王佳瑩，張祖朔，陳佰勝，王丹丹，于 飛，檀建新

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學 河北省人畜共患病原微生物分析與防空重點實驗室，河北 保定 071000；3.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071000）

2019 新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的呼吸道疾病［1］。自2019 年12 月以來，SARS-CoV-2在全球范圍內(nèi)迅速傳播，并逐步發(fā)展成全球大流行疾病。迄今為止，SARS-CoV-2 的傳播已經(jīng)給全球人類帶來了重大損失。截至2023 年，已導致全球接近7 億的確診病例，約690 萬人死亡，而且該病毒仍在傳播流行，為世界各地的醫(yī)療系統(tǒng)帶來了沉重的負擔［2］。新冠病毒主要編碼4 種結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)、核衣殼蛋白(N)［3］。其中，介導病毒感染的蛋白主要是S 蛋白，與感染細胞密切相關［4］。S 蛋白由S1 和S2 兩個功能亞基組成，S1 亞基由N-末端結(jié)構(gòu)域(NTD)和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RBD)組成，可以與宿主血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(ACE2)受體結(jié)合［5］，S2 含有完成膜融合所需的分子機器，刺突蛋白通過構(gòu)象變化完成膜融合過程，進而導致嚴重的肺部炎癥。因此，S1 亞基及其RBD 結(jié)構(gòu)域在病毒與受體細胞識別和結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用，同時也是疫苗研制的主要目標蛋白［6］。研究發(fā)現(xiàn)S 蛋白串聯(lián)重復的RBD 二聚體，產(chǎn)生高水平抗體，是有效的疫苗抗原，而RBD 在病毒中以三聚體形式存在于刺突蛋白中，可能更具抗原特性［7-8］。

以乳酸菌作為抗原遞送載體的策略在近些年獲得了廣泛的關注，乳酸菌具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以通過與腸道上皮細胞和黏膜相互作用來影響宿主免疫系統(tǒng)［9-10］。因為食品級乳酸菌的安全性，經(jīng)其表達的外源蛋白可以不經(jīng)過純化而與乳酸菌一同服用，當重組乳酸菌定植于消化道黏膜后，可以源源不斷地為人體提供相應的抗原蛋白［11］。除此之外，乳酸菌的生長速度快、免疫原性弱、自身分泌的蛋白量很少，這使其成為表達外源蛋白的理想選擇［12］。在乳酸菌表達過程中，為了更好展示目的蛋白并且避免過量的外源蛋白在菌內(nèi)的積累、降解產(chǎn)生可能對菌體有害的物質(zhì)，需要及時將外源蛋白分泌到細胞外，所以高效的表面定位系統(tǒng)是必不可少的，目前常用是Usp45 信號肽和3Lysm 錨定基序［13］。近年來，研究人員一直在努力開發(fā)一些高效且控制效果良好的乳酸菌表達系統(tǒng)，以此讓乳酸菌能夠表達某些特定病毒的抗原蛋白。

Lim 等［14］用運載蛋白AcmA 及信號肽Usp45融合RSV 病毒的1 個抗原表位(G 蛋白)，共同呈現(xiàn)在L.lactis的表層。Guo 等［15］人利用4 種乳酸菌制備了可以顯著降低牛奶蛋白引起的過敏反應的發(fā)酵乳飲料，這種飲料通過降低小鼠血清中總IgG、總IgG1 和總IgE 抗體水平來緩解過敏癥狀。孫珊等［16］人利用UreB 基因工程乳桿菌研制了1 種色香味俱佳的可以預防幽門螺旋桿菌感染的UreB 活性酸奶，表明乳酸菌是表達外源蛋白的良好載體。本研究利用食品級表達載體pNZ8149 和綠色熒光蛋白（GFP）、新冠病毒S1 蛋白上的RBD 結(jié)構(gòu)域構(gòu)建了3 個重組表達載體并把3 種蛋白在乳酸乳球菌上進行表面展示，將乳酸菌的生物學特征和食用安全性相結(jié)合，為將來的新冠病毒疫苗及其他病原體的疫苗研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lactococcus lactisNZ3900、表達載體pNZ8149購自杭州寶賽生物科技有限公司；pET28b-GFP 質(zhì)粒由本實驗室保存；pcDNA3.1(+)-His-SARS-CoV-2-Omicron-Spike 質(zhì)粒 由河北農(nóng)業(yè)大學于飛教授提供；細菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 純化回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；GM17 培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司；Nisin 購自上海騰準生物科技有限公司；TriQuick Reagent 總RNA 提取試劑購自北京索萊寶科技有限公司；RNA 提取液(25∶24)購自北京博奧拓達科技有限公司；DEPC 水(DNase、RNase free)購自碧云天生物技術有限公司；EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒、染料法熒光定量預混試劑購自北京全式金生物技術有限公司；Anti-GFP-Tag 一抗、Anti-His-Tag 一抗、HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)購自北京博奧龍免疫技術有限公司；YF?488 羊抗鼠二抗購自蘇州優(yōu)逸蘭迪生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

