趙麗芳,于曉菲,滕龍,齊云,劉鵬飛,侯斌,張娟*

(1.山東省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院,山東 濟南 250100; 2.山東省環(huán)科院環(huán)境工程有限公司,山東 濟南 250109;3.濱州市檢驗檢測中心,山東 濱州 256600)

對腫瘤標志物的高靈敏度、高準確度的檢測是目前癌癥診斷的重要課題。該領域采用各種技術和檢測方法來實現(xiàn)腫瘤標志物的快速、靈敏、準確的檢測,包括酶聯(lián)免疫吸附試驗法、表面等離子體共振法、石英晶體微平衡法、各種發(fā)光和熒光技術等。然而,這些技術和方法通常需要復雜的樣品處理過程,耗時長,不能滿足日益增長的快速檢測的需求。因此,亟需開發(fā)一個簡單、可靠的技術和方法。這一需求在超低濃度的生物標志物檢測方面尤為明顯,如甲胎蛋白的檢測。

免疫傳感器以抗原或抗體作為敏感元件,能夠?qū)崿F(xiàn)傳感與換能的同步進行,可以達到定量的監(jiān)測,也能夠?qū)崿F(xiàn)對傳感器界面反應的實時監(jiān)測。免疫傳感器的結(jié)構(gòu)與其他生物傳感器相類似,主要是由接收器、轉(zhuǎn)換器和電子放大器三部分組成的[1]。免疫傳感器的敏感元件是抗原、抗體,將抗原或抗體固定在載體表面用以構(gòu)建敏感膜,即傳感器的敏感膜[2]?？乖c抗體在敏感膜上特異性結(jié)合產(chǎn)生信號,這些信號被傳送到轉(zhuǎn)換器。通過轉(zhuǎn)換器的轉(zhuǎn)化將接收到的信號轉(zhuǎn)化為電信號,同時進行信號的放大和數(shù)字化[3]。免疫傳感器是可以將輸出結(jié)果數(shù)字化的精密換能器,它在達到定量檢測的同時,也能夠?qū)崿F(xiàn)傳感器表面抗原-抗體反應的實時監(jiān)測,這對免疫反應動力學分析是非常有利的[4]。

電化學免疫傳感器則是指由抗原或抗體為敏感元件,電極作為轉(zhuǎn)換元件,以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器[5]。目前大量的電化學免疫傳感已應用在生物技術、食品工業(yè)、臨床檢測、醫(yī)藥工業(yè)、生物醫(yī)學、環(huán)境分析等領域[6-10]。

為了構(gòu)建免疫傳感器,酶通常被固定在電極表面,作為催化活性位點以產(chǎn)生信號,在使用免疫傳感器時,必須考慮到酶的實際穩(wěn)定性和復雜的預處理過程。而酶的穩(wěn)定性受環(huán)境影響較大,因此無酶型免疫傳感器越來越受到人們的關注。

本文構(gòu)建了一種新的電化學免疫傳感器,能夠無酶檢測甲胎蛋白(AFP)。利用金@鉑納米粒子和氨基化石墨烯的作用替代傳統(tǒng)的過氧化氫酶,進行無酶檢測。本方案中,以氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子修飾電極表面,氨基化石墨烯具有良好的導電性和電催化活性,能夠促進材料與電極間的電子轉(zhuǎn)移,改善電極的性能;金@鉑納米粒子對過氧化氫具有高催化性能,可以實現(xiàn)對甲胎蛋白(AFP)的快速檢測。本研究的目的是證明利用這種新穎、簡單的設計,可以開發(fā)出無酶、快速、可靠的電化學免疫傳感器。

1 試驗部分

1.1 試劑和儀器

氯金酸(HAuCl4)、氯鉑酸(H2PtCl6),均購于國藥集團化學試劑(北京)有限公司。石墨粉于飛世爾科學公司購買。其他化學試劑均為分析純或更高質(zhì)量等級,均購于國藥集團化學試劑(北京)有限公司。

