吳俊俊 李珍 李華銘 李春霞 朱偉琴 王宇芳

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是常見的慢性消化系統(tǒng)疾病之一。IBD 可發(fā)生在腸內(nèi)，也可發(fā)生在腸外，可能涉及多種器官系統(tǒng)，包括關(guān)節(jié)、皮膚、眼睛、肝臟、膽汁、肺、腎、免疫系統(tǒng)或血液系統(tǒng)等。胃腸道外器官的累及通常稱為IBD 的腸外表現(xiàn)，其發(fā)病率高達(dá)6%～47%[1]。近10 年來，關(guān)于外泌體與IBD 關(guān)系的研究較多，但其與IBD 合并皮膚損害關(guān)系的研究較少。目前，臨床上對于合并皮膚損害的IBD 診斷存在延誤現(xiàn)象，部分患者在IBD 診斷前就已經(jīng)出現(xiàn)皮膚損害，部分患者在IBD 診斷后出現(xiàn)皮膚損害。而診斷的延誤會(huì)導(dǎo)致治療的延誤，使患者的生活質(zhì)量降低，并造成更大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，迫切需要研究新的靶點(diǎn)來進(jìn)一步闡明該病的發(fā)病機(jī)制，為臨床精準(zhǔn)治療提供方向。外泌體攜帶著大量細(xì)胞特異的生物活性分子，如核酸、蛋白質(zhì)、脂類和糖類等，通過囊泡運(yùn)輸和向受體細(xì)胞運(yùn)送蛋白質(zhì)和核酸來調(diào)節(jié)多種病理生理途徑，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、動(dòng)脈粥樣硬化、腫瘤藥物抵抗、抗病毒等多種生理病理過程中發(fā)揮著重要作用[2]。近年來學(xué)者發(fā)現(xiàn)，M2B 巨噬細(xì)胞衍生的外泌體通過C-C 基序趨化因子1（C-C chemokine 1，CCL1）/CCR8 軸上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和IL-4 的水平，下調(diào)結(jié)腸炎相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-1β、和IL-17A 的水平，從而減輕誘導(dǎo)性結(jié)腸炎的嚴(yán)重程度[3]。在英夫利昔單抗治療IBD 的研究中，使用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測出了差異表達(dá)蛋白質(zhì)，為臨床治療提供了更多依據(jù)[4]。通過質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)組學(xué)適用于分子機(jī)制的研究，利用串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）的MS/MS 蛋白質(zhì)組學(xué)策略已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的一個(gè)重要策略，有助于鑒別并定量差異表達(dá)蛋白質(zhì)。因此，本研究基于TMT 蛋白質(zhì)組學(xué)分析IBD 合并皮膚損害患者的外泌體，進(jìn)一步闡明IBD 合并皮膚損害的發(fā)病機(jī)制，為其臨床診斷、靶向治療、預(yù)后轉(zhuǎn)歸判斷等提供依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取杭州市第三人民醫(yī)院2020 年1 月至2021 年12 月 收 治 的5 例IBD 以及5 例IBD 合并皮膚損害患者為研究對象，分別為IBD 組、IBD+皮膚損害組；另選取本院同期體檢的5 名年齡和性別匹配的健康志愿者為對照組。IBD 組男2 例，女3 例；年齡22～66（50±17）歲。IBD+皮膚損害組男3 例，女2 例；年齡48～64（61±8）歲；IBD 合并蕁麻疹2 例，IBD 合并濕疹2例，IBD 合并多形紅斑1 例；皮膚損害主要表現(xiàn)為皮疹、瘙癢，部分有脫屑。對照組男3 人，女2 人；年齡49～62（56±5）歲。3 組對象性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過（批準(zhǔn)文號(hào)：KL2018031），所有患者知情同意。

1.2 血清外泌體提取 采集入組對象清晨空腹肘靜脈血5 mL，4 ℃2 000 r/min離心10 min，取上清液于1.5 mL無RNA酶EP管中，-80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?80 ℃樣品進(jìn)行解凍，4 ℃13 500 r/min 離心15 min，取上清液，經(jīng)0.22 μM微孔濾膜過濾，使用Exo Quick Solution 外泌體提取試劑盒從血清中分離外泌體。

