孔德瑤，陳 穎，師家豪，董麒霏，張 晴

1.南華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，湖南 衡陽 421001；3.南華大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.陜西科技大學(xué)，陜西 西安 710021

在分類學(xué)上，螺原體屬于動(dòng)物門自我復(fù)制的原核生物，由革蘭氏陽性細(xì)菌進(jìn)化而來。螺原體沒有細(xì)胞壁，與動(dòng)物門中的其他微生物一樣，具有簡(jiǎn)單的代謝過程、寄生生活、“煎蛋”菌落形態(tài)和少量基因組，只是其形態(tài)與典型的動(dòng)物門微生物支原體不同，它們是螺旋狀的，按照螺旋狀的路徑移動(dòng)。中華絨螯蟹螺原體（Spiroplasma eriocheiris）已被確定為一種新型病原體。已有研究表明，螺原體的致病性也表現(xiàn)在除水生動(dòng)物以外的其他生物體中，此外，有學(xué)者認(rèn)為中華絨螯蟹螺原體可能與螃蟹的肝胰腺壞死病（HPND）有關(guān)。在中國(guó)，中華絨螯蟹肝胰腺壞死（HPND）已經(jīng)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Shen，Kumar et al. 2021）。闡明中華絨螯蟹的性質(zhì)、宿主范圍及其作用機(jī)理，對(duì)于微生物水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展具有重要意義。

1 宿主分布

中華絨螯蟹螺原體是第一個(gè)在甲殼類動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)的螺旋體病原體，改變了學(xué)術(shù)界對(duì)螺旋體宿主的認(rèn)知，該病原體之前就被確定為中華絨螯蟹震顫?。═D）的致病因素。對(duì)中華絨螯蟹螺原體的16S rDNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這種螺原體菌株與非凡螺原體（S. mirum）密切相關(guān)。過往的研究報(bào)告指出，從兔蜱（Haemaphysalis leporispalustris）中分離出的非凡螺原體具有感染脊椎動(dòng)物和誘發(fā)乳鼠白內(nèi)障的能力。與預(yù)期結(jié)果相似，中華絨螯蟹螺原體除了會(huì)感染無脊椎動(dòng)物，還能感染脊椎動(dòng)物。其有能力在雞胚胎的卵黃囊中繁殖，進(jìn)而出現(xiàn)在胚胎雞的大腦中。

2 毒力因子

螺原體是一種無壁的細(xì)菌，它依賴于宿主細(xì)胞之間蛋白質(zhì)的相互作用。螺原體的表面蛋白在黏附、入侵和與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。螺原體與血細(xì)胞之間的相互作用使螺原體能夠進(jìn)入血細(xì)胞中。此外，螺原體是一種沒有細(xì)胞壁的溶血性菌種，因此不會(huì)產(chǎn)生外部毒素或內(nèi)毒素。在過去的研究中，磷脂酶已被報(bào)告為中華絨螯蟹的毒力因子，并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。同時(shí)，相關(guān)研究結(jié)果表明，SE-LysoPL 在中華絨螯蟹螺原體的致病性中發(fā)揮著核心作用。Western blot 分析結(jié)果顯示，SELysoPL 是中華絨螯蟹螺原體的一種膜蛋白。利用抗體中和試驗(yàn)，筆者還發(fā)現(xiàn)SE-LysoPL 可能是中華絨螯蟹螺原體的一個(gè)重要毒力因子，也在中華絨螯蟹螺原體的致病性和代謝反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用。

3 形態(tài)和運(yùn)動(dòng)能力

作為一種沒有細(xì)胞壁的獨(dú)特細(xì)菌，中華絨螯蟹螺原體擁有螺旋狀的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其尺寸為：長(zhǎng)2.0～10.0 μm，寬77.6±8.8 nm，螺旋間距806.7±140.4 nm，螺旋直徑228.2±55.3 nm（n=200）。在秋水仙素存在的情況下，中華絨螯蟹螺原體將失去其細(xì)胞的螺旋性并破壞其致病性。此外，中華絨螯蟹螺原體細(xì)胞的極性是由一個(gè)錐形的末端體現(xiàn)的，通常被稱為尖端，細(xì)胞總是沿著它游泳。

