解振強(qiáng)，許桓瑜，黃金霞，蔡善亞，李剛，趙鵬程*

（1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇句容 212400；2.揚(yáng)中市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)管委會(huì)，江蘇揚(yáng)中 212200）

葡萄作為重要的經(jīng)濟(jì)果樹在優(yōu)化農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)和促進(jìn)農(nóng)民增收等方面發(fā)揮了重要作用。然而，環(huán)境污染、灌溉和施肥不當(dāng)?shù)仍斐傻耐寥利}漬化嚴(yán)重降低了葡萄的產(chǎn)量和品質(zhì)，同時(shí)我國(guó)沿海灘涂等鹽堿地也制約著葡萄的推廣種植[1-2]。為了減少鹽堿造成的損失，除進(jìn)行土壤改良和耐鹽砧木嫁接外，挖掘耐鹽基因并通過(guò)基因工程育種已成為果樹遺傳改良中高效可行的手段。

MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，其中多數(shù)為R2R3型，而R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子又可聚類為25個(gè)亞類[3]。已有的研究表明，Subgroup I亞類成員通過(guò)多種通路廣泛參與了植物的脅迫響應(yīng)。Zhao等[4]發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，過(guò)表達(dá)小麥TaMYB31可促進(jìn)蠟質(zhì)合成及耐旱基因的表達(dá)，提高植株的耐旱性；擬南芥AtMYB30則可通過(guò)ROS通路及鈣信號(hào)通路參與鹽、氧化和高溫等脅迫信號(hào)的傳遞與正向調(diào)節(jié)[5-6]。而對(duì)AtMYB96的研究表明，其可經(jīng)由ABA信號(hào)通路正調(diào)控植株對(duì)干旱和冷脅迫的耐受性[7-8]。除作為正調(diào)節(jié)因子外，該亞類成員還可負(fù)調(diào)節(jié)植株的耐逆性，如Lyu等[9]對(duì)水稻OsMYB30的功能研究發(fā)現(xiàn)OsMYB30通過(guò)降低麥芽糖的含量負(fù)調(diào)控水稻的耐寒性。目前，從葡萄基因組中共鑒定到131個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子[10]。已有的功能研究表明，其參與調(diào)控了葡萄中原花青素、花青素和二苯乙烯等次生代謝物的合成。如過(guò)表達(dá)VvMYB4、VviMYB86和VvMYBC2L2可抑制植株體內(nèi)花青素的合成，其中VviMYB86還可促進(jìn)原花青素的合成[11-13]。也有研究表明，VvMYBA1和VvMYBA2通過(guò)調(diào)控花青素的生物合成控制葡萄的漿果顏色[14]。此外，Holl等[15]發(fā)現(xiàn)，在葡萄毛狀根中過(guò)表達(dá)VvMYBA14和VvMYBA15能夠顯著促進(jìn)白藜蘆醇前體物質(zhì)二苯乙烯的合成。然而，葡萄MYB轉(zhuǎn)錄因子參與耐逆調(diào)控的報(bào)道還較少。其中，過(guò)表達(dá)VvMYB6可提高轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性，耐鹽砧木‘1103P’中的VvMYB62正調(diào)控植株的耐鹽性[16-17]。而Zhang等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，將野生葡萄VaMYB44在擬南芥和葡萄愈傷組織中過(guò)表達(dá)則降低了耐寒性。

本研究以‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄中MYB轉(zhuǎn)錄因子Subgroup I亞類成員VvMYB30為對(duì)象，通過(guò)對(duì)其進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活活性和耐鹽性進(jìn)行分析，探究其在葡萄耐鹽響應(yīng)過(guò)程中的生物學(xué)功能，為葡萄的耐鹽分子育種提供候選基因資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料及處理

葡萄材料來(lái)自于江蘇省農(nóng)博園無(wú)土栽培的3年生歐美雜交種葡萄‘陽(yáng)光玫瑰’，正常生長(zhǎng)條件下，于初花期采集各組織器官樣品，并在果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期采集果實(shí)樣品，各樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。鹽脅迫處理：以當(dāng)年生扦插苗為試材，清洗后將其置于1/2 Hoagland培養(yǎng)液中培養(yǎng)1周，然后轉(zhuǎn)移至含200 mmol?L-1NaCl的培養(yǎng)液中進(jìn)行鹽處理，分別在處理0、6、12、24、36、48 h后采集相同位置的成熟葉片，液氮速凍后置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存。

