余婷婷 梁 松 黃文慧 何 潔,2 嚴(yán)義勇

(1. 深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司,廣東 深圳 518101;2. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院集成電路關(guān)鍵材料研究院,廣東 深圳 518055)

喹諾酮藥物因其成本低、抗菌譜廣、見效快等特點(diǎn)[1-2],在畜禽養(yǎng)殖過程中常被“超劑量”使用,導(dǎo)致動(dòng)物源性食品內(nèi)藥物殘留。此外,因其代謝緩慢,會(huì)隨食用動(dòng)物源性食品的攝入在人體內(nèi)蓄積,具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)。目前,喹諾酮藥物檢測(cè)的方法主要有薄層色譜法[3]、微生物法[4]、酶聯(lián)免疫吸附法[5]、高效液相色譜法[6]、高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[7]等。薄層色譜法用于定性分析[8]、微生物法和酶聯(lián)免疫法因其檢測(cè)藥物種類單一導(dǎo)致應(yīng)用受限[9]。利用高效液相色譜法對(duì)喹諾酮藥物進(jìn)行定性和定量分析,其原理是通過保留時(shí)間對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性,其色譜出峰受雜質(zhì)干擾較大,會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)與目標(biāo)化合物保留時(shí)間重疊的情況導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性,此外,該方法對(duì)樣品中藥物殘留的提取方式要求較高,無(wú)法實(shí)現(xiàn)痕量檢測(cè)[10]。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是根據(jù)質(zhì)荷比對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè),分離能力較高、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)痕量分析,是目前認(rèn)可度高的定性定量檢測(cè)方法,但依然會(huì)受雜質(zhì)干擾[11]。

喹諾酮藥物的樣品前處理凈化方法主要有分子印跡固相萃取[12]、固相萃取[13]、固相微萃取[14]、磁性固相萃取[15]、分散固相萃取[16]、分散液液微萃取[17]、液液微萃取[18]、液液萃取[19]、攪拌棒吸附萃取[20]等。目前使用較為廣泛的前處理方式是固相萃取柱,使用時(shí)需要對(duì)小柱進(jìn)行填料活化、吸附上樣、雜質(zhì)淋洗、目標(biāo)洗脫等過程,該方法耗時(shí)長(zhǎng),試劑需求量較大。目前使用凈化柱對(duì)動(dòng)物源性食品進(jìn)行凈化的研究較少。因此,研究擬采用濾過型凈化柱作為前處理凈化材料,無(wú)需經(jīng)過上述繁雜步驟,減少溶劑使用量,也可避免由于基質(zhì)復(fù)雜而導(dǎo)致的篩板堵塞[21]等問題,結(jié)合過柱儀進(jìn)行自動(dòng)化過柱,可在20 s內(nèi)一次性完成12管樣品的凈化,可提高大批量樣品前處理凈化效率,增加檢測(cè)通量。通過對(duì)前處理?xiàng)l件、色譜、質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化,以基質(zhì)效應(yīng)、回收率與精密度作為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定16種喹諾酮藥物最優(yōu)的檢測(cè)方法,建立過柱儀輔助凈化柱結(jié)合超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)動(dòng)物源性食品中16種喹諾酮藥物殘留的方法,以期為動(dòng)物源性食品的市場(chǎng)監(jiān)管中食品安全檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

羊肉、鴨肉、牛肉、魚肉、雞蛋、豬腰、鴨皮等基質(zhì)樣品:樣品經(jīng)高通量組織研磨儀研磨后,于-20 ℃保存?zhèn)溆?市售;

16種喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)品[噁喹酸(OXO)、氟甲喹(FLU)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、培氟沙星(PEF)、洛美沙星(LOM)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、沙拉沙星(SAR)、雙氟沙星(DIF)、氟羅沙星(FLE)、達(dá)氟沙星(DAN)、馬波沙星(MAR)、奧比沙星(ORB)、依洛沙星(ENO)、司帕沙星(SPA)]:純度≥98%,德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司;

乙腈、甲醇:色譜級(jí)(≥99.9%),美國(guó)J. T. Baker公司;

甲酸、氨水:色譜級(jí)(≥98%),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱:100 mm×2.1 mm,1.7 μm,美國(guó)Waters公司;

尼龍濾膜:0.22 μm,天津艾杰爾有限公司;

