夏緒紅 劉慶蘭 陶小慶

（貴州省銅仁市檢驗檢測院，貴州銅仁 554300）

藤茶（Ampelopsis grossedentata）又稱莓茶、白毛猴，是一種顯齒蛇葡萄科的藥食兩用植物，廣泛分布在我國西南及中部的山林地區(qū)[1]。藤茶葉是藤茶入藥和食用的主要部分，為二回羽狀復(fù)葉，基部一對小葉常為3 小葉或稀為羽狀復(fù)葉，小葉長橢圓形或卵圓形，長4～12 cm，寬2～6 cm，頂端漸尖，基部微心形或圓形，邊緣每側(cè)有3～15個粗鋸齒[1-2]。藤茶具有清熱利濕、平肝降壓和活血通絡(luò)的功效，可用于治療痢疾、泄瀉、小便淋痛和頭昏目脹等疾病[2]。研究表明，藤茶含有超過10種礦物質(zhì)，其中鐵、銅、錳、鋅和硒的含量較高[1]；天然野生藤茶有消炎止咳作用，對金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等有明顯的抑制作用[3]；藤茶的主要功能成分包括氨基酸、黃酮類及礦物質(zhì)等，其中黃酮類物質(zhì)含量豐富[3-4]，總黃酮含量超過總多酚的45%，其中二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY）含量相對較高，可達葉干重的25%～35%（w/w）[5]。DMY又稱蛇葡萄素，屬于黃酮類有機化合物，分子式為C15H12O8，化學(xué)式為（2R，3R）-3，5，7-三羥基-2-（3，4，5-三羥基苯基）苯并二氫吡喃-4-酮[1，6]。研究表明，DMY 是藤茶的主要生理活性成分，具有抗氧化[3]、預(yù)防心血管疾病[7]、緩解糖尿病[8]、抗血栓[9]以及調(diào)節(jié)腸道菌群[10]等功效。DMY可以防治肝纖維化及脂肪肝，通過降低導(dǎo)致肝纖維化TGFβ1 的水平，降低肝臟內(nèi)丙二醛含量，提高機體抗氧化水平從而防治肝纖維化[3，11]；DMY 還可以通過降低肝臟腺苷酸活化蛋白激酶磷酸化水平，降低脂質(zhì)沉積來保護肝臟[6]。此外，DMY具有廣譜抑菌效果，對金色葡萄球菌、福氏志賀氏菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌和大腸桿菌等細(xì)菌均有抑制作用[12]，其通過抑制菌體的呼吸代謝、破壞菌體的結(jié)構(gòu)形態(tài)及改變細(xì)胞膜的滲透性[3-4]等發(fā)揮抑菌功能。

作為茶飲，藤茶口味獨特，加之其獨特的保健作用，具有很好的市場潛力。研究發(fā)現(xiàn)，不同種類藤茶中的DMY含量存在一定差異[13-14]。但對不同產(chǎn)地、不同采收時間和不同等級藤茶之間的DMY 含量差異研究相對較少。

本試驗通過收集具有代表性的a、b、c 及d 區(qū)域的不同時期3 種不同類型（按等級分）的藤茶（葉為主），采用熱水浸提方法提取不同藤茶中的DMY；并利用HPLC 分析不同藤茶中DMY 的含量，為藤茶引種、種植及加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

試劑：甲醇（色譜純，默克股份有限公司）；磷酸（優(yōu)級純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；DMY 對照品（98%，上海莼試生物技術(shù)有限公司）。

設(shè)備：高效液相色譜儀（Thermo UtiMate3000）；電子天平（1/105，梅特勒—托利多）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ5200DE，昆山市超聲儀器有限公司）；高速粉粹機（FW100，天津市泰斯特儀器有限公司）；隔膜真空泵（GM-0.33A，天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）；色譜柱：Diamonsil 5um C18（2），150×4.6 mm（3859090）。

1.2 試驗材料

本試驗所用藤茶來源于a區(qū)域某生物科技有限公司、b 區(qū)域藤茶生物科技有限公司、c 區(qū)域藤茶茶業(yè)廠、d 區(qū)域藤茶有限公司。4 月采摘時間為20—26 日，5 月采摘時間為23—29 日，6 月采摘時間為21—28日，7月采摘時間為20—25日。不同等級藤茶的分級標(biāo)準(zhǔn)[1-2，12]如表1所示，分級特征如圖1所示。

圖1 藤茶分級參考標(biāo)準(zhǔn)

表1 藤茶等級分級標(biāo)準(zhǔn)

1.3 試驗方法

1.3.1 DMY 的提取DMY 的提取方法參照文獻[13]并適當(dāng)修改。精確稱取1.0 g 干燥藤茶葉，按料液比（1∶100，w∶v）加入70 ℃的熱水，磁力攪拌下浸提40 min。浸提結(jié)束后進行抽濾，濾渣按上述方法浸提一次并抽濾，合并濾液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約1/2 體積，將濃縮液以0.22 μm 濾頭過濾后貯藏（-20 ℃），待測。

1.3.2 DMY 含量的測定DMY 含量的測定參照文獻[14]，采用液相色譜法測定藤茶原料中DMY 的含量，具體條件如下。

（1）色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以甲醇∶0.05%磷酸（55∶45）為流動相；檢測波長291 nm；理論塔板數(shù)按DMY計算應(yīng)不低于3 000。

（2）對照品溶液的制備。精密稱取DMY對照品20.0 mg，置25 mL 量瓶中，以甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 mm濾膜過濾，制成0.8 mg/mL貯備液，測定時從貯備液中吸取1～10 mL 容量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，制得0.08 mg/mL DMY 對照溶液，備用。