本研究所用煙草材料為本氏煙（Nicotiana benthamiana），用于轉(zhuǎn)基因的擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Col-0。煙草、擬南芥及鹽處理葡萄培養(yǎng)溫度為24 ℃，光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 基因克隆及載體構(gòu)建

使用Spectrum植物總RNA試劑盒（Sigma-Aldrich）提取各樣品的總RNA，并通過(guò)Nanodrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific）和2%瓊脂糖凝膠檢測(cè)濃度及完整性。以RNA為模板，使用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit with gDNA wiper（Vazyme）試劑盒合成cDNA，稀釋50倍并分裝后置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存?；谝延衅咸鸦蚪M設(shè)計(jì)特異引物，以成熟葉片cDNA為模板擴(kuò)增VvMYB30的CDS序列，純化后克隆到pMD18-T載體中并送至通用生物進(jìn)行測(cè)序。依據(jù)CDS序列合成亞細(xì)胞定位引物和轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證引物，擴(kuò)增全長(zhǎng)序列，通過(guò)ClonExpress II One Step Cloning Kit（Vazyme）分別將其同源重組到pCAMBIA1305-GFP和pGreenII-62-SK-GAL4BD（pBD）載體上，獲得亞細(xì)胞定位載體35S::VvMYB30-GFP及效應(yīng)載體pBD-VvMYB30。

1.3 亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證

亞細(xì)胞定位方法：將分別含GFP及mCherry載體的農(nóng)桿菌振蕩培養(yǎng)至OD600≈0.8后離心，用侵染液（10 mmol?L-1MES、10 mmol?L-1MgCl2和200 μmol?L-1AS）重懸菌體至OD600≈0.2，放置2 h后，將不同侵染液等體積混合并注射入本氏煙草葉片，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d后，用激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號(hào)并拍照。

轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證方法：參考Wang等[19]的研究進(jìn)行，將構(gòu)建好的效應(yīng)載體組合報(bào)告載體轉(zhuǎn)入煙草葉片，共進(jìn)行6次生物學(xué)重復(fù)。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，參照雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Yeason）使用說(shuō)明，檢測(cè)螢火蟲螢光素酶及海腎螢光素酶報(bào)告基因的活性。將LUC/REN比值與對(duì)照組進(jìn)行歸一化處理，所產(chǎn)生的數(shù)值表示活性強(qiáng)弱。

1.4 熒光定量PCR分析

利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)VvMYB30的定量引物，以VvACTIN為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應(yīng)體系包括：2×SYBR Green Supermix 10 μL、上、下游引物各1 μL、稀釋后的cDNA8 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。利用2-ΔΔCT法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及耐鹽性鑒定

將35S::VvMYB30-GFP載體通過(guò)花序侵染法轉(zhuǎn)至擬南芥Col-0中，利用含25 mg?L-1潮霉素的1/2 MS抗性培養(yǎng)基以及PCR檢測(cè)擴(kuò)增目的基因的方法進(jìn)行逐代篩選，最終獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)RT-PCR鑒定VvMYB30在轉(zhuǎn)基因株系中是否轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測(cè)各株系中VvMYB30的表達(dá)量，從中選取表達(dá)量較高的株系用于耐鹽性鑒定。將消毒后的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥種子分別點(diǎn)播于含有0或125 mmol?L-1NaCl的1/2MS培養(yǎng)基上，4 ℃春化3 d，然后將其置于光照下培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)7 d內(nèi)的發(fā)芽情況，共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。萌發(fā)率（%）=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100。

將在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥分別移栽至方盆中，每盆9株。待植株生長(zhǎng)20 d后進(jìn)行鹽處理，處理方法為每隔3 d澆灌一次300 mmol?L-1NaCl溶液。處理7 d后統(tǒng)計(jì)植株存活率，共進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。存活率（%）=(處理后的存活株數(shù)/總株數(shù))×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 VvMYB30的克隆及生物信息分析

以‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄成熟葉片cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和BLAST分析，其與擬南芥AtMYB30具有較高的同源性，相似度為60.54%，故暫命名為VvMYB30。VvMYB30基因全長(zhǎng)984 bp，編碼327個(gè)氨基酸，其蛋白分子量為36.54 kDa，等電點(diǎn)為5.69，平均疏水指數(shù)（GRAVY）為-0.779，為親水性蛋白。

