劉夢(mèng)培, 王嶸, 李格, 張李兵, 縱偉, 黃琳

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,河南 鄭州 450002;2.好想你健康食品股份有限公司,河南 新鄭 451162;3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所,河南 鄭州 450003)

杜仲(Eucommiaulmoides)為杜仲科植物,單屬單種,是中國(guó)寶貴的藥食同源資源,具有很好的藥用價(jià)值與食用效益。目前,杜仲的皮、雄花和籽等研究較多[1],但產(chǎn)量最高、最有價(jià)值的副產(chǎn)物杜仲葉,卻得不到充分利用。研究表明,杜仲葉與杜仲皮的有效成分和藥理作用相似[2]。多糖作為杜仲葉中主要活性成分之一,具有免疫調(diào)節(jié)[3-4]、降血糖[5]、抗氧化[6]和抗腫瘤[7-8]等多種生物活性。SUN等[9]研究表明,杜仲葉多糖有利于調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫行為,并促進(jìn)免疫能力的增強(qiáng)。GAO等[10]研究發(fā)現(xiàn),杜仲葉多糖具有調(diào)節(jié)肝缺血再灌注損傷中的抗炎和抗氧化作用。不同品種杜仲葉的植物功效成分及生物活性具有一定差異,對(duì)不同品種杜仲葉的綜合開(kāi)發(fā)利用可有效提高杜仲產(chǎn)品附加值。目前,多糖常用提取技術(shù)包括熱水提取[11]、超聲輔助提取[12]、微波輔助提取[13]、生物酶提取[14]和超臨界提取等。傳統(tǒng)熱水提取具有提取時(shí)間長(zhǎng)、得率低等缺點(diǎn)。超聲輔助提取是利用空化作用和次級(jí)效應(yīng)破碎細(xì)胞壁促進(jìn)植物多糖提取,但熱效應(yīng)較低[15]。而微波輔助提取使細(xì)胞內(nèi)部極性分子在電磁波作用下振動(dòng)、摩擦,并迅速達(dá)到較高反應(yīng)溫度,使細(xì)胞內(nèi)的活性成分更易釋放,有效減少提取時(shí)間,極大程度上提高天然產(chǎn)物得率[16]。李玲梅等[17]研究了不同提取方法對(duì)枸杞多糖得率的影響,發(fā)現(xiàn)在相同條件下,微波輔助提取枸杞多糖得率和多糖含量明顯高于其他提取方法。

目前,在杜仲葉多糖的結(jié)構(gòu)方面,閆芝茜[18]對(duì)杜仲葉多糖結(jié)構(gòu)中的各單糖進(jìn)行了表征;陳雪花[19]研究了杜仲葉多糖結(jié)構(gòu)與結(jié)腸癌細(xì)胞抑制活性的關(guān)系;黃偉等[20]特別針對(duì)杜仲葉酸性多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。但是,鮮有研究比較不同杜仲品種葉多糖的差異,且對(duì)杜仲葉多糖的抗氧化能力研究也相對(duì)有限。全熙宇等[21]研究了杜仲葉熱水提多糖和堿提多糖的鐵離子還原能力,以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical,DPPH)自由基清除能力,發(fā)現(xiàn)2種杜仲葉多糖均具有良好的抗氧化活性,但堿提杜仲葉多糖抗氧化能力略高。XU等[22]分別使用微波輔助提取法和熱水提取法提取杜仲葉多糖,并比較其清除DPPH自由基能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn),微波輔助提取DPPH自由基清除活性顯著高于熱水提取。華仲1號(hào)、華仲5號(hào)、華仲12號(hào)、華仲13號(hào)、華仲15號(hào)和華仲24號(hào)是中國(guó)最常見(jiàn)的杜仲栽培品種,其中華仲13號(hào)為主栽品種,全國(guó)的種植面積最大,葉子的采摘量也最高。基于此,本研究使用微波輔助法提取杜仲葉多糖,采用正交試驗(yàn)優(yōu)化其提取工藝,對(duì)上述6個(gè)品種杜仲葉多糖進(jìn)行提取,優(yōu)化資源的選育,并對(duì)杜仲多糖的結(jié)構(gòu)及抗氧化活性進(jìn)行探究,以期為杜仲葉多糖提取及綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉(華仲1號(hào)、華仲5號(hào)、華仲12號(hào)、華仲13號(hào)、華仲15號(hào)、華仲24號(hào)),來(lái)自中國(guó)林科院新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣杜仲研究基地,2020年9月采摘,2021年試驗(yàn)完成。采摘的杜仲葉片于50 ℃烘干,粉碎過(guò)孔徑0.42 mm篩。

