2 g 用100 mL 的開(kāi)水沖泡，經(jīng)3 min 后，從色澤、香氣、滋味、雜質(zhì)等方面進(jìn)行鑒評(píng)。

1.3.3 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

靈芝菌絲長(zhǎng)滿枇杷葉培養(yǎng)基時(shí)終止發(fā)酵，取出菌質(zhì)后在60℃恒溫下烘干，粉碎過(guò)30 目篩；同批次未發(fā)酵的枇杷葉粉碎過(guò)30 目篩，為待測(cè)樣品。

測(cè)定枇杷葉發(fā)酵前后（配方A）的多糖、三萜酸、總蛋白、游離氨基酸含量。多糖測(cè)定以葡萄糖為對(duì)照品，采用蒽酮-硫酸法；三萜酸測(cè)定以熊果酸為對(duì)照品，采用香草醛-冰醋酸法；總蛋白測(cè)定采用凱氏定氮法；游離氨基酸測(cè)定采用茚三酮顯色法。

1.3.4 質(zhì)量安全檢測(cè)

隨機(jī)抽取發(fā)酵后（配方A）的枇杷葉，對(duì)重金屬指標(biāo)、農(nóng)殘含量進(jìn)行質(zhì)量安全檢測(cè)，檢測(cè)項(xiàng)目及檢測(cè)依據(jù)［6-11］見(jiàn)表2。

表2 重金屬指標(biāo)、農(nóng)殘含量檢測(cè)項(xiàng)目及依據(jù)

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌株篩選結(jié)果

從表3 可知，在萌發(fā)時(shí)間上，LZ04、LZ10 為1.5 d，其余均只需1 d，差異不顯著。在滿管時(shí)間上，菌株之間存在一定的差異性：LZ07 最快，只需6 d；其次是LZ09、LZ02、LZ08，需6.5～7.0 d；LZ04 最慢，需要11 d。在菌絲生長(zhǎng)速度上，菌株之間存在一定的差異性：LZ07 最快，達(dá)0.772 cm/d；其次是LZ09，為0.717 cm/d；LZ04最慢，只有0.392 cm/d；LZ07、LZ09 菌絲生長(zhǎng)速度較其他菌株差異極顯著。在菌絲長(zhǎng)勢(shì)、外觀上：LZ07、LZ09 長(zhǎng)勢(shì)最好，菌絲潔白濃密；其次是LZ01、LZ02、LZ03、LZ06、LZ08，菌絲潔白密集；LZ04、LZ05、LZ10 較差，菌絲潔白均勻。LZ07、LZ09 表現(xiàn)出萌發(fā)早、滿管快，菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲長(zhǎng)勢(shì)好、潔白濃密，可作為發(fā)酵枇杷葉的靈芝菌株。

表3 不同靈芝菌株在母種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

2.2 枇杷葉配方篩選結(jié)果

從表4 可知，2 個(gè)靈芝菌株在3 個(gè)枇杷葉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。在萌發(fā)時(shí)間、蓋面、滿袋天數(shù)上，相差不大，差異不顯著。在菌絲生長(zhǎng)速度方面，從菌株上看，LZ07 生長(zhǎng)速度較LZ09 快，在配方A、B、C 上的生長(zhǎng)速度分別快0.05、0.045、0.042 cm/d；從配方上看，2 個(gè)靈芝菌株均表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度配方B＞配方C＞配方A，但差異不顯著。在菌絲長(zhǎng)勢(shì)、外觀上，2 個(gè)靈芝菌株均表現(xiàn)出配方B、配方C長(zhǎng)勢(shì)好于配方A，菌絲潔白濃密。配方B、配方C生長(zhǎng)速度、長(zhǎng)勢(shì)都好于配方A，說(shuō)明添加玉米粉、甜葉菊能夠促進(jìn)靈芝菌絲的生長(zhǎng)。

表4 不同靈芝菌株在枇杷葉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況

從色澤、香氣、滋味、雜質(zhì)等方面進(jìn)行鑒評(píng)，2個(gè)靈芝菌株分別利用3 個(gè)枇杷葉配方發(fā)酵出的香氣、雜質(zhì)無(wú)差別，均表現(xiàn)出香氣清淡，帶點(diǎn)甜香，無(wú)絮狀沉淀物，在色澤、滋味方面有所差別，配方A、C 湯色黃褐色，配方B 湯色較淺，應(yīng)是添加玉米粉影響致湯色渾濁；配方C 有淡淡的甜味，配方A、B 甜味較弱，應(yīng)是添加甜葉菊增加了甜味，多次沖泡后滋味明顯減淡。

2.3 營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果

從表5 可知，經(jīng)靈芝菌發(fā)酵后，2 個(gè)靈芝菌株發(fā)酵后的枇杷葉中多糖、總蛋白、游離氨基酸含量均有所增加，但三萜酸含量有所下降。從營(yíng)養(yǎng)上看，發(fā)酵后的枇杷葉中多糖分別增加18.48%、30.52%，總蛋白分別增加45.94%、51.53%，游離氨基酸分別增加66.81%、61.38%，三萜酸分別下降12.24%、16.78%。從菌株上看，LZ07、LZ09 發(fā)酵后的枇杷葉中營(yíng)養(yǎng)成分含量有所差別，但含量此消彼長(zhǎng)，無(wú)法判斷其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低。