使用MEGA7.0軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建VvMYB30與擬南芥、甜橙、水稻等其他植物MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果發(fā)現(xiàn)VvMYB30與甜橙CsMYB30的親緣關(guān)系最近，相似度為64.75%，推測(cè)二者可能具有相近的生物學(xué)功能（圖1A）。序列比對(duì)結(jié)果顯示，VvMYB30與親緣關(guān)系較近的 MYB30蛋白的氨基酸相似度在56.98%～64.75%，不同植物MYB30蛋白間的氨基酸數(shù)量有較大差異，但在N端序列具有高度的保守性，均含有1個(gè)保守的R2R3結(jié)構(gòu)域（圖1B）。

圖1 VvMYB30及其同源蛋白的進(jìn)化樹（A）和多序列比對(duì)（B）分析Figure 1 Phylogenetic (A) and multiple amino acid sequence alignment (B) analysis of VvMYB30 and its homologs from diあerent plant species

表1 VvMYB30基因克隆及功能分析所用引物Table 1 Primer used for VvMYB30 gene cloning and functional analysis

2.2 VvMYB30的亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活分析

將35S::VvMYB30-GFP載體與細(xì)胞核標(biāo)簽載體（35S::AtHY5-mCherry）在本氏煙葉片中瞬時(shí)表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空GFP蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)，而VvMYB30-GFP融合蛋白主要分布在細(xì)胞核（如圖2A），表明VvMYB30定位于細(xì)胞核，屬于核蛋白。

圖2 VvMYB30的亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)錄激活分析Figure 2 Subcellular localization and transcriptional activation analysis of VvMYB30

通過(guò)雙熒光素酶試驗(yàn)確定VvMYB30在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄激活活性，將GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與VvMYB30融合表達(dá)獲得效應(yīng)載體；報(bào)告載體REN基因由35S驅(qū)動(dòng)，LUC基因由5×GAL4激活域序列驅(qū)動(dòng)（圖2B）。將效應(yīng)載體與報(bào)告載體在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)并測(cè)定雙熒光素酶活性，結(jié)果顯示pBDVvMYB30效應(yīng)載體的LUC/REN值顯著高于陰性對(duì)照，為對(duì)照的3.28倍（圖2C），表明VvMYB30具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.3 VvMYB30在葡萄組織中的表達(dá)分析

qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，VvMYB30在葡萄不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中呈高表達(dá)，約為根部表達(dá)量的7.06～10.12倍；其次是花和成熟葉片，分別為根部的4.20和4.35倍，而在根和莖中表達(dá)量較低（圖3A）。VvMYB30受高鹽脅迫，處理24 h后表達(dá)量達(dá)到最高，為對(duì)照的6.86倍，并且在48 h仍然保持在較高水平（圖3B），表明VvMYB30屬于鹽脅迫誘導(dǎo)基因。

圖3 VvMYB30基因在葡萄不同組織（A）及鹽脅迫（B）的表達(dá)分析Figure 3 Expression analysis of VvMYB30 in diあerent tissues(A) and salt stress (B) of 'Shine-Muscat' grape

2.4 過(guò)表達(dá)VvMYB30提高擬南芥的耐鹽性

利用花序侵染法將VvMYB30在擬南芥轉(zhuǎn)化，篩選共獲得5個(gè)純合株系，RT-PCR結(jié)果如圖4A。利用qRT-PCR檢測(cè)純合株系中VvMYB30的表達(dá)水平，從中挑選2個(gè)表達(dá)量較高的株系用于耐鹽性分析（圖4B）。

圖4 過(guò)表達(dá)VvMYB30擬南芥的分子鑒定Figure 4 Molecular identification of VvMYB30 ectopic expression lines in Arabidopsis

將野生型和2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的擬南芥種子置于含125 mmol?L-1NaCl的培養(yǎng)基上，每天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)情況。結(jié)果表明，在不含NaCl的培養(yǎng)基上，在同一天內(nèi)野生型和2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的萌發(fā)率均無(wú)顯著差異（圖5A），但在鹽脅迫處理后，2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的萌發(fā)率均顯著高于野生型（圖5B），表明在擬南芥中過(guò)表達(dá)VvMYB30可顯著促進(jìn)鹽脅迫下種子的萌發(fā)。為進(jìn)一步鑒定過(guò)表達(dá)VvMYB30擬南芥的耐鹽性，對(duì)生長(zhǎng)20 d的擬南芥植株進(jìn)行NaCl溶液澆灌，在7 d后統(tǒng)計(jì)存活率。結(jié)果如圖6所示，鹽脅迫處理后2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的存活率分別為40.74%和44.44%，均高于野生型。綜上結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)VvMYB30可顯著增強(qiáng)擬南芥的耐鹽性。