1.3 血清外泌體差異表達(dá)蛋白質(zhì)鑒定 采用BCA 法對外泌體蛋白質(zhì)進(jìn)行初步定量。加入蛋白酶抑制劑及尿素溶液（終濃度為8 mol/L）后，利用超聲進(jìn)行裂解，使用BCA 試劑盒測定蛋白濃度。在蛋白溶液中加入二硫蘇糖醇使其終濃度為5 mmol/L，56 ℃還原30 min。之后加入碘代乙酰胺使其終濃度為11 mmol/L，室溫、避光孵育15 min。最后將樣品的尿素濃度稀釋至低于2 mol/L。按1∶50 的質(zhì)量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，37 ℃酶解過夜。再以1∶100 的質(zhì)量比例（胰酶∶蛋白）加入胰酶，繼續(xù)酶解4 h。用0.5 mol/L TEAB 溶解肽段，根據(jù)TMT 試劑盒操作說明標(biāo)記肽段；使用高pH 反向HPLC 分離肽段，色譜柱為Agilent 300Extend C18（5 μm，4.6 mm×250 mm），流動(dòng)相梯度為8%～32%乙腈，60 min 分離60 個(gè)組分；隨后將肽段合并為14 個(gè)組分，真空冷凍干燥。肽段用液相色譜流動(dòng)相A 相0.1%（v/v）甲酸水溶液溶解后，使用EASY-nLC 1000超高效液相系統(tǒng)進(jìn)行分離。分離出的肽段經(jīng)由超高效液相系統(tǒng)分離后被注入NSI 離子源中進(jìn)行電離，再進(jìn)行Q Exactive Plus 質(zhì)譜分析。數(shù)據(jù)采集模式使用數(shù)據(jù)依賴型掃描程序，即在一級(jí)掃描后選擇信號(hào)強(qiáng)度最高的前20 肽段母離子依次進(jìn)入HCD 碰撞池使用28%的碎裂能量進(jìn)行碎裂，同樣依次進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析。

1.4 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 采用基因本論（gene ontology，GO）和京都基因和基因組數(shù)據(jù)庫（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）對IBD組與IBD+皮膚損害組差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。（1）GO 主要用于表述基因和基因產(chǎn)物的各種屬性分析，能從不同角度闡釋蛋白質(zhì)的生物學(xué)作用，主要包括生物進(jìn)程、細(xì)胞組成和分子功能等。（2）KEGG 是一個(gè)集合基因組、系統(tǒng)功能信息和化學(xué)的綜合性數(shù)據(jù)庫，主要用于基因組及其功能的系統(tǒng)分析，主要包括代謝通路、復(fù)合物、生化反應(yīng)等。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體差異表達(dá)蛋白質(zhì)的鑒定 通過質(zhì)譜分析共得到二級(jí)譜圖416 950 張，可利用的有效譜圖36 899 張，譜圖利用率為8.8%。通過譜圖解析鑒定肽段8 412 條，其中特異性肽段7 860 條。本研究共鑒定829 種蛋白質(zhì)，其中包含定量信息的蛋白質(zhì)726 種。與對照組比較，IBD 組有15 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，21 種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，見圖1A；IBD+皮膚損害組有24 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，25 種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，見圖1B；與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組有12 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)和8 種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，見圖1C。

圖1 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的火山圖（A：IBD 組比對照組；B：IBD+皮膚損害組比對照組；IBD+皮膚損害組比IBD 組）

2.2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO 分析結(jié)果 GO 分析顯示，IBD 組與對照組、IBD+皮膚損害組與對照組、IBD+皮膚損害組與IBD 組差異表達(dá)蛋白質(zhì)涉及的生物過程包括刺激反應(yīng)、細(xì)胞過程、單有機(jī)過程、生物調(diào)節(jié)等，細(xì)胞組成主要包括細(xì)胞、細(xì)胞膜外域、細(xì)胞器等，分子功能主要包括結(jié)合、催化活性等，見圖2。

圖2 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的GO 分析結(jié)果（A：IBD 組比對照組；B：IBD+皮膚損害組比對照組；C：IBD+皮膚損害組比IBD 組）