自主移動(dòng)是中華絨螯蟹螺原體的一個(gè)特點(diǎn)，螺旋形狀非常適合在半黏性介質(zhì)中移動(dòng)[1]。中華絨螯蟹螺原體可以在黏稠介質(zhì)中以5 μm/s 的速度游動(dòng)，行動(dòng)非常迅速。隨著環(huán)境介質(zhì)黏度的增大，中華絨螯蟹螺原體的游動(dòng)速度也在隨之提高。中華絨螯蟹螺原體沿細(xì)胞軸呈現(xiàn)出兩種手性，即右手和左手的螺旋細(xì)胞形狀，在尖端的作用下，手性從正面逆轉(zhuǎn)，在兩個(gè)螺旋的邊界上產(chǎn)生了扭結(jié)結(jié)構(gòu)。兩種手性共存使扭結(jié)的純機(jī)械傳播得以實(shí)現(xiàn)。隨著扭結(jié)點(diǎn)的移動(dòng)，扭結(jié)點(diǎn)位置兩個(gè)相反方向的螺旋旋轉(zhuǎn)可以產(chǎn)生一個(gè)相同前進(jìn)方向的推進(jìn)力，像螺絲釘一樣通過與水的摩擦實(shí)現(xiàn)前進(jìn)。環(huán)境黏度越大，游動(dòng)速度就越快。總的來說，這種獨(dú)特的游泳機(jī)制可能有助于它們生存和感染宿主。

4 細(xì)胞骨架

中華絨螯蟹螺原體的螺旋形細(xì)胞形態(tài)是由內(nèi)部細(xì)胞骨架支撐的，細(xì)胞骨架由一個(gè)長(zhǎng)約240 nm 的啞鈴形結(jié)構(gòu)和一個(gè)扁平的帶狀結(jié)構(gòu)組成。錐形頂端的啞鈴形結(jié)構(gòu)由一條扁平的帶子連接起來，該帶子沿體螺旋線跨越最短的螺旋路徑。游泳過程中的螺旋度轉(zhuǎn)移和扭結(jié)傳遞都取決于內(nèi)部的螺旋帶結(jié)構(gòu)，其由“纖維”絲和基因組中編碼的5 種MreB 蛋白（MreB1-5）中至少4 種MreBs（MreB1、2、4、5）組成。“纖維狀”絲狀物是螺槳菌屬的特有產(chǎn)物。有壁細(xì)菌只擁有一種MreB 蛋白，在系統(tǒng)發(fā)育上與螺原體相距甚遠(yuǎn)。上述事實(shí)足以說明螺原體的MreBs 與纖維絲的區(qū)別。因此，中華絨螯蟹螺原體中特殊的纖維絲和MreB 一直是一個(gè)研究的熱點(diǎn)話題。通過觀察發(fā)現(xiàn)，纖維素通過形成類似于細(xì)胞的半截體和位于細(xì)胞膜下的一定曲率，來決定細(xì)胞的螺旋度。MreBs是肌動(dòng)蛋白家族的成員，被稱為聚合動(dòng)力學(xué)，是基于核苷酸結(jié)合的，如ATP 和GTP，它們是螺旋槳游動(dòng)的潛在發(fā)力者。基于聚合動(dòng)力學(xué)的均勻MreB 分子的聚合和解聚所形成的收縮和延伸導(dǎo)致MreB 絲的長(zhǎng)度發(fā)生變化，并最終導(dǎo)致螺旋度轉(zhuǎn)變，這可以通過纖維絲來定義。螺旋度轉(zhuǎn)移在纖維絲中得到了完善，纖維絲專門用于轉(zhuǎn)移而不改變長(zhǎng)度，并將沿著細(xì)胞軸線向下，產(chǎn)生上述基于帶狀物的軸向合作性扭結(jié)傳輸。

5 宿主免疫反應(yīng)

5.1 中華絨螯蟹

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)普及率的日益提高，由中華絨螯蟹螺原體引起的震顫?。═D）開始大量出現(xiàn)，養(yǎng)殖者因TD 而遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。中華絨螯蟹螺原體最初通過破損的傷口和鰓進(jìn)入宿主，然后入侵血細(xì)胞，這就是其感染的主要場(chǎng)所。中華絨螯蟹螺原體在血細(xì)胞中形成多個(gè)包涵體，隨著病原體的不斷增殖，包涵體不斷擴(kuò)大最終導(dǎo)致血細(xì)胞破裂。同時(shí)，中華絨螯蟹螺原體通過血液循環(huán)不斷瞄準(zhǔn)許多器官的結(jié)締組織，在后期，它們感染神經(jīng)系統(tǒng)并在神經(jīng)肌肉接頭和胸神經(jīng)節(jié)處大量繁殖，導(dǎo)致TD 發(fā)生。

基于中華絨螯蟹螺原體的致病性和特異性，人們進(jìn)行了大量的研究，從基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯和蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs）等層面闡述了宿主對(duì)TD 病原體免疫反應(yīng)的分子機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中華田園綜合體的免疫系統(tǒng)在感染中華絨螯蟹螺原體后產(chǎn)生了強(qiáng)有力的反應(yīng)，包括吞噬作用、丙酚氧化酶激活系統(tǒng)（proPO 系統(tǒng)）、血淋巴凝結(jié)系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)、抗菌蛋白等。與其他無脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)相同，中華絨螯蟹依靠先天免疫，即細(xì)胞免疫和體液免疫來識(shí)別病原體和抵抗感染[2]。