注射器:常州悅康醫(yī)療器材有限公司;

色譜自動(dòng)進(jìn)樣小瓶:浙江愛吉仁有限公司;

高通量組織研磨儀:XINW-M24型,上海鑫翁科學(xué)儀器有限公司;

移液槍:10,20,50,100,1 000,5 000 μL,德國(guó)Eppendorf公司;

純水機(jī):Milli-Q Synergy型,默克化工技術(shù)(上海)有限公司;

高速渦旋儀:MS 3 basic小型,德國(guó)IKA公司;

臺(tái)式離心機(jī):DM0412型,深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司;

氮吹儀:UGC-24C型,北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司;

超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀:SCIEX QTRAP 5500+型,美國(guó)AB SCIEX公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 16種喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用甲醇配制標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1 mg/mL),-20 ℃密封避光貯藏備用,有效期6個(gè)月。用50%乙腈水溶液稀釋16種喹諾酮藥物的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配制成1 μg/mL,100 ng/mL的單標(biāo)溶液及16種喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,4 ℃避光冷藏保存?zhèn)溆?有效期1個(gè)月。

1.2.2 樣品前處理 取5.0 g基質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入 20 mL 80%乙腈(含0.2%甲酸)提取溶劑,渦旋3 min,4 000 r/min離心2 min,取5 mL上清液于15 mL離心管中,將Speedy Prep?-Quino 1凈化柱的橡膠頭置于離心管端口,將離心管—凈化柱放置于樣品架上,使用過柱儀過柱,填料上端濾過的提取液即為凈化后的提取液,倒出至樣品瓶或樣品管中,備用。取適量樣品用氮?dú)?45 ℃)吹干,按V0.2% 甲酸水∶V甲醇為9∶1復(fù)溶,渦旋混勻,過0.22 μm濾膜,上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 色譜與質(zhì)譜分析條件

(1) 液相條件:色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動(dòng)相A為0.2%甲酸水,流動(dòng)相B為甲醇;流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量10 μL;梯度洗脫程序:0.00～5.00 min,90%～70% A;5.00～7.00 min,70%～50% A;7.00～7.10 min,50%～5% A;7.10～10.00 min,5%A;10.00～10.10 min,5%～90% A;10.10～13.00 min,90% A。

(2) 質(zhì)譜條件:質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源(ESI);采用正離子掃描模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)檢測(cè)方式;離子源溫度550 ℃;電噴霧電壓5 500 V;氣簾氣壓力0.241 MPa(氮?dú)?;噴霧氣壓力0.379 MPa(氮?dú)?;輔助氣壓力0.379 MPa(氮?dú)?;離子源溫度550 ℃。

1.2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

(1) 檢出限及定量限:空白羊肉基質(zhì)經(jīng)過前處理的提取、凈化得到樣品測(cè)試前的復(fù)溶液,用此復(fù)溶液稀釋16種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制喹諾酮藥物溶液,質(zhì)量濃度梯度分別為0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,5.0 ng/mL,UPLC-MS/MS測(cè)試后,根據(jù)SCIEX OS 軟件得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù),以3,10倍的信噪比計(jì)算每種喹諾酮藥物的檢出限(LOD)與定量限(LOQ)。

(2) 基質(zhì)效應(yīng):純?nèi)軇┫♂寴?biāo)品,得到純?nèi)軇┛瞻讟?biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度梯度分別為0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,5.0 ng/mL?？瞻谆|(zhì)復(fù)溶液稀釋標(biāo)品,得到基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,質(zhì)量濃度梯度分別為0.05,0.1,0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,5.0 ng/mL。UPLC-MS/MS檢測(cè)后得到純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線和空白基質(zhì)匹配曲線。按式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。

(1)

式中:

ME——基質(zhì)效應(yīng);

K1——空白基質(zhì)匹配曲線斜率;

K2——純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率。

(3) 添加回收率與精密度:精確稱取5.0 g空白基質(zhì)樣品,分別加入5,20,100 μg/kg的16種喹諾酮混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.2.2的方法對(duì)基質(zhì)樣品進(jìn)行處理,外標(biāo)法基質(zhì)匹配曲線定量,以加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為評(píng)價(jià)指標(biāo),驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性及精密度。