葡萄糖購(gòu)自天津市化學(xué)試劑三廠,分析純;AB-8大孔樹(shù)脂購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司;濾膜購(gòu)自天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;透析袋購(gòu)自湖南翊博生物科技有限公司;無(wú)水乙醇購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工公司,分析純;濃硫酸購(gòu)自洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司,優(yōu)級(jí)純;苯酚、溴化鉀、三氟乙酸、甲醇、鹽酸羥胺、吡啶、乙酸酐等其余試劑(分析純)均購(gòu)自上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-3618R高速冷凍離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;TU1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì):北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;7890B 5977氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀:安捷倫科技有限公司;E-scan Bruker 電子順磁共振波譜儀;Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀;JP-400B高速多功能粉碎機(jī):浙江永康市久品工貿(mào)有限公司;LGJ-12真空冷凍干燥機(jī):鄭州鳴一儀器設(shè)備有限公司;R1010EX旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海向帆儀器有限公司;M1-L213B微波爐:廣東美的廚房電器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 杜仲葉多糖提取方法 精確稱取2.0 g杜仲葉粉末,以蒸餾水為提取溶劑,在不同溫度下水浴2 h,然后按照單因素設(shè)定參數(shù)進(jìn)行微波處理。提取結(jié)束后,提取液于4 000 r·min-1下離心10 min,上清液在60 ℃下減壓濃縮至10～15 mL,加入無(wú)水乙醇至溶液乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%,4 ℃靜置12～24 h?；旌衔镉? 000 r·min-1下離心10 min,棄去上清液,將沉淀冷凍干燥后即得到杜仲葉粗多糖。將粗多糖制成1 g·L-1水溶液,取250 mL多糖溶液加入40 g預(yù)處理后的大孔樹(shù)脂AB-8,置于搖床中25 ℃、140 r·min-1脫色3 h,抽濾后濃縮,將濃縮液裝入截留量3.5 kD的透析袋中透析24 h,冷凍干燥得杜仲葉多糖[23-24]。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 選取杜仲主栽品種華仲13號(hào)樣品,以杜仲葉多糖得率為指標(biāo),以m(杜仲葉粉/g)∶V(H2O/mL)(以下簡(jiǎn)稱質(zhì)量體積比)為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、微波時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 min、水浴溫度20、40、60、80 ℃、微波功率120(低檔)、230(中低檔)、385(中檔)、539(中高檔)、700 W(高檔)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)。其中,以質(zhì)量體積比1∶40、微波時(shí)間1.0 min、水浴溫度60 ℃、微波功率385 W為基礎(chǔ)條件。

1.3.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,以杜仲葉多糖得率為指標(biāo),選取質(zhì)量體積比(A)、微波時(shí)間(B)、水浴溫度(C)、微波功率(D)做L9(34)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test factor levels

1.3.4 杜仲葉多糖結(jié)構(gòu)組成分析 參考吳靜等[25]方法,采用糖腈乙酸酯衍生化法將多糖水解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化。分別稱取經(jīng)最佳提取條件提取的6個(gè)品種杜仲葉多糖各3 mg,置于安瓿瓶中,加入2 mol·L-1三氟乙酸 3 mL,封口在120 ℃烘箱中保持4 h后冷卻至25 ℃,轉(zhuǎn)移至茄形燒瓶中60 ℃減壓蒸干,取下敞口放置10 min,加入甲醇,蒸干,重復(fù)5次,脫除三氟乙酸,得杜仲葉多糖水解樣品。加10 mg鹽酸羥胺、0.5 mL吡啶,90 ℃反應(yīng) 30 min,取出后冷卻至25 ℃,加入0.5 mL的乙酸酐,旋渦徹底混合,90 ℃繼續(xù)反應(yīng)30 min。反應(yīng)液減壓蒸干,加入適量甲醇溶解并定容至5 mL后,過(guò)0.22 μm濾膜。

