劉玉飛 龐丹丹 陳春林 田易萍 孫云南 李友勇 陳林波

關(guān)鍵詞：弄島野茶；特異資源；TCS1；生物合成

茶樹(shù)富含咖啡堿、可可堿、茶葉堿等多種嘌呤生物堿，其中咖啡堿（2.5%～4.5%）是其含量較高并且較常見(jiàn)的嘌呤生物堿[1]。咖啡堿具有興奮、提高大腦記憶力和識(shí)別能力等多種對(duì)人體有利的生理功能[2]，但過(guò)量的攝入會(huì)使敏感人群出現(xiàn)失眠[3]，并且有可能引起骨質(zhì)疏松和流產(chǎn)等不利反應(yīng)[4-5]。因此，低（無(wú)）咖啡堿茶以及相關(guān)的茶制品（咖啡堿含量低于1%）受到了有特殊需求消費(fèi)群體的喜愛(ài)[6]。目前常用的脫咖啡堿技術(shù)主要有溶劑萃取、物理吸附法、生物降解法以及培育低咖啡因茶樹(shù)品種等[7-8]，其中低咖啡堿茶樹(shù)育種是實(shí)現(xiàn)茶葉低（無(wú)）咖啡堿最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的方法[8]。咖啡堿代謝途徑的解析以及低咖啡堿特異茶樹(shù)資源的鑒定有利于茶樹(shù)低咖啡堿育種工作的開(kāi)展。

咖啡堿的生物合成途徑已經(jīng)明確，其可以通過(guò)從頭合成嘌呤環(huán)，然后再合成咖啡堿，也可以利用已有的嘌呤類(lèi)化合物為基礎(chǔ)進(jìn)行合成。NEGISHI等[9]根據(jù)同位素示蹤研究，提出了茶樹(shù)咖啡堿生物合成的核心途徑，即以黃嘌呤核苷（xanthosine，XR）為底物，經(jīng)7-甲基黃嘌呤核苷、7-甲基黃嘌呤和可可堿等中間產(chǎn)物而合成，合成途徑涉及N-甲基轉(zhuǎn)移酶類(lèi)（N-methyltransferases，NMTs）、N-甲基核苷酶和S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶（S-adenosyl-L-methioninesynthetase，SAMS）。咖啡堿的合成涉及到多種酶類(lèi)基因，如SAMS（AB041534）[10]、TIDH（inosine-5'-monophosphatedehydrogenase，EU106658）[11]和咖啡堿合成酶TCS（caffeinesynthase，AB031280）[12]等。

TCS是茶樹(shù)咖啡堿代謝最為關(guān)鍵的基因，屬于NMT家族，KATO等[12]通過(guò)克隆獲得了茶樹(shù)第一個(gè)NMT，茶樹(shù)咖啡堿合成酶基因TCS1，接著YONEYAMA等[13]在茶樹(shù)中克隆與TCS1序列相似大于89%的TCS2（AB031281），隨后金基強(qiáng)等[14]根據(jù)TCS1序列從茶樹(shù)基因組中克隆得到4種TCS基因（TCS3～TCS6）。前期的功能鑒定與進(jìn)化分析結(jié)果表明，TCS1是咖啡堿合成途徑中的關(guān)鍵基因，對(duì)茶樹(shù)合成咖啡堿最為重要[12-14]。多項(xiàng)研究表明TCS1具有多種等位變異，現(xiàn)已報(bào)道8種TCS1的等位基因，分別命名為T(mén)CS1a～TCS1g和TCS1i，其中TCS1a、TCS1b、TCS1c與之前克隆的TCS1、ICS1、PCS1序列相同[15-17]。前期的進(jìn)化分析以及酶學(xué)實(shí)驗(yàn)表明TCS1的不同等位變異可以分為2類(lèi)，一類(lèi)僅具有可可堿合成酶活性（TCS1b、TCS1c、TCS1g和TCS1i）；另一類(lèi)同時(shí)具有可可堿和咖啡堿合成酶活性（TCS1a、TCS1d、TCS1e和TCS1f）[15，17]。

本課題組前期從國(guó)家大葉茶樹(shù)資源圃（勐海）篩選獲得1份低咖啡堿、高可可堿茶樹(shù)種質(zhì)——弄島野茶（MHLC），然而，MHLC低咖啡堿、高可可堿的形成原因尚不清楚。因此，本研究通過(guò)對(duì)MHLC和云抗10號(hào)（YK10，對(duì)照品種）不同季節(jié)以及MHLC不同部位嘌呤生物堿的含量進(jìn)行分析，明確MHLC中的化學(xué)成分，并通過(guò)基因型鑒定和基因表達(dá)量分析初步解析MHLC低咖啡堿的形成機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