(4) 數(shù)據(jù)分析:運(yùn)用 Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、計(jì)算,使用SolidWorks建模、繪圖,使用Origin繪圖,使用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析,試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜條件優(yōu)化 由圖1可知,當(dāng)水相均為0.1%甲酸水,甲醇為有機(jī)相時(shí),喹諾酮藥物在色譜上相互分離程度較乙腈為有機(jī)相時(shí)的好,峰型更為尖銳。0.1%甲酸水—乙腈洗脫的噁喹酸及氟甲喹拖尾嚴(yán)重,且乙腈毒性較大,因此選用甲醇為有機(jī)相。此外,隨著甲酸濃度的增加,部分化合物響應(yīng)有稍微的降低或增加,但均滿足所需的響應(yīng)需求,為使整體響應(yīng)值偏高,選用0.2%甲酸水—甲醇作為流動(dòng)相。

圖1 不同流動(dòng)相下16種喹諾酮藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖

2.1.2 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化 由表1可知,16種喹諾酮藥物保留時(shí)間為4.25～8.26 min,可在10 min內(nèi)完成定性分析。

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 凈化材料 由圖2可知,凈化柱從裝有提取液的離心管端口下壓使得提取液穿過復(fù)合填料,此過程中雜質(zhì)被復(fù)合填料吸附,而目標(biāo)分析物不被吸附,流穿的提取液即為凈化后的提取液。分別對(duì)凈化前和凈化后的羊肉基質(zhì)提取液中的雜質(zhì)進(jìn)行紫外測(cè)試,結(jié)果如圖3所示。由圖3可知,過柱后的提取液在波長(zhǎng)<300 nm時(shí)紫外吸收值較未過柱的提取液有一定程度的降低,表明動(dòng)物源性食品提取液經(jīng)凈化柱過柱后蛋白質(zhì)等雜質(zhì)有一定程度的減少,利用凈化柱方法凈化效果較好。

圖2 凈化柱凈化樣品提取液過程示意圖

圖3 羊肉基質(zhì)凈化前及凈化后的紫外吸收對(duì)比圖

2.2.2 過柱儀輔助凈化 過柱儀輔助凈化操作過程如圖4所示,插入電源適配器通電,將離心管—凈化柱放置于樣品管架上,然后將待過柱的管架水平居中放入艙內(nèi)運(yùn)動(dòng)板下方,啟動(dòng)儀器開始工作,工作流程結(jié)束后運(yùn)動(dòng)板自動(dòng)復(fù)位,此時(shí)可取出離心管架,完成過柱。

圖4 過柱儀過柱示意圖

2.2.3 提取溶劑 以羊肉為基質(zhì),探究不同濃度的乙腈水對(duì)回收率的影響。結(jié)果顯示,隨著有機(jī)溶劑的減少,提取液色素含量顯著增高,提取液雜質(zhì)增多,渾濁度增高,當(dāng)乙腈濃度低于50%時(shí),色素增加得更為明顯。因此選擇50%,60%,70%,80%,90%,100%乙腈分別對(duì)羊肉基質(zhì)進(jìn)行提取。當(dāng)以90%,100%乙腈作為提取液時(shí),大部分喹諾酮藥物的回收率較低;當(dāng)以50%,60%,70%乙腈水作為提取液時(shí),噁喹酸、氟甲喹的回收率較低,尤其是氟甲喹的回收率低于60%。當(dāng)以80%乙腈水作為提取液時(shí),16種喹諾酮藥物的回收率為73.12%～122.41%,提取效果較好。

為進(jìn)一步提高部分喹諾酮藥物的回收率,向80%乙腈水中分別添加氨水及甲酸,結(jié)果見表2。由表2可知,與80%乙腈水相比,當(dāng)提取液中添加0.2%氨水時(shí),大部分喹諾酮藥物的回收率顯著降低(P<0.05),而添加0.2%甲酸的提取液,9種喹諾酮藥物的回收率均顯著增加(P<0.05),尤其是依諾沙星的回收率由73.12%提升至97.39%。當(dāng)甲酸添加量分別增加至0.5%,1.0%時(shí),部分藥物的回收率顯著降低(P<0.05),可能是因?yàn)猷Z酮藥物是兩性化合物,一定的酸性條件促進(jìn)了部分喹諾酮藥物的溶解,而過酸條件下部分喹諾酮藥物可能會(huì)有一定程度的降解[22]。與80%甲醇水(含0.2%甲酸)相比,當(dāng)以80%乙腈水(含0.2%甲酸)作為提取液時(shí),喹諾酮藥物的回收率較高且具有顯著性差異。因此,最終選擇80%乙腈水(含0.2%甲酸)為提取溶劑。

表2 不同提取溶劑下16種喹諾酮藥物的回收率?