所有電化學測量均在CHI760D電化學工作站(上海辰華儀器有限公司)上進行。透射電鏡(TEM)由H-800透射掃描電鏡(日本)獲得。

1.2 氨基化石墨烯的合成

該方法采用Hummers法[11]制備氧化石墨烯(GO),然后用三聚氰胺對氧化石墨烯進行還原處理[12]。

將0.6 g的石墨粉和3.6 g高錳酸鉀混合,放入帶有磁子的500 mL的三口瓶中,將360 mL∶40 mL(9∶1,體積比)濃硫酸和磷酸的混合液加入以上三口瓶中,冷卻至30～40 ℃,將三口瓶放入油浴,加熱到50 ℃,反應12 h。反應結(jié)束,將樣品倒入到40 mL的冰上,將磁子放入冰水混合物上,加入300 μL的過氧化氫,磁力攪拌0.5 h。反應結(jié)束后,得到的混合物在8 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心0.5 h,然后分別用30 mL 0.2 mol·L-1的鹽酸、乙醇分別離心洗滌三次,棄去上清液。最后用乙醚離心洗滌,干燥24 h,制得棕黃色固體粉末為氧化石墨烯。

稱取0.15 g氧化石墨烯,加水50 mL,超聲20 min得到均勻氧化石墨烯水溶液(3 mg/mL),將25 mg三聚氰胺加入至水溶液中,60 ℃油浴,攪拌反應1 h。反應結(jié)束將反應液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯反應釜中,200 ℃反應5 h。將反應釜冷卻至室溫,離心洗滌黑色反應物三次。在氬氣氛圍中850 ℃煅燒3 h,制得氨基化石墨烯納米材料。

1.3 金@鉑納米粒子的制備

將1 mL 10 mg/mL PVA溶液與190 mL 0.25 mmol/L HAuCl4溶液混合,劇烈攪拌2 h后,滴加11 mL 0.1 mol/L新配制得檸檬酸三鈉溶液,攪拌反應2 h,生成金膠體[13]。

將1.5 mL 20 mmol/L H2PtCl6逐滴加入到制得的金膠體溶液中,并攪拌。將10 mmol/L的抗壞血酸溶液在4 ℃條件下緩慢加入上述溶液中,混合物的顏色在幾分鐘內(nèi)會變成黑色。加入抗壞血酸溶液后,連續(xù)攪拌30 min。將得到的溶液離心并用水洗滌三次[14]。將制備的金@鉑納米粒子分散至10 mL超純水中,超聲30 min,備用。

1.4 氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的制備

稱取3.6 mg制備的氨基化石墨烯,溶于5 mL超純水中超聲60 min后,加入2 mL金@鉑納米粒子溶液,振蕩3 h,使氨基化石墨烯表面固載金@鉑納米粒子,將得到的溶液離心并用水洗滌三次。最后將氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料分散至2 mL超純水中,超聲30 min,備用。

1.5 電化學免疫傳感器的制備

用Al2O3粉末拋光直徑為4 mm玻碳電極,用超純水沖洗干凈電極表面。將6 μL氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料溶液滴涂在電極表面,在4 ℃條件下晾干。然后依次在電極上滴加甲胎蛋白抗體(Ab1)溶液、牛血清白蛋白(BSA)溶液、甲胎蛋白抗原(Ag)溶液,孵化4 h,并用磷酸鹽緩沖溶液清洗干凈,即制得一種用于甲胎蛋白檢測的無酶型電化學免疫傳感器。

1.6 腫瘤標志物甲胎蛋白的測定

使用的電化學工作站為三電極體系,即參比電極、對電極和工作電極。在電解池中加入10 mL的磷酸鹽緩沖溶液(含H2O25 mmol/L),采循環(huán)伏安法或差分脈沖法測定。

設定電位范圍為-0.2～0.6 V,采用差分脈沖法測定工作電極對不同濃度的甲胎蛋白的電流響應;根據(jù)所得電流響應與甲胎蛋白溶液濃度的關系,繪制工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 材料的表征

圖1氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的透射電鏡圖像,顯示制備的氨基化石墨烯片為單層薄片狀,表面有大量的褶皺,使其比表面積增大;金@鉑納米粒子直徑約為10 nm,尺寸均勻,且均勻地分散在氨基化石墨烯表面。

圖1 氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的透射電鏡圖

2.2 電化學免疫傳感器條件的優(yōu)化

在該無酶型電化學免疫傳感器的構(gòu)建和工作過程中,為了測試構(gòu)建的無酶型電化學免疫傳感器的性能,對傳感器的實驗條件進行優(yōu)化。對于催化過程,緩沖溶液的pH值和基底材料氨基化石墨烯的濃度對檢測結(jié)果都有很大的影響,其實驗結(jié)果如圖2所示。圖2(A)中曲線表示的是在不同pH值條件下,構(gòu)建的無酶型電化學免疫傳感器對同一濃度的甲胎蛋白測定的結(jié)果,顯示7.0為最優(yōu)pH值條件;圖2(B)為使用不同濃度氨基化石墨烯構(gòu)建的無酶型電化學免疫傳感器對同一濃度的甲胎蛋白測定的結(jié)果,氨基化石墨烯溶液質(zhì)量濃度為1.8 mg/mL時,反應最為靈敏。當氨基化石墨烯濃度過低時,電子傳輸能力不夠,同時金@鉑納米粒子負載量少,導致催化性能低,電信號放大效應不明顯;氨基化石墨烯濃度過高時,在電極表面構(gòu)成的導電膜過厚,阻礙電子傳遞,導致信號降低。