(1)單糖組成測(cè)定 采用氣相色譜法-質(zhì)譜法聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometer,GC-MS)測(cè)定單糖組成。參考楊永晶等[26]分析方法。色譜條件:HP-5柱(30 m×250 μm×0.25 μm);進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫,起始溫度100 ℃,以5 ℃·min-1升至200 ℃,保持1 min,再以10 ℃·min-1升至250 ℃,保持5 min;載氣流速1.0 mL·min-1,分流比10∶1,載氣為氦氣。質(zhì)譜條件:接口溫度 280 ℃;四極桿溫度:150 ℃;電離方式:EI;電子轟擊能量:70 eV;溶劑延長(zhǎng)時(shí)間:5 min;全掃描范圍:50～800 m·z-1。

(2)紅外光譜測(cè)定 分別稱取經(jīng)最佳提取條件提取的6個(gè)品種杜仲葉多糖3 mg,充分研磨,加入溴化鉀固體粉末300 mg,研磨均勻后用壓片機(jī)壓片,用傅立葉紅外分光光度計(jì)在 4 000～400 cm-1范圍內(nèi)檢測(cè)紅外吸收光譜。

1.3.5 杜仲葉多糖抗氧化活性測(cè)定 通過(guò)測(cè)定DPPH自由基清除率來(lái)表征杜仲葉多糖抗氧化活性。參考郭學(xué)文等[27]測(cè)定及分析方法,稱取一定質(zhì)量的DPPH粉末,用甲醇溶解配制成0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mmol·L-1的DPPH溶液,繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線。采用電子順磁共振波譜法進(jìn)行測(cè)定。電子順磁波譜法測(cè)定條件:頻率9.792 069 GHz,功率5.0 mW,中心磁場(chǎng)3.487×10-1T,掃描寬度1×10-2T,調(diào)制幅度2.27×10-4T,調(diào)制頻率86.00 kHz,掃描時(shí)間83.89 s(20.97 s×4次),橫坐標(biāo)點(diǎn)數(shù)512,接收機(jī)增益為3.17×103。測(cè)試完畢后,根據(jù)二次積分值計(jì)算自由基清除能力,積分區(qū)域?yàn)?3 450±0.010)×10-4～(3 525±0.010)×10-4T。其中,DPPH在0.1～0.9 mol·L-1范圍內(nèi)其特征峰二次積分值與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系,滿足線性方程y=7.659x+0.141(R2=0.996)[27]。

選擇0.5 mmol·L-1的DPPH溶液進(jìn)行多糖清除率測(cè)定試驗(yàn)。取適量杜仲主栽品種華仲13號(hào)葉多糖配制成0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18 g·L-1,分別取0.1 mL各質(zhì)量濃度樣品與0.1 mL DPPH溶液混合,避光反應(yīng)30 min。用0.1 mL甲醇代替多糖溶液,以此為空白組。杜仲多糖DPPH自由基清除率計(jì)算如式(1)所示。IC50值為自由基清除率達(dá)到50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度,根據(jù)不同質(zhì)量濃度多糖的自由基清除能力的變化曲線可直觀得到,常作為比較不同樣品自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn)。以華仲13號(hào)杜仲葉多糖半抑制濃度IC50為標(biāo)準(zhǔn),比較華仲1號(hào)、華仲5號(hào)、華仲12號(hào)、華仲15號(hào)、華仲24號(hào)杜仲葉多糖的DPPH自由基清除能力。

(1)

式中:R為DPPH自由基清除率;A0為空白組特征峰的二次積分值;A為樣品組特征峰的二次積分值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用 Origin 8.5、SPSS 25 和Graph Pad Prism 6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多重比較采用SPSS 25 軟件的Dunnet法(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲葉多糖提取方法優(yōu)化

2.1.1 杜仲葉多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果 由圖1-a可知,杜仲葉多糖得率隨質(zhì)量體積比變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在質(zhì)量體積比1∶20時(shí)多糖得率達(dá)到最大,為6.15%。由圖1-b可知,杜仲葉多糖得率隨微波處理時(shí)間增加呈先上升后下降的趨勢(shì),在微波處理時(shí)間1.5 min時(shí)多糖得率達(dá)到最大,為5.86%。由圖1-c可知,在20～60 ℃溫度范圍內(nèi),杜仲葉多糖得率隨水浴溫度增加而上升,當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到最大,為5.73%;隨后水浴溫度上升到80 ℃時(shí),多糖得率略有下降,但變化不大。由圖1-d可知,整體上杜仲葉多糖得率隨微波功率增加呈先上升后下降趨勢(shì),在230～539 W之間多糖得率較高且趨于平穩(wěn),且在微波功率385 W時(shí)多糖得率達(dá)到最大,為6.34%。