PCR 儀 德 國Biometra 公 司；RT-PCR 儀 美 國ABI 公司；Gene PuLser Xcell 電穿孔儀 美國Bio-Rad 公司；Tanon 4800 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng) 北京原平皓生物技術有限公司；熒光顯微鏡Axio-Imager-M2 卡爾蔡司管理有限公司。

1.3 引物設計

用于基因擴增的引物（表1）由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.4 L.lactis 表達載體的構(gòu)建

根 據(jù)GenBank 中Usp45 信 號 肽( 登 錄 號：M60178.1) 序列，設計Usp45 基因片段擴增引物(Primer1、3)；按參考文獻［17］設計3LysM(C 端肽聚糖錨定結(jié)構(gòu)域) 擴增引物(Primer2、4)，以L.lactisNZ3900 基因組為模板通過融合PCR(引物1 ～4)擴增獲得Usp45-3LysM融合基因片段。以表1 中的Primer1、5、6 為引物，以Usp45-3LysM融合基因片段、pET28b-GFP 質(zhì)粒為模板，通過融合PCR 以及酶切連接的方式構(gòu)建pNZ8149-GFP 載體；分別以Primer1、7 ～11；Primer1、9 ～13 為引物。以Usp45-3LysM融合基因片段、pcDNA3.1(+)-His-SARS-CoV-2-Omicron-Spike 質(zhì)粒為模板，通過融合PCR 及酶切連接的方式構(gòu)建pNZ8149-2RBD 和pNZ8149-3RBD 載體。載體構(gòu)建流程如圖1 所示，反應程序參考文獻［18］。

圖1 表面展示載體構(gòu)建流程圖Fig.1 The flow chart of construction of the surface displaying vectors

1.5 乳酸乳球菌感受態(tài)細胞的制備、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化子的篩選

感受態(tài)細胞制備和電轉(zhuǎn)化方法按文獻［19］中的方法進行，參數(shù)設置（脈沖：25 μF，電阻200 Ω，電壓2 000 V）。30 ℃靜置培養(yǎng)24 h 后于Elliker 固體篩選培養(yǎng)基中挑取陽性轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR 驗證，PCR 反應體系：上下游引物（Primer1、6 用 于 驗 證pNZ8149-GFP，Primer1、11 用 于 驗證pNZ8149-2RBD/3RBD ）各0.5 μL，2×EsTaqMasterMix 5 μL，ddH2O 4 μL，在平板中蘸取少許菌體于上述體系中混勻；反應程序：預變性95 ℃5 min，變性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃3 min，25 個循環(huán)后，終延伸72 ℃ 10 min。將上述PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后挑選陽性克隆并送至北京擎科生物科技股份有限公司測序驗證。