采摘弄島野茶（MHLC）、云抗10號(hào)（YK10）（圖1）春、夏、秋的一芽二葉（春季：3月27日；夏季：7月10日；秋季：10月27日），并收集MHLC新梢不同成熟度葉片和莖的樣品（采于10月27日），微波固樣2min，然后80℃烘至足干，一部分用于生化成分的測(cè)定，另一部分液氮固樣，并置于–80℃冰箱用于后期RNA的提取。

1.2方法

1.2.1化學(xué)組分提取與測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1g（精確到0.001）樣品，加入10mL70%的甲醇溶液，搖勻，然后70℃水浴10min，期間搖勻2次，提取結(jié)束后7000r/min離心1min，取上清液過(guò)0.45μm有機(jī)濾膜，用HPLC測(cè)定樣品中的生物堿，具體方法參見(jiàn)JIN等[15]的研究。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR以茶樹(shù)GAPDH基因作為內(nèi)參基因測(cè)定MHLC和YK10中嘌呤生物堿關(guān)鍵基因SAMS、TIDH和TCS的表達(dá)量，其中SAMS、TIDH分別是N-甲基核苷酶和S-腺苷-L-甲硫氨酸合成酶基因、肌苷-5′-單磷酸脫氫酶基因；TCS1-CS、TCS1-TS、TCS1-Total分別是表達(dá)蛋白同時(shí)具有可可堿、咖啡堿合成酶（caffeinesynthase，CS）活性的等位變異、表達(dá)蛋白僅具有可可堿合成酶（theobrominesynthase，TS）活性的等位變異以及TCS1整體表達(dá)水平的引物。引物序列來(lái)源于JIN等[15]的研究（表1），RT-qPCR具體方法參照PANG等[18]的研究。

1.2.3TCS1等位變異cDNA全長(zhǎng)的克隆利用TCS1（TCS1a，AB031280）的序列設(shè)計(jì)引物克隆不同樣品中的TCS1基因，具體的基因克隆方法見(jiàn)PANG等[18]的研究。利用ClustalW（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）在線(xiàn)軟件進(jìn)行序列比對(duì)，并利用EXPASY中的BoxShade（https：//embnet.vital-it.ch/software/BOX_form.html）輸出同源比對(duì)的結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1不同季節(jié)化學(xué)組分含量

MHLC和對(duì)照品種YK10三個(gè)季節(jié)（春、夏、秋）的可可堿與咖啡堿測(cè)定結(jié)果顯示，MHLC與YK10的嘌呤生物堿的總量和各組分含量均存在顯著差異（表2）。MHLC生物堿總量和咖啡堿含量均顯著低于YK10，其中咖啡堿含量不足YK10的九分之一，但是其可可堿含量要高于YK10；MHLC中含量最高嘌呤生物堿是可可堿（大于23.00mg/g），其次是咖啡堿（小于4.00mg/g），而YK10與之相反。另外，春季到秋季MHLC中的可可堿和咖啡堿含量均有增加的趨勢(shì)，但是除春季MHLC的咖啡堿極顯著低外，其他差異均未達(dá)到極顯著水平；而YK10中的可可堿則一直降低，咖啡堿先升高后降低。

2.2MHLC不同組織化學(xué)組分含量

為了明確MHLC嘌呤生物堿不同發(fā)育階段的變化規(guī)律，本研究測(cè)定了MHLC芽（MHLC-B）、不同發(fā)育階段的葉片（芽下第一片葉子用MHLC-1L表示，其它依次類(lèi)推）和莖（芽至第一片葉子之間的莖用MHLC-1S表示，第一片葉子至第二片葉子之間的莖用MHLC-2S表示，其它依次類(lèi)推）的嘌呤生物堿。結(jié)果顯示，MHLC芽中具有最高的可可堿（32.16mg/g）和咖啡堿（6.14mg/g）含量，同一發(fā)育階段葉片中可可堿和咖啡堿含量高于莖，另外，隨著葉片和莖成熟度的增加，可可堿、咖啡堿以及嘌呤生物堿總量均逐漸下降（圖2）。

