段 穎，李肖肖，秦國(guó)宏

南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046

雙特異性抗體憑借其靶點(diǎn)結(jié)合的特殊性，作用機(jī)制靈活，相應(yīng)的藥物在疾病治療領(lǐng)域中發(fā)揮了超越天然抗體的優(yōu)勢(shì)[1]。從安全用藥角度考慮，將其應(yīng)用于臨床試驗(yàn)中時(shí)，必須嚴(yán)格控制藥物中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[2]。

細(xì)菌內(nèi)毒素存在于革蘭氏陰性菌外膜中。細(xì)菌在死亡或自溶后就會(huì)釋放出內(nèi)毒素，隨著給藥進(jìn)入體內(nèi)后可引發(fā)嚴(yán)重的不良副作用[3]。基于內(nèi)毒素可以特異性激活負(fù)責(zé)鱟血液凝固的蛋白酶原這一原理，憑借操作簡(jiǎn)單的優(yōu)勢(shì)，凝膠法被廣泛應(yīng)用于藥物的內(nèi)毒素污染控制中。鑒于鱟資源的稀缺性，并且該方法本身容易受到的干擾因素眾多，加之其僅能作為定性方法被應(yīng)用，在多方面因素的作用下，建立穩(wěn)健替代方法迫在眉睫[4-5]。

重組C 因子法在內(nèi)毒素檢測(cè)方面具有高度特異性[6]。重組C 因子作為改造的穩(wěn)定蛋白，與內(nèi)毒素結(jié)合后識(shí)別并催化下游底物發(fā)出熒光信號(hào)。信號(hào)強(qiáng)度與內(nèi)毒素含量呈正相關(guān)，因此可以定量檢測(cè)內(nèi)毒素含量。該方法無需用到天然鱟變形細(xì)胞，保護(hù)了鱟資源。本研究建立了雙抗藥物的細(xì)菌內(nèi)毒素質(zhì)量控制方法，并開展了方法學(xué)研究[7]。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器

生化培養(yǎng)箱(上海一恒公司)，生物安全柜（蘇州安泰公司），多功能酶標(biāo)儀（Molecular Devices 公司）。

1.2 試藥

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)202088，規(guī)格60 EU/支，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（批號(hào)2012220，湛江安度斯生物有限公司）；鱟試劑（批號(hào)22022412，靈敏度0.25 EU/mL，規(guī)格0.1 mL，福州新北生化工業(yè)有限公司）；重組C 因子試劑盒（批號(hào)RF010210401，RF010220201，Adamas life 公司）；原液（批號(hào)20211102，內(nèi)毒素限值低于15 EU/mL，南京正大天晴制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠法檢測(cè)

取一支細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，加入1 mL 檢查用水復(fù)溶，渦旋15 min 后即得到濃度為60 EU/mL 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液。后續(xù)不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液均由該溶液稀釋得到。

參照中國(guó)藥典中最大有效稀釋倍數(shù)計(jì)算公式，確定原液最大稀釋倍數(shù)為60。取原液用檢查用水配制成60 倍稀釋濃度的供試品溶液。取0.1 mL 供試品溶液向其中加入鱟試劑0.1 mL，平行制2 管作為供試品陰性對(duì)照組；用60 倍稀釋濃度的供試品溶液同比例稀釋1 EU/mL 的內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品，并取0.1 mL 稀釋后的溶液向其中加入鱟試劑0.1 mL，平行制2 管作為供試品陽(yáng)性對(duì)照組；分別取0.1 mL 檢查用水和0.5 EU/mL 內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品向其中加入鱟試劑0.1 mL，分別作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照組，每組平行制2 管。將配制完成的溶液樣品用封口膜封口，渦旋混勻后于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)60 min。

依據(jù)中國(guó)藥典凝膠限度試驗(yàn)中的結(jié)果判定規(guī)則對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

2.2 重組C 因子法建立

2.2.1 樣品制備

在無熱原玻璃試管中用檢查用水將60 EU/mL的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行梯度稀釋。稀釋后濃度分別為2.5、1.5、0.5、0.1 EU/mL，作為線性標(biāo)準(zhǔn)溶液。

根據(jù)供試品的內(nèi)毒素限值確定其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)。對(duì)于原液，選定稀釋倍數(shù)為30。

2.2.2 試液加入

分別取100 μL 檢查用水、線性標(biāo)準(zhǔn)溶液、稀釋后的樣品加入96 孔無菌酶標(biāo)板相應(yīng)孔中，每組做2復(fù)孔。檢測(cè)樣品均設(shè)置加標(biāo)樣品組，向100 μL 稀釋后的樣品中加入10 μL 濃度為5 EU/mL 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，同步做2 復(fù)孔。

將加樣后的酶標(biāo)板放置在37 ℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱15 min。將試劑盒中的熒光底物溶液、測(cè)定緩沖液和重組C 因子酶溶液按照5∶4∶1 的比例混合后按照100 μL/孔的量加入檢測(cè)孔中。加入底物試劑后將酶標(biāo)板放置在37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)1 h。分別在0 h 和1 h 時(shí)讀取熒光值。酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為380 nm 和440 nm，熒光增益強(qiáng)度設(shè)為中等，每個(gè)孔掃描6 次。

2.2.3 結(jié)果分析

線性標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的熒光信號(hào)值均扣去陰性對(duì)照信號(hào)值以排除本底干擾，得到相對(duì)熒光信號(hào)值（Relative Fluorescence Unit，RFU）。以線性標(biāo)準(zhǔn)溶液的凈相對(duì)信號(hào)的對(duì)數(shù)值logδRFU 為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，擬合線性方程如下。線性相關(guān)系數(shù)r 不應(yīng)小于0.950。