2.3 方法檢出限和定量限

以羊肉基質(zhì)為例,其基質(zhì)標(biāo)曲的檢出限、定量限、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)如表3所示。羊肉基質(zhì)在此方法檢測(cè)下的16種喹諾酮類藥物在1.6～40.0 μg/kg質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性較好,相關(guān)系數(shù)r≥0.996 1,檢出限為0.14～0.80 μg/kg,定量限為0.47～2.68 μg/kg。

表3 16種喹諾酮藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限及定量限

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

以羊肉基質(zhì)為例,由表4可知,16種喹諾酮藥物中有6種喹諾酮藥物即噁喹酸、氟甲喹、環(huán)丙沙星、沙拉沙星、雙氟沙星、奧比沙星受基質(zhì)干擾程度大,表現(xiàn)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng),其中氟甲喹的基質(zhì)效應(yīng)最強(qiáng),比值為0.29,其余10種基質(zhì)效應(yīng)為弱基質(zhì)效應(yīng),可忽略不計(jì)。

表4 16種喹諾酮藥物基質(zhì)效應(yīng)

2.5 回收率與精密度

以羊肉、鴨肉、牛肉、魚肉、雞蛋、豬腰、鴨皮為樣品基質(zhì),使用建立的方法對(duì)其進(jìn)行添加回收試驗(yàn),進(jìn)行方法驗(yàn)證和應(yīng)用,結(jié)果見表5。由表5可知,羊肉基質(zhì)的平均回收率為72%～109%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～11.0%;鴨肉基質(zhì)的平均回收率為72%～112%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～13.0%;牛肉基質(zhì)的平均回收率為72%～105%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～13.1%;魚肉基質(zhì)的平均回收率為74%～110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%～10.9%;雞蛋基質(zhì)的平均回收率為69%～110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～18.7%;豬腰基質(zhì)的平均回收率為62%～109%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%～13.3%;鴨皮基質(zhì)的平均回收率為71%～118%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%～10.7%;7個(gè)基質(zhì)的平均回收率為62%～112%,RSD為0.90%～18.7%,平均回收率均滿足GB/T 27404—2008的要求,表明試驗(yàn)建立的方法適用基質(zhì)廣泛,準(zhǔn)確度和精密度良好,穩(wěn)定性好。

表5 16種喹諾酮藥物在不同加標(biāo)水平下的回收率及精密度

3 結(jié)論

建立了一種過柱儀輔助凈化柱結(jié)合UPLC-MS/MS檢測(cè)動(dòng)物源性食品中16種喹諾酮藥物的確證性定量方法。樣品經(jīng)80%乙腈水(含0.2%甲酸)提取溶劑進(jìn)行提取,能減少部分雜質(zhì)與目標(biāo)化合物共提取。使用濾過型凈化柱對(duì)提取液內(nèi)雜質(zhì)進(jìn)行凈化,相對(duì)于SPE小柱可減少凈化過程中活化、淋洗、洗脫等步驟,解決了16種喹諾酮藥物因雜質(zhì)干擾導(dǎo)致的部分化合物回收率差及前處理過程復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)的問題,配合使用過柱儀可一次性于20 s內(nèi)完成12管樣品的凈化,增大了樣品檢測(cè)通量,提高了前處理凈化效率。結(jié)合UPLC-MS/MS對(duì)每個(gè)化合物進(jìn)行獨(dú)立檢測(cè),其重現(xiàn)性好,靈敏度高,滿足定性及痕量分析的檢測(cè)需求。研究的不足在于對(duì)色素較深和基質(zhì)較為復(fù)雜的動(dòng)物源性食品可能需要進(jìn)行2次及以上凈化或減少凈化量從而確保較好的凈化效果,而此關(guān)鍵在于凈化柱填料的選擇及填料的使用量和待凈化液量,以期在未來(lái)的凈化柱產(chǎn)品填料選擇以及方法建立上進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。