2.3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG 分析結(jié)果 KEGG 分析顯示，IBD 組與對照組差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞黏附、離子跨膜運(yùn)輸調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)分化等有關(guān)；IBD+皮膚損害組與對照組差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞分泌、細(xì)胞分解代謝、分泌調(diào)節(jié)有關(guān)；IBD+皮膚損害組與IBD組差異表達(dá)蛋白質(zhì)主要與細(xì)胞胺代謝、NIK/NF-κB 信號(hào)通路、細(xì)胞周期過程的負(fù)調(diào)控等有關(guān)，見圖3（插頁）。

圖3 差異表達(dá)蛋白質(zhì)的KEGG 分析結(jié)果（A：IBD 組比對照組；B：IBD+皮膚損害組比對照組；C：IBD+皮膚損害組比IBD 組）

3 討論

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的不斷提高，IBD 發(fā)病機(jī)制研究也在不斷深入，這為臨床精準(zhǔn)治療提供了新的方向。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，IBD 組有15種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，21 種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)；IBD+皮膚損害組有24 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，25 種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)；與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組有12 種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)和8 種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)。考慮到這些蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性可能在IBD 合并皮膚損害的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，故本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對這些差異表達(dá)蛋白質(zhì)作進(jìn)一步分析。IBD 的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，包括環(huán)境因素、遺傳易感性、基因和免疫因素等多個(gè)方面[5-7]。IBD 合并皮膚損害的患者會(huì)表現(xiàn)出不同于腸內(nèi)病變的病理學(xué)改變，可能是因?yàn)橹行粤＜?xì)胞功能異?；蚣?xì)胞免疫功能受損所致的。本研究GO 分析發(fā)現(xiàn)，與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組外泌體蛋白質(zhì)在刺激反應(yīng)、細(xì)胞過程及單有機(jī)過程等方面有著豐富的生物學(xué)功能，與目前臨床上對IBD 病理及生理學(xué)認(rèn)識(shí)是一致的。KEGG 分析發(fā)現(xiàn)，與IBD 組比較，IBD+皮膚損害組外泌體蛋白質(zhì)在細(xì)胞胺代謝、NIK/NF-κB 信號(hào)通路、細(xì)胞周期過程的負(fù)調(diào)控等方面有著豐富的生物學(xué)功能。某研究對結(jié)腸炎動(dòng)物模型進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，通過激活A(yù)MPK/核因子紅系2 相關(guān)因子2/血紅素加氧酶-1 通路可抑制高遷移率族群1/NF-κB級(jí)聯(lián)，增強(qiáng)結(jié)腸黏膜細(xì)胞的自噬和抑制凋亡，減輕結(jié)腸炎癥反應(yīng)[8]。促炎細(xì)胞可通過激活NK-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而激活一系列與免疫相關(guān)的基因。在多數(shù)細(xì)胞中，TNF 也可以殺死細(xì)胞，但NK-κB 的激活可以阻止TNF 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[9]。TNF 是一種促進(jìn)炎癥反應(yīng)并參與IBD 發(fā)病的細(xì)胞因子，與其他細(xì)胞和組織不同的是，腸上皮細(xì)胞在暴露于TNF 后會(huì)發(fā)生快速的細(xì)胞死亡，其具體機(jī)制尚不清楚。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TNF 介導(dǎo)的慢性IBD 的發(fā)病機(jī)制具有重要臨床意義[10]，目前通過抗TNF 治療IBD 也取得了良好的療效[11-12]。腸黏膜的另一個(gè)關(guān)鍵性調(diào)控信號(hào)通路是Wnt/β-catenin 信號(hào)通路，它在維持上皮干細(xì)胞功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。與IBD 組比較，本研究生物信息學(xué)分析顯示的IBD+皮膚損害組外泌體差異表達(dá)蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是一致的，這或許可以解釋IBD 合并皮膚損害患者自身免疫因素的重要性。從細(xì)胞學(xué)角度分析，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性也是非常重要的，這或許為將來靶向研究提供了方向。

綜上所述，本研究基于TMT 蛋白質(zhì)組學(xué)分析篩選出IBD+皮膚損害患者血清外泌體差異表達(dá)蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)參與IBD 合并皮膚損害的代謝相關(guān)通路及生物學(xué)功能。