1.6 重組乳酸菌的誘導及誘導條件的優(yōu)化

①活化培養(yǎng)：將陽性重組乳酸乳球菌接種于5 mL GM17 液體培養(yǎng)基中30 ℃靜置培養(yǎng)過夜，再按4%的接種量接種于5 mL GM17 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)3 ～4 h 直至OD600≈0.4。②誘導表達：分別用終質(zhì)量濃度為0 、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 和100.0 ng/mL 的Nisin［19］誘導5 mL 重組菌液，15 h 后終止培養(yǎng)。③RNA 提?。阂来稳〗?jīng)不同濃度Nisin 誘導后的菌液3.0 mL，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，沉淀中加入1.0 mL 總RNA 提取試劑，渦旋振蕩，常溫靜置5 min。離心后取800.0 μL 加入到1.50 mL 離心管中，再加入200.0 μL RNA 提取液，混勻冰上靜置3 min。然后離心后取上清200.0 μL加入到1.5 mL 離心管中，再加入異丙醇混勻，于-20 ℃下醇沉30 min。4 ℃，12 000 r/min 離心10 min，棄上清，用75% 乙醇洗滌沉淀2 次，每次4 ℃，12 000 r/min 離心2 min，棄上清，開蓋靜置約15 min，加入10.0 μL DEPC 水溶解，備用。④反 轉(zhuǎn) 錄：按 照EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒說明進行操作。⑤實時熒光定量PCR 檢測：利用表1 中的引物（Primer 14 ～17），通過實時熒光PCR 篩選最佳誘導濃度［20］。⑥按照步驟①重新培養(yǎng)重組菌液至OD600≈0.4，加入步驟⑤選出最佳濃度的Nisin 誘導5、10、15、20、25 和30 h 后終止培養(yǎng)，4 ℃，12 000 r/min 離心5 min，按步驟③④⑤操作選定最佳誘導時間。

1.7 表達產(chǎn)物SDS-PAGE 和Western blot 分析

陽性轉(zhuǎn)化子誘導表達后，取1.0 mL 菌液4 ℃12 000 r/min 離心5 min 收集菌體，超聲波破碎（300 w，3 s /3 s，15 min）后制備蛋白樣品，進行SDS-PAGE 電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜進行Western blot，步驟包括①轉(zhuǎn)膜：將聚偏二氟乙烯（PVDF）放在甲醇中浸泡5 min，將分離膠和PVDF 膜固定，調(diào)電壓至300 V，電泳3 h 轉(zhuǎn)膜。②封閉：轉(zhuǎn)膜完畢后，將PVDF 膜轉(zhuǎn)移至封閉液中封閉30 min 或過夜。③洗滌：用TTBS 液在水平搖床上洗膜3 次，每次5 min。④一抗、二抗孵育：于PVDF 膜上加入適量由TTBS 脫脂乳緩沖液按1∶1 000 分別稀釋的一抗GFP-Tag、His-Tag，室溫孵育3 h。之后用TBST 清洗3 次，每次10 min。于PVDF 膜上加入適量TTBS 脫脂乳緩沖液按1∶10 000 稀釋的二抗，室溫孵育2 h。⑤顯色觀察：用TTBS 溶液清洗3 次，每次10 min，于PVDF 膜上滴加超靈敏化學發(fā)光顯色液顯色；使用凝膠成像儀觀察結(jié)果。

1.8 表達產(chǎn)物的間接免疫熒光

①陽性轉(zhuǎn)化子誘導表達后，取1.0 mL 菌液4 ℃，5 000 r/min 離心10 min，棄上清；②菌體沉淀用無菌PBS 緩沖液洗滌3 次，4 ℃，5 000 r/min 離心10 min，棄上清；③加入PBS 1∶200 稀釋的一抗(鼠抗his 單克隆抗體)，混合均勻，37 ℃水浴作用60 min；④用PBS 緩沖液吹吸菌體，震蕩混勻后，4 ℃，5 000 r/min 離心5 min，棄上清，清洗3次；⑤加入PBS 1∶200稀釋的二抗（YF?488 羊抗鼠二抗），混合后于37 ℃作 用60 min，4 ℃，5 000 r/min 離 心5 min；⑥用PBS 緩沖液懸浮菌體，混勻后4 ℃，5 000 r/min 離心5 min，棄上清，重復洗滌3 次；⑦最后將菌體沉淀懸浮于200 μL PBS 緩沖液中，取適量涂片；⑧自然干燥后，用預冷無水乙醇固定30 min，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的獲得

分別以L.lactisNZ3900 基因組、pcDNA3.1(+)-His-SARS-CoV-2-Omicron-Spike 質(zhì) 粒 和pET28b-GFP 為 模 板，PCR 擴 增Usp45+3LysM、RBD和GFP基因，PCR 產(chǎn)物的凝膠成像結(jié)果如圖2。