圖5 NaCl處理對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響Figure 5 Eあects of NaCl treatment on seed germination of Arabidopsis

圖6 NaCl處理對(duì)擬南芥幼苗存活率的影響Figure 6 Eあects of NaCl treatment on the survival rate of Arabidopsis seedlings

3 討論

土壤鹽漬化嚴(yán)重影響著葡萄的推廣種植和果實(shí)品質(zhì)，挖掘葡萄耐鹽基因?qū)τ谄咸训倪z傳改良具有指導(dǎo)作用。其中，MYB轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在調(diào)控植物耐逆響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究從‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄中克隆到1個(gè)受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子基因VvMYB30，其編碼的VvMYB30蛋白與其他物種的MYB30蛋白親緣關(guān)系最近，同屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族Subgroup Ⅰ亞家族成員。同源性分析表明，它們?cè)诘鞍譔端均存在1個(gè)高度保守的R2R3結(jié)構(gòu)域，而C端則同源性較低，C端區(qū)域的差異可能影響著MYB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活[20]。這一結(jié)構(gòu)特征也與其他MYB亞家族一致[21]。

VvMYB30在其他植物中的同源蛋白已被證實(shí)廣泛參與對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答過(guò)程，如水稻中OsMYB30負(fù)調(diào)控耐寒性[9]，甜橙CsMYB30可提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性[22]，擬南芥AtMYB30參與對(duì)鹽、氧化和熱脅迫的應(yīng)激反應(yīng)[5,6]。本研究發(fā)現(xiàn)，VvMYB30受鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，暗示其可能參與葡萄的耐鹽性響應(yīng)，進(jìn)一步在擬南芥中過(guò)量表達(dá)VvMYB30可促進(jìn)擬南芥在鹽脅迫下種子的萌發(fā)率及幼苗的存活率，表明VvMYB30正向調(diào)控植物的耐鹽性。該結(jié)果與同源蛋白AtMYB30和CsMYB30的研究結(jié)果一致[5,22]。但是，本文未設(shè)置空載體對(duì)照，在后期的深入研究中將會(huì)加入空載體對(duì)照，以便于得出更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕Y(jié)論。

前人研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtMYB30通過(guò)激活交替氧化酶AtAOX1a的表達(dá)維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)來(lái)增強(qiáng)耐鹽性[5]，番茄SlMYB30可能與正調(diào)控鹽脅迫的BZR轉(zhuǎn)錄因子SlBZR1互作調(diào)控耐鹽性[23]，而甜橙CsMYB30及擬南芥AtMYB96則是通過(guò)調(diào)控蠟質(zhì)合成基因的表達(dá)提高植株的耐鹽性[22,24]。上述結(jié)果表明，MYB30轉(zhuǎn)錄因子可通過(guò)多種途徑調(diào)控植物的耐鹽性。本研究中VvMYB30定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性，這為其通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合來(lái)激活或抑制靶基因的表達(dá)提供了可能，但通過(guò)調(diào)控哪些耐鹽基因轉(zhuǎn)錄有待深入研究。

此外，本研究中VvMYB30在葡萄各組織中具有不同的表達(dá)模式，在花和果實(shí)中高表達(dá)，而在根、葉中低表達(dá)，這與甜橙CsMYB30的組織表達(dá)模式基本一致[22,25]。VvMYB30的同源基因CsMYB30、MdMYB30、AtMYB30和SlMYB31等均被證實(shí)為烷烴等蠟質(zhì)合成基因的正調(diào)控因子[22,26-28]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)VvMYB30在葡萄果實(shí)中與蠟質(zhì)合成基因VvCER、VvKCS的表達(dá)呈強(qiáng)相關(guān)性[29]。因此，推測(cè)VvMYB30還可能參與了調(diào)控果實(shí)發(fā)育過(guò)程中果實(shí)和果粉中蠟質(zhì)的生物合成，其功能有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究從‘陽(yáng)光玫瑰’葡萄中克隆了MYB基因VvMYB30，其表達(dá)受鹽脅迫誘導(dǎo)。VvMYB30與其他植物的MYB30蛋白同源性較高，為SubgroupⅠ亞家族成員。VvMYB30定位于細(xì)胞核且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。在擬南芥中過(guò)表達(dá)VvMYB30可顯著增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性。上述結(jié)果表明，VvMYB30可能在植物抵御鹽脅迫中發(fā)揮重要作用。