表5 發(fā)酵前后枇杷葉的營(yíng)養(yǎng)成分比較 單位：%

2.4 質(zhì)量安全檢測(cè)結(jié)果

從表6 結(jié)果可知，鉛（0.062 mg/kg）、鎘（0.021 mg/kg）、總砷（0.046 mg/kg）、總汞（0.004 mg/kg）含量均小于檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)，二氧化硫、百菌清、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯、樂(lè)果、咪鮮胺含量小于定量限/檢出限或未檢出標(biāo)準(zhǔn)，表明發(fā)酵后的枇杷葉重金屬、農(nóng)殘含量均符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，處于安全的含量水平。

表6 發(fā)酵后的枇杷葉重金屬指標(biāo)、農(nóng)殘含量檢測(cè)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

靈芝菌株篩選研究表明，菌株之間的菌絲生長(zhǎng)速度存在一定的差異性；LZ07、LZ09（美芝、大紅芝）菌絲生長(zhǎng)速度較其他菌株差異極顯著，且表現(xiàn)出萌發(fā)早、滿管快，菌絲長(zhǎng)勢(shì)好、潔白濃密，可作為發(fā)酵枇杷葉的靈芝菌株。

枇杷葉配方篩選研究表明，靈芝菌株LZ07 菌絲生長(zhǎng)速度較LZ09 快；生長(zhǎng)速度為配方B＞配方C＞配方A，但差異不顯著；添加玉米粉能夠促進(jìn)靈芝菌絲的生長(zhǎng)，添加少量的甜葉菊有助于提升靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶的口感。陳艷琦等［12］研究添加玉米粉對(duì)玉木耳菌包質(zhì)量、產(chǎn)量和營(yíng)養(yǎng)成分的影響，結(jié)果表明添加玉米粉對(duì)菌絲恢復(fù)能力、菌包質(zhì)量均有所改善，產(chǎn)量有所增加，營(yíng)養(yǎng)成分含量有所提高。玉米粉、甜葉菊的添加量或添加其他輔料對(duì)靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶品質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究。

枇杷葉發(fā)酵前后的營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果表明，靈芝菌株LZ07、LZ09 發(fā)酵后的枇杷葉中多糖、總蛋白、游離氨基酸含量均有所增加，但三萜酸含量下降，這與張平等［13］的研究結(jié)果一致。不同靈芝菌株發(fā)酵后的枇杷葉營(yíng)養(yǎng)成分有所差別，存在此消彼長(zhǎng)的情況。料水比、滅菌時(shí)間、發(fā)酵時(shí)間等是否對(duì)發(fā)酵茶的營(yíng)養(yǎng)成分有影響，有待進(jìn)一步探討。

對(duì)枇杷葉發(fā)酵后的質(zhì)量安全檢測(cè)研究表明，發(fā)酵后的枇杷葉重金屬、農(nóng)殘含量均符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，處于安全的含量水平，為確保靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶在正常飲用量下對(duì)人體的安全性，后續(xù)還需要進(jìn)行金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀式菌等致病菌，急性毒性、半數(shù)致死量（LD50）、骨髓細(xì)胞微核的檢測(cè)［14］。

目前將枇杷葉作為新食品原料的產(chǎn)品品類還比較少，主要集中在飲料和代用茶類，功能應(yīng)用上，對(duì)其功能的利用還比較粗糙，缺乏針對(duì)性［15］。枇杷葉價(jià)格低廉，且產(chǎn)地豐富，應(yīng)用前景廣闊。利用靈芝菌發(fā)酵枇杷葉制作養(yǎng)生茶，可開(kāi)拓枇杷葉在食品方面的市場(chǎng)，拓展枇杷葉的產(chǎn)業(yè)鏈。本研究只適當(dāng)添加了少量的玉米粉、甜葉菊作為輔料，以盡可能保持枇杷葉的風(fēng)味，靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶還可以在產(chǎn)品方面研發(fā)更多的品類。

發(fā)酵后的枇杷葉茶是枇杷葉與靈芝的有機(jī)結(jié)合，在營(yíng)養(yǎng)功效上有很好的互補(bǔ)性，有協(xié)同的養(yǎng)生功效。發(fā)酵后的枇杷葉茶有淡淡的枇杷葉香和靈芝的特殊菌香，開(kāi)水沖泡后茶湯色更濃郁，表明有較多的固形物析出。靈芝菌絲多糖、三萜和蛋白在提高免疫、抗腫瘤、抗衰老、保肝等方面有重要作用，較高含量的總游離氨基酸使得口感更美味潤(rùn)滑。靈芝菌發(fā)酵枇杷葉茶值得進(jìn)一步推廣，可為靈芝、枇杷葉的綜合利用提出一條新途徑。