a:料液比;b:微波時(shí)間;c:水浴溫度;d:微波功率。

2.1.2 杜仲葉多糖提取正交試驗(yàn)結(jié)果 采用微波輔助水提醇沉法提取杜仲葉粗多糖,在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以華仲13號(hào)為原料優(yōu)化提取工藝。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,各因素對(duì)得率的影響順序?yàn)槲⒉üβ?質(zhì)量體積比>水浴溫度>微波時(shí)間,最佳工藝水平為A2B2C1D2,即微波輔助提取杜仲葉多糖最佳工藝條件是質(zhì)量體積比1∶30、微波時(shí)間1.5 min、水浴溫度40 ℃、微波功率230 W。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表

2.1.3 不同品種杜仲葉多糖提取效果比較分析 以最佳提取條件對(duì)6個(gè)品種杜仲葉多糖進(jìn)行提取,得到多糖得率如表3所示。6個(gè)品種杜仲葉多糖得率由大到小順序?yàn)槿A仲24號(hào)>華仲15號(hào)>華仲1號(hào)>華仲12號(hào)>華仲13號(hào)>華仲5號(hào)。

表3 不同品種杜仲葉多糖得率分析Table 3 Analysis of extraction rate of polysaccharides from six E.ulmoides leaves

2.2 不同品種杜仲葉多糖結(jié)構(gòu)組成分析

2.2.1 不同品種杜仲葉多糖單糖組成比較分析 6個(gè)品種杜仲葉多糖GC-MS結(jié)果顯示,杜仲葉多糖主要由L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖6種單糖組成,在此基礎(chǔ)上采用面積歸一化法進(jìn)行單糖組分計(jì)算,如表4所示。不同杜仲葉多糖中華仲1號(hào)的D-半乳糖(40.65%±0.09%)、L-鼠李糖(7.56%±0.08%)、D-阿拉伯(16.66%±0.06%)均高于其余5個(gè)品種。華仲5號(hào)的D-葡萄糖(47.59%±0.27%)最高,而L-鼠李糖(3.31%±0.04%)、D-木糖(2.91%±0.44%)、D-甘露糖(5.80%±0.54%)與其余5個(gè)品種相比最低。華仲13號(hào)的D-木糖最高。華仲15號(hào)的D-甘露糖(14.7%±0.11%)最高,而其D-半乳糖(27.16%±0.09%)最低。

表4 6個(gè)品種杜仲葉多糖單糖組成分析

圖2 不同品種杜仲葉多糖的傅里葉紅外光譜圖

2.3 不同品種杜仲葉多糖抗氧化活性比較分析

圖3-a為華仲13號(hào)的DPPH自由基清除能力曲線。在0.04～0.18 g·L-1范圍內(nèi),隨著多糖質(zhì)量濃度升高,DPPH自由基清除能力也隨之上升。IC50值常作為比較不同樣品自由基清除能力的標(biāo)準(zhǔn),IC50值越低,自由基清除能力越強(qiáng)[28]。根據(jù)圖3-a自由基清除能力曲線,華仲13號(hào)的IC50值,即自由基清除率達(dá)50%時(shí)質(zhì)量濃度為0.06 g·L-1。以此質(zhì)量濃度為參考,測(cè)定華仲1號(hào)、華仲5號(hào)、華仲12號(hào)、華仲15號(hào)、華仲24號(hào)的DPPH自由基清除能力。如圖3-b所示,相同質(zhì)量濃度下,DPPH自由基清除能力從高到低為華仲1號(hào)>華仲13號(hào)>華仲12號(hào)>華仲24號(hào)>華仲5號(hào)>華仲15號(hào)。

a:華仲13號(hào)的DPPH自由基清除率曲線;b:在華仲13號(hào)的IC50值下不同品種杜仲葉多糖的DPPH自由基清除率。不同字母表示不同組別存在差異顯著(p<0.05)。