對(duì)于甲殼動(dòng)物來說，受體介導(dǎo)的吞噬作用是先天免疫系統(tǒng)的一個(gè)組成部分，可以幫助宿主細(xì)胞消除入侵的病原體[3]。過往的研究表明，中華絨螯蟹的VAMP（囊泡相關(guān)膜蛋白）在中華絨螯蟹螺原體的感染中存在差異性表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VAMP 參與了細(xì)胞的吞噬作用，并與溶酶體進(jìn)行結(jié)合以防御入侵的中華絨螯蟹螺原體，轉(zhuǎn)錄抑制VAMP 后，被中華絨螯蟹螺原體吞噬和滅活的病原體就明顯減少了。

蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的分析表明，在中華絨螯蟹螺原體入侵期間，宿主增強(qiáng)了proPO 系統(tǒng)相關(guān)基因的表達(dá)，如Pox 和cSP，并改變了許多proPO 系統(tǒng)的相關(guān)蛋白，包括絲氨酸蛋白酶和蛋白酶抑制劑，同樣通過蛋白泛素化調(diào)控來增強(qiáng)proPO 蛋白的表達(dá)。

除了proPO 系統(tǒng)外，其他重要的甲殼動(dòng)物防御機(jī)制、溶血凝固系統(tǒng)，也被認(rèn)為可以加強(qiáng)中華絨螯蟹螺原體入侵后的免疫反應(yīng)。根據(jù)中華絨螯蟹螺原體感染后轉(zhuǎn)錄圖譜的差異，確定了“補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)途徑”的富集基因簇。血球蛋白和凝血相關(guān)蛋白在感染期間都表現(xiàn)出相當(dāng)大的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化。據(jù)推測(cè)，可能是入侵的病原體被凝血功能捕捉到了血栓中，從而激活了吞噬機(jī)制以消除病原體[4]。

通過觀察發(fā)現(xiàn)，中華絨螯蟹螺原體提高的活性氧（ROSs）水平在被感染的果蠅S2 細(xì)胞中引發(fā)了細(xì)胞的凋亡和壞死，極大地降低了細(xì)胞的活力。中華絨螯蟹相應(yīng)的抗氧化系統(tǒng)積極對(duì)抗氧化的影響，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、Trx 系統(tǒng)（硫氧還蛋白、硫氧還蛋白還原酶、NADPH）、過氧還蛋白等都是該系統(tǒng)中關(guān)鍵的抗氧化因子。

5.2 羅氏沼蝦

作為被螺旋體攻擊的另一種甲殼類動(dòng)物——羅氏沼蝦，同樣用蛋白組學(xué)技術(shù)來探索此類蝦對(duì)中華絨螯蟹螺原體的免疫功能，發(fā)現(xiàn)宿主體內(nèi)的細(xì)胞骨架蛋白（肌動(dòng)蛋白和肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白）與病原的黏附和侵襲有關(guān)。Ras 相關(guān)核蛋白通過調(diào)節(jié)對(duì)螺原體的吞噬作用來參與羅氏沼蝦的先天性免疫反應(yīng)，由于螺原體能逃避吞噬作用并形成良好的生活環(huán)境包涵體的特殊致病機(jī)制，沉默MrRan 卻能提高對(duì)蝦的存活率。

6 結(jié)論

螺原體缺少細(xì)胞壁，基因組簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單。中華絨螯蟹螺原體呈螺旋狀，其細(xì)胞骨架由一個(gè)長(zhǎng)約240 nm 的啞鈴形結(jié)構(gòu)和一個(gè)扁平的帶狀結(jié)構(gòu)組成。而中華絨螯蟹螺原體作為我國(guó)水產(chǎn)生物中華絨螯蟹震顫病的致病原，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。除此之外，中華絨螯蟹還容易感染克氏原螯蝦、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦和日本沼蝦，還能引起其他雞胚及果蠅等非水生生物的感染。據(jù)觀察，中華絨螯蟹螺原體可能通過尖端與宿主細(xì)胞結(jié)合，自主移動(dòng)是中華絨螯蟹螺原體的特點(diǎn)之一。而在宿主反應(yīng)過程中發(fā)現(xiàn)的SE-LysoPL 則是其核心的毒力因子，中華絨螯蟹螺原體的類似黏附蛋白（ALP）也參與了病原體-宿主的相互作用。對(duì)中華絨螯蟹螺原體的毒力因子、細(xì)胞骨架、運(yùn)動(dòng)形態(tài)、宿主反應(yīng)等開展深入研究有助于為其引起的一系列不良反應(yīng)提供預(yù)防、檢測(cè)和治療靶點(diǎn)，從而保障水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展。