圖2 (A)緩沖溶液pH值和(B)氨基化石墨烯溶液濃度對檢測結(jié)果的影響

2.3 電化學免疫傳感器的電化學表征

為了驗證電化學免疫傳感器的構(gòu)建過程,使用循環(huán)伏安曲線對構(gòu)建傳感器過程中電極的界面結(jié)構(gòu)信息進行表征,進一步說明修飾過程。圖3為把不同材料滴加在玻碳電極上進行免疫傳感器構(gòu)建,測定各修飾過程的循環(huán)伏安曲線圖,所用電解液為pH值7.0的磷酸鹽緩沖溶液(含H2O25 mmol/L)的溶液。

(a)氨基化石墨烯;(b)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料;(c)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料+Ab1;(d)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料+Ab1+BSA;(e)氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料+Ab1+BSA+Ag。

從圖中各曲線可以看出,隨著電極表面的層層修飾,H2O2的氧化還原電流值相應發(fā)生變化。圖中a曲線表示的是裸玻碳電極的循環(huán)伏安曲線。圖中b曲線為修飾上一層氨基化石墨烯-金@鉑納米粒子復合材料的循環(huán)伏安曲線,由于氨基化石墨烯具有良好的電子傳遞能力,金@鉑納米粒子對H2O2具有較強的催化性能,因此氧化還原峰值電流增大。圖中c曲線為修飾上一層Ab1以后的循環(huán)伏安曲線,氧化還原峰值電流較b曲線減小,原因是抗體不具有電化學活性,在一定程度上阻礙了電子的傳遞。接著,在已經(jīng)修飾的電極表面加入BSA,封閉電極上的非特異性結(jié)合位點,圖中d曲線氧化還原峰值電流值明顯減小。當將甲胎蛋白抗原(AFP)固定到電極表面后的氧化還原峰值電流值(e曲線)進一步減小,這說明蛋白類阻礙電子的傳遞,也進一步驗證了該傳感器構(gòu)建成功。

2.4 甲胎蛋白的電化學免疫分

在最佳條件下,隨著甲胎蛋白(AFP)濃度的增加,催化電流值減小,由電流值對AFP的濃度作圖,發(fā)現(xiàn)AFP質(zhì)量濃度在0.000 1～10 pg·mL-1范圍內(nèi)都能呈現(xiàn)出良好的線性關系(圖4),檢出限為0.000 03 pg·mL-1(S/N=3),相關數(shù)據(jù)列于表1。

表1 工作曲線數(shù)據(jù)

圖4 (A)不同濃度甲胎蛋白的檢測曲線圖和(B)電化學免疫傳感器的工作標準曲線

2.5 甲胎蛋白電化學免疫傳感器的重現(xiàn)性

利用無酶型電化學免疫傳感器對質(zhì)量濃度0.001 pg·mL的AFP進行測試,平行做5個相同濃度的同時檢測,研究了構(gòu)建的無酶型電化學免疫傳感器的重現(xiàn)性(圖5)。對所得數(shù)據(jù)進行計算,通過計算得到5次平行測定的相對標準偏差為3.6%,在5%以內(nèi),說明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性。

圖5 無酶型電化學免疫傳感器的重現(xiàn)性研究

3 結(jié)論

以氨基化石墨烯作為電極基底材料,金@鉑納米粒子替代傳統(tǒng)的過氧化氫酶為催化因子,利用抗原-抗體的特異性免疫反應構(gòu)建了無酶型電化學免疫傳感器,并對其性能進行了詳細研究。選用常見腫瘤標志物甲胎蛋白的模型,驗證了構(gòu)建的無酶型電化學免疫傳感器的應用性能。該傳感器具有對甲胎蛋白響應迅速、檢測限較低、靈敏度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,為設計其他腫瘤標志物的無酶檢測提供了一種思路。