3 結(jié)論與討論

杜仲是中國(guó)著名鄉(xiāng)土經(jīng)濟(jì)林樹(shù)種,其應(yīng)用產(chǎn)業(yè)涉及醫(yī)藥、食品和化工產(chǎn)品等多個(gè)領(lǐng)域,目前市場(chǎng)中杜仲產(chǎn)品有杜仲牙膏、杜仲茶和杜仲膠囊等[29]。針對(duì)不同種質(zhì)資源杜仲葉多糖的研究可為優(yōu)化杜仲資源的選育、發(fā)掘杜仲葉潛在價(jià)值提供重要依據(jù)。本研究以華仲1號(hào)、華仲5號(hào)、華仲12號(hào)、華仲13號(hào)、華仲15號(hào)、華仲24號(hào)6個(gè)品種杜仲葉為原料,采用微波輔助提取法,在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,使用正交試驗(yàn)優(yōu)化杜仲葉多糖提取最佳條件,并對(duì)6個(gè)品種杜仲葉多糖結(jié)構(gòu)及抗氧化能力進(jìn)行比較。在單因素試驗(yàn)中,質(zhì)量體積比大于1∶20以后多糖得率下降,出現(xiàn)這一現(xiàn)象推測(cè)是因?yàn)槿軇w積增大,溶質(zhì)接受到的微波輻射下降,進(jìn)而分子間相互作用下降,多糖溶出量下降[30]。在微波時(shí)間在0.5～1.5 min范圍內(nèi),多糖得率隨時(shí)間延長(zhǎng)而上升,這是由于在一定時(shí)間范圍內(nèi),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),微波輻射的熱效應(yīng)不斷強(qiáng)化,細(xì)胞內(nèi)部溫度上升,且壓力上升使細(xì)胞產(chǎn)生孔洞,增強(qiáng)了細(xì)胞溶出率和傳質(zhì)速率,多糖得率上升。當(dāng)微波時(shí)間超過(guò)1.5 min、水浴溫度超過(guò)60 ℃、微波功率超過(guò)385 W時(shí),局部熱量過(guò)高,提取液劇烈沸騰,可能導(dǎo)致多糖發(fā)生降解,使得率下降[31]。經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化,杜仲葉多糖提取最佳條件為質(zhì)量體積比1∶30、水浴溫度40 ℃、微波時(shí)間1.5 min、微波功率230 W,在最佳提取條件下6個(gè)品種杜仲葉多糖得率分別為華仲1號(hào)6.90%±0.04%、華仲5號(hào)6.47%±0.13%、華仲12號(hào)6.68%±0.11%、華仲13號(hào)6.53%±0.07%、華仲15號(hào)7.21%±0.02%、華仲24號(hào)7.64%±0.05%。陳雪花等[32]使用超聲波協(xié)同酶法優(yōu)化杜仲葉多糖提取工藝,得到杜仲葉多糖得率達(dá)到4.79%,低于本研究結(jié)果,推測(cè)是由于該研究提取時(shí)間過(guò)短,多糖沒(méi)有完全溶出。此外,本研究采用微波輔助提取法的提取結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)熱水提取法,這是因?yàn)閭鹘y(tǒng)熱水浸提法提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)且溫度過(guò)高,多糖發(fā)生降解,從而造成杜仲葉多糖得率下降[33]。

通過(guò)對(duì)6個(gè)品種杜仲葉多糖結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),不同杜仲葉多糖具有相似的結(jié)構(gòu)組成,均為吡喃多糖,且由L-鼠李糖、D-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖組成,這一結(jié)果與張學(xué)俊等[34]研究結(jié)果一致。D-葡萄糖和D-半乳糖摩爾比例均超過(guò)60%,但不同杜仲葉多糖單糖組成比例有差異。本研究中發(fā)現(xiàn)6個(gè)品種杜仲葉多糖均有良好DPPH自由基清除活性,當(dāng)多糖質(zhì)量濃度0.06 g·L-1時(shí),華仲1號(hào)自由基清除力最高,達(dá)到59.14%,而華仲15號(hào)自由基清除能力較低,為35.23%。多糖質(zhì)量濃度越高,抗氧化能力越強(qiáng)。本研究中杜仲葉多糖質(zhì)量濃度為0.06 g·L-1,但與全熙宇等[21]與XU等[22]研究相比,同樣也具有較好的抗氧化能力。6個(gè)品種組分抗氧化能力的差異,推測(cè)是單糖組成、多糖結(jié)構(gòu)及分支程度等綜合原因引起的。本研究結(jié)果將為杜仲葉這一新的藥食同源資源的開(kāi)發(fā)提供參考,并為開(kāi)發(fā)新的抗氧化劑提供依據(jù)。