通過擬合的線性方程計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，回收率在50%～200%范圍內(nèi)就可判定供試品對(duì)檢測(cè)無干擾。計(jì)算加標(biāo)回收合格的稀釋后供試品溶液的內(nèi)毒素含量，再根據(jù)稀釋倍數(shù)計(jì)算未稀釋的供試品中內(nèi)毒素含量。

2.3 重組C 因子法驗(yàn)證

2.3.1 專屬性

鱟試劑凝集系統(tǒng)中存在G 因子反應(yīng)旁路，可以被β-葡聚糖激活產(chǎn)生細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的“假陽(yáng)性”，因此會(huì)干擾凝膠法的專屬性。所以還需考察β-葡聚糖是否會(huì)對(duì)重組C 因子法也產(chǎn)生干擾，對(duì)此，本研究制備0.1 μg/mL 的β-葡聚糖溶液進(jìn)行重組C 因子法檢測(cè)，并計(jì)算相應(yīng)的加標(biāo)回收率。

該方法下并未檢出β-葡聚糖，加標(biāo)回收率為71.4%，滿足回收率要求。結(jié)果表明重組C 因子法專屬性強(qiáng)，C 因子未與β-葡聚糖發(fā)生交叉反應(yīng)。

2.3.2 線性

配制系列濃度為2.5、1.5、0.5、0.1 EU/mL 的內(nèi)毒素線性標(biāo)準(zhǔn)溶液開展重組C 因子法檢測(cè)。以logδRFU 為縱坐標(biāo)，內(nèi)毒素濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸并分析其相關(guān)系數(shù)。重復(fù)線性實(shí)驗(yàn)3 次，3 次的相關(guān)系數(shù)r 均需滿足不小于0.950 的要求。結(jié)果表明內(nèi)毒素含量在0.1～2.5 EU/mL 范圍內(nèi)時(shí)，該方法的線性關(guān)系良好。

2.3.3 準(zhǔn)確度

平行制備0.5、1.0、1.5 EU/mL 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3 份進(jìn)行檢測(cè)。代入線性方程中計(jì)算內(nèi)毒素含量，將內(nèi)毒素含量實(shí)測(cè)值與理論值進(jìn)行比較計(jì)算回收率。計(jì)算得到0.5 EU/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的回收率為88%～120%；1.0 EU/mL 的回收率為88%～97%；1.5 EU/mL 的回收率為97%～104%。結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

2.3.4 精密度

由2 位實(shí)驗(yàn)人員于不同日期分別平行制備0.5、1.0、1.5 EU/mL 的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3 份進(jìn)行檢測(cè)。代入線性方程中計(jì)算內(nèi)毒素含量。實(shí)驗(yàn)人員1 測(cè)得的3 種濃度內(nèi)毒素含量的SRSD作為重復(fù)性結(jié)果，SRSD均不超過15.7%。2 實(shí)驗(yàn)人員測(cè)得的3 種濃度6次結(jié)果的SRSD均在24.2%～32.7%之間。結(jié)果表明該方法的精密度良好。

2.3.5 耐用性

反應(yīng)時(shí)間出現(xiàn)微小波動(dòng)（57 min 和63 min）時(shí)測(cè)得1.0 EU/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液內(nèi)毒素含量的SRSD為12.1%。2 個(gè)批次試劑盒檢測(cè)3 份1.0 EU/mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液共6 次結(jié)果的SRSD為8.3%。表明該方法耐用性較強(qiáng)。

2.4 內(nèi)毒素檢測(cè)

分別采用兩種方法對(duì)20211102 批原液進(jìn)行內(nèi)毒素檢查。凝膠法測(cè)得原液符合低于15 EU/mL 的內(nèi)毒素限定標(biāo)準(zhǔn)。重組C 因子法測(cè)得原液內(nèi)毒素含量為3.9 EU/mL。相比于凝膠法，重組C 因子法可以給出定量結(jié)果。

3 討論

藥品中含有大量的內(nèi)毒素會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重的危害，因此檢測(cè)內(nèi)毒素含量是包括雙特異性抗體在內(nèi)的生物制品質(zhì)量控制的重要環(huán)節(jié)。鑒于對(duì)鱟資源的保護(hù)和凝膠法的專屬性，重組C 因子法越來越有替代凝膠法的趨勢(shì)。市面上試劑盒種類繁多，如何基于項(xiàng)目特性和現(xiàn)有的儀器狀態(tài)建立穩(wěn)健的重組C因子法需要進(jìn)行進(jìn)一步探究。

本研究針對(duì)雙特異性抗體藥物建立了重組C因子內(nèi)毒素檢查法，經(jīng)驗(yàn)證該方法具有可實(shí)用性。重組C 因子法對(duì)β 葡聚糖無反應(yīng)，同時(shí)線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度和耐用性均能夠符合要求。2 種方法的內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果表明重組C 因子法可以作為定量法準(zhǔn)確提供內(nèi)毒素含量，更利于研發(fā)團(tuán)隊(duì)對(duì)內(nèi)毒素水平進(jìn)行控制。

綜上所述，本文建立的方法適用于雙特異性抗體藥物的內(nèi)毒素定量檢測(cè)，對(duì)其他抗體藥的重組C因子檢查法的建立具有借鑒意義。