劉飛飛 申友奎 陶開亮 張言濤

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是指因各種原因引起的顱腦損傷性病變[1]。在TBI 后的病理級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，炎癥反應(yīng)與繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)；而星形膠質(zhì)細(xì)胞在TBI 后炎癥反應(yīng)過程中扮演著重要角色，在這一過程中調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能可以提高TBI 患者的生存率，改善患者的預(yù)后[2]。IL-33 屬于IL 超家族成員之一，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。腫瘤發(fā)生抑制蛋白（suppressor of tumourigenicity，ST）2 是IL-33的特異性受體。IL-33 與ST2 結(jié)合后啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，從而促進(jìn)炎癥因子的釋放[3]。既往研究發(fā)現(xiàn)，血清IL-33 水平與TBI 嚴(yán)重程度、炎癥反應(yīng)程度和預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，血清IL-33 可能是一種反映TBI 嚴(yán)重程度和臨床預(yù)后的炎癥標(biāo)志物[4]。蛛網(wǎng)膜下腔出血后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)IL-33 表達(dá)水平升高，進(jìn)而增強(qiáng)下游炎癥因子IL-1β、TNF-α 轉(zhuǎn)錄水平[5]。由此推測，IL-33 在TBI 后星形膠質(zhì)細(xì)胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)過程中亦起著重要作用。藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，通竅活血湯可以抑制TBI 后的炎癥反應(yīng)，減輕腦水腫，提高TBI 患者的生存率[6]。但是，目前關(guān)于通竅活血湯對TBI 后星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)IL-33 表達(dá)和IL-33/ST2 信號(hào)通路影響的研究不多?？紤]到與中藥含藥血清相比，中藥含藥腦脊液可以避免血清中復(fù)雜成分的干擾，排除不能通過血腦屏障的成分，增加效應(yīng)成分作用的針對性，故本研究利用機(jī)械性損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞模擬TBI 的基本病理過程，探討通竅活血湯含藥腦脊液（Tongqiao Huoxue Decoction-containing cerebrospinal fluid，TQHXD-CSF）對星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后炎癥反應(yīng)的影響以及其調(diào)控IL-33/ST2 信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制，為通竅活血湯的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 無特定病原體的雄性SD 大鼠20 只，體重250～300 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2013-0018]。飼養(yǎng)條件：恒溫，溫度（22±2）℃，濕度50%～60%，每12 h明暗交替，通風(fēng)15～20 次/h，大鼠自由攝食、飲水。星形膠質(zhì)細(xì)胞株（批號(hào)：RAT-iCell-n009）由賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司提供。本研究經(jīng)杭州鷹旸生物醫(yī)藥研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：202107-2901）。

1.2 藥物與試劑 通竅活血湯中的川芎、紅花、赤芍、桃仁、生姜、蔥、紅棗由浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬杭州市中醫(yī)院藥劑科提供，麝香購自杭州方回春堂集團(tuán)有限公司；FBS（批號(hào)：11011-8615）購自浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶（批號(hào)：SH30042.01）、DMEM（批號(hào)：SH30243.01）均購自美國Hyclone 公司；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑盒（批號(hào)：E606334-0500）、10%APS（批號(hào)：A600072-0025）均購自上海BBI Life Sciences 公司；IL-33 ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-61461R1）、IL-1β ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0047R1）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-0181R1）、跨膜型ST2（transmembrane ST2，ST2L）ELISA 試劑盒（批號(hào)：MM-70539R1）均購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；RIPA裂解液（批號(hào)：P0013D）、PMSF（批號(hào)：ST506）均購自碧云天生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑（批號(hào)60237）購自康為世紀(jì)生物科技股份有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒（批號(hào)：pc0020）、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)（批號(hào)：PR1910）均購自北京索萊寶公司；30%丙烯酰胺（批號(hào)：BL513B）、三羥甲基氨基甲烷（批號(hào)：BL516A、BL514A）購自安徽白鯊公司；牛血清白蛋白（批號(hào)：4240GR100）購自廣州賽國生物科技有限公司；聚偏氟乙烯膜（批號(hào)：10600023）購自美國GE Healthcare Life公司；IL-33 抗體（批號(hào)：ab207737）購自美國Abcam 公司；ST2L 抗體（批號(hào)：60112-1-Ig）購自武漢proteintech公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)：AF7021）購自美國Affinity 公司；總RNA 抽提試劑盒（批號(hào)B511311）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；qRT-PCR 檢測試劑盒（批號(hào)：RR820A）購自日本Takara公司；miRcute 增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號(hào)：KR211）購自天根生化科技有限公司。