圖2 3 個目的基因的PCR 產(chǎn)物Fig.2 PCR products of three target genes

泳道1、2、3 分別為PCR 擴增獲得的GFP、RBD、Usp45+3LysM基因片段，與預期大小為742、675 和694 bp 的目的基因片段一致，說明成功克隆目的基因。

2.2 表達載體的構(gòu)建和驗證

利用融合PCR 和酶切連接方式構(gòu)建的pNZ8149-GFP、pNZ8149-2RBD 和pNZ8149-3RBD載體，通過限制性內(nèi)切酶NcoI/SacI 進行雙酶切驗證。由圖3 可知，泳道1 為NcoI/SacI 雙酶切pNZ8149-3RBD 載體，由于其雙酶切后的載體和連接片段大小相近，所以呈現(xiàn)1 條帶。泳道2 為NcoI/SacI 雙酶切pNZ8149-2RBD 載體，條帶大小分別為2 020 和2 507 bp。泳道3 為NcoI/SacI雙酶切pNZ8149-GFP，條帶大小分別為1 393 和2 507 bp，條帶大小與理論預期值一致，表明已成功構(gòu)建表達載體pNZ8149-GFP，pNZ8149-2RBD 和pNZ8149-3RBD。

圖3 重組質(zhì)粒PCR 及酶切驗證Fig.3 Verification of the recombinant plasmid by PCR and restriction enzyme digestion

2.3 乳酸乳球菌陽性轉(zhuǎn)化子的獲得

將上述重組表達載體電擊轉(zhuǎn)化入乳酸乳球菌后涂布于GM17 平板，經(jīng)30 ℃培養(yǎng)24 h 后挑取菌落進行PCR 驗證，結(jié)果如圖4 所示。

圖4 陽性轉(zhuǎn)化子的PCR 驗證Fig.4 PCR verification of the positive transformants

泳道3、4、5、7、9 顯示目的條帶，初步鑒定為陽性重組菌株（泳道3：L.lactisNZ3900-3RBD菌株；泳道4、5：L.lactisNZ3900-2RBD 菌株；泳道7、9：L.lactisNZ3900-GFP 菌株），挑選條帶明亮的陽性轉(zhuǎn)化子進行后續(xù)的試驗。

2.4 Nisin 誘導劑最佳誘導濃度和誘導時間的確定

通過實時熒光定量PCR 測定GFP 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，以評估Nisin 的最佳誘導時間和濃度(圖5)，結(jié)果表明不同濃度的Nisin 對GFP 的誘導表達效果影響明顯，1 ～20 ng/mL 濃度區(qū)間時，隨Nisin 濃度提高，誘導效果明顯增加，在20 ～100 ng/mL 濃度區(qū)間，隨著Nisin 濃度提高，誘導效果逐漸減弱，20 ng/mL 時表達效果最佳。以摸索出的最適誘導濃度（20 ng/mL）為基礎，通過誘導不同時間觀察GFP 熒光相對表達量，結(jié)果顯示，5 ～20 h 表達量逐漸增高，隨后下降，表明20 h 為最佳誘導時間。因此，最終選定20 ng/mL 誘導20 h 為最佳誘導條件。

圖5 Nisin 誘導劑的最佳誘導濃度(A)及時間(B)Fig.5 The optimum induction concentration (A) and induction time (B) of Nisin

2.5 重組蛋白的Western blot 鑒定

于30 ℃培養(yǎng)乳酸乳球菌至 OD600≈0.4 時加入誘導劑Nisin，使其終濃度為20.00 ng/mL，20 h 后離心取菌體進行超聲破碎，通過Western blot 檢測重組菌株是否表達目的蛋白（圖6）。結(jié)果表明泳道1、2、3 中Western blot 顯色條帶相對分子質(zhì)量大小分別為47.2 、71.3 和96.3 kD，分別與表面展示目的蛋白3LysM-GFP、3LysM-2RBD、3LysM-3RBD 的 理 論分子量大小一致，表明重組菌株成功表達目的蛋白。

圖6 3 種目的重組蛋白的Western blot 鑒定Fig.6 Identification of three target recombinant proteins using western blot