2.3咖啡堿合成酶基因的克隆

根據(jù)TCS1（TCS1a，AB031280）的基因序列設(shè)計(jì)引物，成功從MHLC和YK10中克隆得到TCS1基因的編碼區(qū)全長(zhǎng)。在YK10中克隆到1個(gè)TCS1的等位變異，命名為YK10_TCS1，其與TCS1a（具有可可堿和咖啡堿合成酶活性）有3個(gè)核苷酸的差異，雖然它們引起了編碼氨基酸殘基的變化，但是均不影響TCS的保守基序和關(guān)鍵活性位點(diǎn)。在MHLC中克隆得到2種TCS1的等位變異，分別命名為MHLC_TCS1b和MHLC_TCS1d。其中MHLC_TCS1b與已經(jīng)報(bào)道的僅具有可可堿合成酶活性的TCS1b（AB056108）雖然有3個(gè)核苷酸的差異，但是編碼蛋白序列完全相同；MHLC_TCS1d與已經(jīng)報(bào)道的具有可可堿和咖啡堿合成酶活性的TCS1d（KT215399），有1個(gè)核苷酸的差異，并且引起編碼氨基酸殘基的變化，但并不影響TCS的保守基序和關(guān)鍵活性位點(diǎn)（圖3）。

2.4咖啡堿合成途徑關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

3討論

我國(guó)具有豐富的茶樹(shù)資源，低咖啡堿茶樹(shù)資源已在廣東[19]、福建[16，20]、四川[6]、云南[21-22]等多個(gè)省份發(fā)現(xiàn)。已報(bào)道的云南省低咖啡堿茶樹(shù)來(lái)源于文山壯族苗族自治州[21]、西雙版納傣族自治州[22-23]以及昭通市[24]，本研究報(bào)道的低咖啡堿（不足4.00mg/g）和高可可堿（大于23.00mg/g）的弄島野茶（MHLC）來(lái)源于云南省德宏傣族景頗族自治州瑞麗市，是該地區(qū)首次報(bào)道的低咖啡堿茶樹(shù)資源。瑞麗市MHLC為低（無(wú)）咖啡堿茶樹(shù)育種提供了可利用的親本材料，并擴(kuò)大了篩選低咖啡堿茶樹(shù)資源的區(qū)域。

MHLC中可可堿和咖啡堿由春季到秋季均有增加的趨勢(shì)，但除春季咖啡堿顯著低外，可可堿或咖啡堿不同季節(jié)間的差異均未達(dá)到極顯著水平；而YK10中可可堿從春季到秋季則一直降低，咖啡堿先升高后降低。這說(shuō)明不同茶樹(shù)種質(zhì)資源，咖啡堿和可可堿不同季節(jié)間的變化趨勢(shì)有所差異，李金[25]對(duì)25個(gè)茶樹(shù)品種的研究結(jié)果也指出，不同品種在不同季節(jié)咖啡堿和可可堿的變化趨勢(shì)具有一定的差異，這可能與茶樹(shù)品種自身的調(diào)控和代謝機(jī)制相關(guān)。茶樹(shù)中咖啡堿和可可堿主要分布在幼嫩部位，其中在新梢部分的分布最為集中，越老化的葉片含量越少[16，26-27]。MHLC中咖啡堿和可可堿在不同成熟度葉片和莖中的分布規(guī)律與之前的結(jié)果一致，也是在幼嫩的部位含量較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，MHLC中含有2種TCS1等位變異基因：MHLC_TCS1b和MHLC_TCS1d。其中MHLC_TCS1b與已經(jīng)報(bào)道的TCS1b[15]（AB056108，僅具有可可堿合成酶活性）編碼蛋白序列基本完全相同；雖然MHLC_TCS1d與TCS1d[15-16]（KT215399，同時(shí)具有可可堿和咖啡堿合成酶活性）的編碼蛋白序列有1個(gè)氨基酸殘基的差異，但是并不影響NMT保守基序和TCS的關(guān)鍵活性位點(diǎn)，推測(cè)MHLC_TCS1d與TCS1d具有相似的功能。以上分析可知，MHLC同時(shí)具有TS活性和CS活性的TCS1等位變異?；虮磉_(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，MHLC_TCS1b在MHLC中的表達(dá)量很高，這與MHLC相比YK10在芽葉中積累較多的可可堿相符；而MHLC_TCS1d在MHLC中表達(dá)量極低（不足YK10中TCS1d基因表達(dá)量的1/4800），很可能是MHLC低咖啡堿含量的一個(gè)主要原因。JIN等[15]和劉玉飛等[28]的研究均表明TCS1不同等位變異的啟動(dòng)子序列存在顯著差異，但MHLC_TCS1d的低表達(dá)是否由啟動(dòng)子序列變異引起還需進(jìn)一步研究。