（3）供試品溶液的制備。將干燥藤茶待檢樣品或藤茶植物干燥嫩莖葉粉碎后過60目篩，精密稱定0.5 g 置于25 mL 容量瓶中，加入甲醇20 mL，超聲30 min，放置室溫，用甲醇定容至25 mL，搖勻后精密量取樣液1.0 mL，置100 mL 量瓶中，以甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 mm濾膜過濾后備用。

（4）分別精密吸取供試品溶液、對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定；本品按干燥品計算，含DMY不得低于18%。

采用外標(biāo)法計算供試品溶液中DMY含量，樣品中DMY含量（W）計算公式如下。

式中，A1為樣品溶液中DMY 的峰面積；AS為對照品溶液中DMY 的峰面積；C為對照品溶液中的質(zhì)量濃度（mg/mL）；m為試樣的質(zhì)量（g）。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理每次試驗重復(fù)3 次，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)單因素方差分析采用SPSS 22.0軟件，并利用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地不同等級藤茶中DMY含量

不同產(chǎn)地不同等級藤茶中DMY 含量如圖2 所示。不同區(qū)域相同等級藤茶中含DMY 含量范圍為23%～36%，其中a 區(qū)域藤茶的DMY 含量最高，特級藤茶達到36.2 g/100 g dw，與其他地區(qū)同等級的DMY含量存在顯著差異，其次為d區(qū)域和c區(qū)域產(chǎn)藤茶，DMY含量在31.0～32.0 g/100 g dw；b區(qū)域產(chǎn)藤茶含量最低，平均28.5 g/100 g dw。相同區(qū)域不同等級藤茶之間DMY含量也存在不同程度的差異，特級藤茶最高，一級藤茶次之，二級藤茶最低，均未達到顯著差異。

圖2 不同區(qū)域不同等級藤茶DMY含量

2.2 不同采摘時間的藤茶中DMY含量

不同區(qū)域不同等級藤茶在不同采摘時間的DMY 含量如圖3 所示。不同區(qū)域在相同采摘時間的DMY 含量具有明顯差異，均表現(xiàn)為a 區(qū)域藤茶中DMY 含量最高，c、d 區(qū)域藤茶中DMY 含量次之，b 區(qū)域藤茶中DMY 含量略低；相同區(qū)域中各同等級藤茶在不同采摘時間之間的DMY 含量無顯著差異。

圖3 不同區(qū)域不同等級藤茶在不同采摘時間的DMY含量

3 結(jié)論與討論

不同區(qū)域藤茶干物質(zhì)中DMY 含量在21.2～36.2 g/100 g，相同等級藤茶中，a 區(qū)域產(chǎn)藤茶DMY含量最高，可達30.9～36.2 g/100 g；相同產(chǎn)地不同等級藤茶之間，特級藤茶DMY 含量高于一、二級藤茶，但未達到顯著水平。這與相關(guān)研究結(jié)論相符，Ye 等[14]檢測藤茶中DMY 含量為22.6%（w/w），Hu等[15]在廣西藤茶中DMY 含量檢測中，得出含量為12.2%（w/w），Li 等[16]采用微波輔助提取法提取武夷山藤茶時，通過優(yōu)化提取條件，DMY 最高提取率可達85%，Zhen 等[17]采用超聲提取法提取藤茶DMY，提取率可達86%。即不同產(chǎn)地和不同提取方法可能影響DMY 的提取率，進而影響分析結(jié)果。同時，提取溶劑、提取溫度、提取時間、料液比和pH等因素對DMY 的提取率均有不同程度的影響[16-18]。值得注意的是，不同品種及不同采收時間也可能會影響藤茶中各類化學(xué)成分的含量及檢測結(jié)果。

本研究結(jié)果中，相同產(chǎn)地相同等級藤茶之間，不同采摘時間的藤茶DMY含量沒有明顯差異，這與相關(guān)研究結(jié)論[19-20]存在差異，胡百順等[20]發(fā)現(xiàn)藤茶DMY、花旗松素、多酚及DMY異構(gòu)體含量在5月最高。產(chǎn)生差異的主要原因可能是本研究中藤茶樣品在試驗期間保存不夠嚴(yán)格，早期采摘藤茶樣品中黃酮可能被氧化降解，最終導(dǎo)致不同采摘時間樣品間的差異不顯著[21]。不同產(chǎn)地及不同等級藤茶之間的DMY含量存在明顯差異，實際應(yīng)用中可根據(jù)需求加以選擇。

不同產(chǎn)地相同等級藤茶之間DMY 含量存在顯著差異，相同產(chǎn)地不同等級藤茶之間也有差異，而不同采摘時間之間沒有顯著差異。即產(chǎn)地和等級對藤茶DMY 含量具有顯著的影響。根據(jù)相關(guān)研究[6，14]，產(chǎn)生差異的主要原因可能是不同區(qū)域藤茶所處的氣候環(huán)境不同，如溫度、濕度和光照等方面存在差異[3]。也有可能是DMY 存在同分異構(gòu)體，一般檢測手段難以區(qū)分，檢測結(jié)果準(zhǔn)確度有待提高[4，15]。此外，不同區(qū)域藤茶的基因可能也存在明顯差異，導(dǎo)致DMY 含量不同[11]。因此，產(chǎn)生差異的原因有待進一步深入探究。

本試驗通過收集具有代表性的a、b、c 及d 區(qū)域的不同時期3 種不同類型（按等級分）的藤茶（葉為主），采用熱水浸提方法提取不同藤茶中的DMY；并利用液相色譜法分析了不同藤茶中DMY的含量，為藤茶引種、種植及加工利用提供參考。