2.6 重組乳酸乳球菌表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定

將表達目的蛋白和空載體的乳酸乳球菌進行間接免疫熒光試驗，如圖7 所示，（1）、（2）、（3）分 別 為L.lactisNZ3900-GFP、NZ3900-2RBD、NZ3900 -3RBD 菌株，有可見的綠色熒光產(chǎn)生，且（2）較（3）的綠色熒光信號更強一些。（4）陰性對照（L.lactisNZ3900-pNZ8149 菌株）中未觀察到綠色熒光信號亮點，說明3 個重組乳酸乳球菌菌株都分別表達了外源蛋白，并成功展示于細胞壁上。

圖7 重組乳酸乳球菌工程菌間接免疫熒光結(jié)果Fig.7 Indirect immunofluorescence results of recombinant L.lactis engineerred strains

3 結(jié)論與討論

本試驗嘗試構(gòu)建了2 種RBD 串聯(lián)重復表達載體，并成功地在工程菌中獲得表達，表明RBD 的二聚體和三聚體形式具有模擬S1 蛋白中RBD 天然構(gòu)象并獲得高效免疫原性的可能性。本試驗應用基因工程技術成功構(gòu)建了表達2RBD 和3RBD 的乳酸乳球菌工程菌株，Western blot 檢測顯示表達2RBD 和3RBD 的工程菌分別在71.3 和96.3 kD 處有明顯的蛋白條帶，且在熒光顯微鏡觀察到綠色熒光信號，證明這2 種蛋白成功展示在乳酸菌表面。但3RBD較2RBD 熒光信號更弱一些，可能是因3RBD 肽鏈較2RBD 更長而導致展示效率降低所致，這與Quigley BR［21］的結(jié)論一致，說明外源蛋白越大越不容易穿過細胞膜和細胞壁結(jié)構(gòu)而展示在細胞壁上，進而影響其在L.lactis的表面展示效果。

相比于傳統(tǒng)疫苗，口服疫苗具有成本低廉、給藥方便，可以誘導黏膜免疫，從而刺激全身和粘膜部位的體液和細胞免疫反應，激活更加廣泛和持久的免疫效果。乳酸菌能以活菌的形式到達腸道并在其表面定植，可以作為口服疫苗遞送的載體，在發(fā)揮其益生功能的同時穩(wěn)定表達外源抗原，因此成為口服疫苗遞送載體的首選。目前常用的乳酸菌表達系統(tǒng)主要分為誘導型和組成型，組成型系統(tǒng)會持續(xù)表達蛋白，但持續(xù)表達會導致細胞內(nèi)蛋白質(zhì)蓄積、聚集，增加宿主菌的代謝負荷或損傷，而誘導型表達載體中目標基因的表達受誘導物控制，可實現(xiàn)目標蛋白高效誘導表達，避免了組成型表達對細胞的持續(xù)傷害?，F(xiàn)在常用的是人們所開發(fā)的由乳鏈菌肽(Nisin)控制的基因表達(NICE)系統(tǒng)，也是常用的系統(tǒng)［22］，所以本試驗采用此系統(tǒng)進行誘導表達。乳酸乳球菌常被用作基因工程的宿主菌［23］，采用乳酸乳球菌作為受體菌實現(xiàn)了外源蛋白的成功展示，證明乳酸乳球菌是植物乳桿菌外的第2 種可成功展示SARS-CoV-2 的刺突蛋白并表現(xiàn)出高抗原性的乳酸菌［24］。構(gòu)建乳酸菌食品級表面展示系統(tǒng)，可為表達展示酶分子、細胞因子、細菌或病毒的抗原、抗體和藥物分子等提供素材，所得工程菌可用于生產(chǎn)菌制劑、酶制劑、疫苗、抗體和蛋白藥物等產(chǎn)品，對乳酸菌在食品、發(fā)酵、醫(yī)藥等多領域的開發(fā)應用具有重要意義［25］。

本試驗將乳酸菌的生物學特征和食用安全性相結(jié)合，成功構(gòu)建了展示GFP 和新冠病毒omicron 變種抗原RBD 的乳酸乳球菌工程菌。這種方法克服了亞單位疫苗免疫原性弱的缺點，具有不需占用大量醫(yī)療資源，讓人們在日常生活中也能實現(xiàn)預防接種，為未來疫苗研發(fā)提供依據(jù)和新思路。