1.3 儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：BB150）、低溫高速離心機(jī)（型號(hào)：Micro17R）均購自美國Thermo 公司；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)AE2000）購自德國Motic 公司；倒置熒光顯微鏡（型號(hào)：Ts2-FC）購自日本尼康公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：CMaxPlus）購自美國MD 公司；電泳儀（型號(hào)：EPS300）、電泳槽（型號(hào)：VE 180C）、轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：VE186）均購自天能公司；化學(xué)發(fā)光儀（型號(hào)：610020-9Q）購自勤翔公司；PCR 儀（型號(hào)：Mastercycler）購自德國Eppendorf 公司；mRNA 定量儀（型號(hào)：Nanodrop one）購自美國Thermo Scientific 公司；qRT-PCR 儀（型號(hào)：CFX Connect）購自美國Bio-Rad 公司。

1.4 方法

1.4.1 TQHXD-CSF 及正常腦脊液的制備 將20只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為給藥組和正常組，每組10只，分別制備TQHXD-CSF及正常腦脊液。TQHXD-CSF的制備方法參考文獻(xiàn)[7]。給藥組大鼠按3 mL/kg劑量灌胃通竅活血湯，早晚各1次，連續(xù)5 d；正常組大鼠按3 mL/kg劑量灌胃0.9%氯化鈉溶液，早晚各1 次，連續(xù)5 d。兩組大鼠末次給藥后1.5 h，肌肉注射戊巴比妥鈉（劑量50 mg/kg）麻醉，頸后剃毛并碘伏消毒，切開皮膚后鈍性分離肌肉層，用1 mL無菌注射器由枕骨大孔刺入延髓池抽取腦脊液。4 ℃、3 000 r/min 離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，-20 ℃條件下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 細(xì)胞分組與處理 將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為正常組和機(jī)械性損傷組（3、6、12、24、48 和72 h）。星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷模型的構(gòu)建參考文獻(xiàn)[8-9]：待細(xì)胞貼壁后，用10 μL 微量移液器槍頭作“#”字劃傷，劃傷道寬度1 mm，兩相鄰劃傷道間隔4 mm。盡可能使劃傷的速度、力度相同，以保證同一組內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷程度和范圍一致。劃傷后用PBS 清洗孔板上分離的細(xì)胞，換新的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；正常組為無機(jī)械性損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞。另取星形膠質(zhì)細(xì)胞分為空白組（完全細(xì)胞培養(yǎng)基）、腦脊液對照組（含5%、10%、20%、40%正常腦脊液）和TQHXD-CSF組（含5%、10%、20%、40% TQHXD-CSF），確定TQHXD-CSF 最佳給藥濃度為20%。再另取星形膠質(zhì)細(xì)胞分為正常組（含20%正常腦脊液）、模型組（含20%正常腦脊液）、TQHXD-CSF 組（含20%TQHXD-CSF）和ST2L 中和抗體+TQHXD-CSF 組（含20%TQHXD-CSF+5、10、20 μg/mL ST2L 中和抗體）；除正常組外，其余各組均按照星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷模型構(gòu)建方法處理細(xì)胞。

1.4.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)觀察 收集各組處理后的細(xì)胞，置于倒置顯微鏡下觀察各時(shí)點(diǎn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.4.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞活性檢測 采用MTT 法。收集各組處理后的細(xì)胞，每孔加入10 μL MTT 染液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。使用酶標(biāo)儀測定各時(shí)點(diǎn)450 nm 處的光密度值，即細(xì)胞活性。

1.4.5 星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平檢測 采用ELISA 法。收集各組處理后的細(xì)胞，通過反復(fù)凍融破壞細(xì)胞并放出細(xì)胞內(nèi)成分，2 500 r/min 離心20 min，留取上清液。使用ELISA 試劑盒檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液IL-33、IL-1β、TGF-β1和ST2L 水平。

1.4.6 星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-33、ST2L 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。收集各組處理后的細(xì)胞，經(jīng)裂解、離心后，提取蛋白。采用BCA 法定量并調(diào)整各組蛋白濃度。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，并電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入對一抗（IL-33 為1∶1 000，ST2L 為1∶1 000，GAPDH 為1∶500）孵育12 h。經(jīng)緩沖液漂洗后，加入HRP 標(biāo)記的二抗（1∶5 000），37 ℃孵育2 h。再次緩沖液漂洗后用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，使用凝膠成像儀進(jìn)行灰度值分析，即IL-33、ST2L 蛋白表達(dá)水平。

1.4.7 星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-33、ST2L mRNA 表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR 法。收集各組處理后的細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，測定RNA含量和純度。配制相應(yīng)反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)條件：42 ℃15 min，85 ℃5 min。配制相應(yīng)反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列見表1；反應(yīng)條件：95 ℃10 min變性，95 ℃15 s；60 ℃60 s；共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算IL-33、ST2L mRNA 表達(dá)水平。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Graph-Pad Prism 8.0 繪圖軟件。計(jì)量資料多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化及活性比較 正常組星形膠質(zhì)細(xì)胞生長狀態(tài)良好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞密度逐漸增加，胞體形態(tài)多樣，細(xì)胞突起之間相互連接形成網(wǎng)絡(luò)。機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后3 h，損傷邊緣區(qū)細(xì)胞反應(yīng)性膠質(zhì)化，細(xì)胞體積增大，突起結(jié)構(gòu)消失；損傷后6 h，胞體向空白區(qū)域伸出纖長的突起；損傷后12 h，損傷邊緣區(qū)細(xì)胞開始向損傷處生長；隨著損傷后時(shí)間的延長，損傷區(qū)細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞胞體肥大，粗大的突起交織成網(wǎng)，見圖1（插頁）。機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后6、12、24、48、72 h 細(xì)胞活性均明顯低于正常組（均P＜0.05），且以損傷后6 h 細(xì)胞活性下降最明顯（均P＜0.05），見圖2。以上結(jié)果提示造模成功，機(jī)械性損傷導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)反應(yīng)性改變。

圖1 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)變化

圖2 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞活性比較

2.2 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平比較 機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后3、6、12、24、48、72 h IL-33、ST2L、IL-1β 水平均明顯高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），且以損傷后12 h 升高最明顯；損傷后3 h TGF-β1 水平明顯高于正常組，但損傷后6、12、24、48、72 h TGF-β1 水平均明顯低于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平比較

2.3 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達(dá)水平比較 機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后3、6、12、24、48、72 h IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達(dá)水平均明顯高于正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與損傷后3 h 比較，機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷后12 h IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05），損傷后72 h IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達(dá)水平均明顯降低（均P＜0.05），見圖4-5。

圖4 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-33、ST2L 蛋白表達(dá)水平比較（A：電泳圖；B：柱狀圖）

圖5 正常組和機(jī)械性損傷組星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-33、ST2L mRNA 表達(dá)水平比較

2.4 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響 使用不同濃度TQHXD-CSF 處理星形膠質(zhì)細(xì)胞24 h，檢測TQHXD-CSF 在細(xì)胞中作用的安全濃度。與空白組比較，5%、10%濃度的正常腦脊液和TQHXD-CSF 對細(xì)胞增殖的影響比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）；當(dāng)濃度為20%時(shí)，腦脊液對照組和TQHXD-CSF 組細(xì)胞活性較空白組均明顯升高，且TQHXD-CSF 組明顯高于腦脊液對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；當(dāng)濃度為40%時(shí)，腦脊液對照組細(xì)胞活性較空白組明顯升高，TQHXD-CSF 組明顯低于腦脊液對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)以20%作為TQHXD-CSF 最佳給藥濃度。

圖6 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

2.5 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后細(xì)胞形態(tài)及活性的影響 與正常組比較，模型組細(xì)胞密度稀疏、胞體增大且突起結(jié)構(gòu)消失；與模型組比較，TQHXD-CSF 組細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)由不規(guī)則形轉(zhuǎn)變?yōu)槿切位驁A形，細(xì)胞間連接相對緊湊，見圖7（插頁）。與正常組比較，模型組細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，TQHXD-CSF 組細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01），見圖8。

圖8 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后細(xì)胞活性的影響

2.6 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后炎癥反應(yīng)和IL-33/ST2 信號(hào)通路的影響 與模型組比較，TQHXD-CSF 組IL-33、IL-1β、ST2L 水平以及IL-33、ST2L mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，TGF-β1水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與TQHXD-CSF 組比較，ST2L 中和抗體（5、10、20 μg/mL）+TQHXD-CSF 組IL-1β 水平均明顯降低，ST2L 中和抗體（10、20 μg/mL）+TQHXD-CSF 組TGF-β1水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖9-10。

圖9 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后IL-33、IL-1β、TGF-β1 及ST2L 水平的影響

圖10 TQHXD-CSF 對星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后IL-33、ST2L 蛋白及mRNA 表達(dá)水平的影響（A：IL-33、ST2L 蛋白表達(dá)的電泳圖；B、C：IL-33、ST2L 蛋白表達(dá)水平比較；D、E：IL-33、ST2L mRNA 表達(dá)水平比較）

3 討論

在全球范圍內(nèi)，TBI 仍是目前造成創(chuàng)傷相關(guān)死亡和殘疾的三大病因之一[10]。TBI 后的炎癥反應(yīng)不僅會(huì)在急性期加重繼發(fā)性腦損傷，還會(huì)增加晚發(fā)的阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮側(cè)索硬化癥等神經(jīng)退行性疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。然而，臨床上對于TBI 后的炎癥反應(yīng)仍缺乏有效的治療策略。因此，積極探索調(diào)控TBI后炎癥反應(yīng)的有效措施，將有助于改善TBI 的療效。

星形膠質(zhì)細(xì)胞約占腦內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的90%，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和損傷的關(guān)鍵反應(yīng)細(xì)胞。在生理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過糖異生為神經(jīng)元提供代謝和神經(jīng)營養(yǎng)支持，同時(shí)在突觸功能的調(diào)節(jié)和維持血腦屏障穩(wěn)定性等方面亦發(fā)揮重要作用。此外，星形膠質(zhì)細(xì)胞還參與腦血流的調(diào)節(jié)[12]、生物鐘的調(diào)節(jié)[13]以及神經(jīng)遞質(zhì)的攝取、釋放[14]等過程。TBI 后星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)向激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變，成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，表現(xiàn)出細(xì)胞肥大、纖維酸性蛋白表達(dá)上調(diào)、分泌炎性因子和趨化因子等特性[15]。根據(jù)TBI 的損傷程度、病理階段和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的類型，星形膠質(zhì)細(xì)胞在TBI 后繼發(fā)性腦損傷和組織修復(fù)中發(fā)揮不同作用。一方面，活化的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放TNF、IL-1α、IL-1β 等促炎細(xì)胞因子，從而加重腦水腫，加速神經(jīng)元死亡；另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過分泌抗炎因子IL-10、TGF-β1 和上調(diào)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)等，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)元存活和突觸修復(fù)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)脂多糖誘導(dǎo)活化后可表達(dá)IL-33 并激活下游相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路[17]。在體內(nèi)，IL-33 與膜受體ST2L 結(jié)合后觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)TBI 后小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的募集[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著機(jī)械性損傷后培養(yǎng)時(shí)間的延長，星形膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)典型的反應(yīng)性增生改變，IL-33、ST2L 和促炎因子IL-1β 水平持續(xù)升高，而抗炎因子TGF-β1水平在短暫升高后持續(xù)降低，這說明星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷模型能夠模擬TBI 后星形膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)變化。因此，調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能，使其發(fā)揮抗炎作用而減少促炎因子的釋放，可能為治療TBI 提供新的思路和靶點(diǎn)。

通竅活血湯具有活血化瘀、通竅活絡(luò)的功效。該方劑中的麝香芳香開竅，為君藥；桃仁破血行滯潤燥，紅花活血化瘀止痛，赤芍清熱活血，川芎行血活血，均為臣藥；佐以生姜、大棗調(diào)和營衛(wèi)、通利血脈；蔥為使藥，載藥上行，通陽入絡(luò)。由于通竅活血湯在體內(nèi)具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)、多系統(tǒng)的治療特點(diǎn)，且由于血腦屏障的存在，通竅活血湯的神經(jīng)保護(hù)作用與其在腦內(nèi)的有效成分關(guān)系較大，而目前關(guān)于通竅活血湯治療TBI 的作用機(jī)制以及對TBI 后星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的具體作用和機(jī)制等均尚不明確。本研究作了相關(guān)探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度為20%的TQHXD-CSF 提高星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后細(xì)胞活性的能力最強(qiáng)。因此本研究選擇濃度為20%的TQHXD-CSF 作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示20%濃度的TQHXD-CSF 處理星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷模型后，能改善細(xì)胞形態(tài)，增強(qiáng)細(xì)胞活性，降低IL-33、ST2L、IL-1β 水平，提高TGF-β1水平。由此可見，TQHXD-CSF 能在星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后發(fā)揮抗炎效應(yīng)。研究表明，IL-33/ST2 信號(hào)通路參與心肌梗死、腫瘤、腦梗死等多種疾病的病理過程[19]。在TBI 小鼠模型中，IL-33/ST2 信號(hào)通路通過抑制自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[20]。為了分析TQHXD-CSF 是否通過IL-33/ST2 信號(hào)通路來抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后的炎癥反應(yīng)，本研究加入ST2L 中和抗體來抑制IL-33/ST2 信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ST2L 中和抗體能明顯增強(qiáng)TQHXD-CSF對IL-1β 的下調(diào)作用和對TGF-β1 的上調(diào)作用，這表明IL-33/ST2 信號(hào)通路可能參與星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后的炎癥反應(yīng)過程，提示TQHXD-CSF 的抗炎作用可能與抑制該信號(hào)通路有關(guān)，但具體機(jī)制仍需深入研究明確。

綜上所述，星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后IL-33、ST2L 及IL-1β 水平均明顯升高，TGF-β1 水平降低；而TQHXD-CSF 能改善星形膠質(zhì)細(xì)胞機(jī)械性損傷后的細(xì)胞形態(tài)，降低IL-33、ST2L 及IL-1β 水平，提高TGF-β1水平，其作用機(jī)制可能與負(fù)向調(diào)節(jié)IL-33/ST2 信號(hào)通路有關(guān)。