姚 軍,秦 勇,鄭賀云,張翠環(huán),再吐娜·買買提,汪志偉,耿新麗
(1.新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所,新疆鄯善 838200;2.新疆農(nóng)業(yè)大學園藝學院,烏魯木齊 830052)
【研究意義】無花果(FicuscaricaLinn.)屬桑科榕屬的落葉植物,我國無花果的主產(chǎn)區(qū)包括新疆、江蘇和浙江等地,無花果具有豐富的營養(yǎng)價值和較高的藥用價值,無花果葉片中含有黃酮[1-2]、多糖[3-4]、多酚[5-6]及香豆素等化合物成分[7-9]。這些成分具有較好的抗氧化[10]、抗炎[11]、抗菌[12,13],還對預防骨質(zhì)疏松[14]、降低血糖含量[15]等具有較好的作用。目前,研發(fā)新型保鮮劑的熱點主要集中在植物源材料上[16],無花果葉提取物無毒、廉價、綠色環(huán)保,將其應用于甜瓜的保鮮中具有廣闊的應用前景?!厩叭搜芯窟M展】在農(nóng)作物病害防治上丁香、銀杏、毛穗藜蘆等植物提取物具有較好的抑菌效果[17-21],無花果葉提取液對革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)[22]具有較顯著的抑菌作用。王桂亭等[23]研究表明,無花果葉乙醇提取物對金黃色葡萄球菌等 8 種常見菌株具有較顯著的抑菌效果。胡麗麗等[24]研究無花果葉主要活性物質(zhì)-補骨脂素的提取物對蘋果腐爛病菌、棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌表現(xiàn)出了較好的抑制效果?!颈狙芯壳腥朦c】目前研究僅停留在抑菌階段,應用于生產(chǎn)實踐的報道很少。鏈格孢與鐮刀菌是甜瓜貯藏期的主要致病菌,也是造成甜瓜腐爛損失的重要原因之一[25]。無花果葉提取液顯著的抑菌性能引起重視,目前更多的研究主要集中醫(yī)學方面,在果蔬保鮮方面的研究鮮見報道。需研究分析無花果葉提取液復合保鮮膜的研制及其在甜瓜保鮮上的應用效果?!緮M解決的關鍵問題】采用響應面法對無花果葉的提取工藝進行優(yōu)化,獲取含量和純度較高的黃酮類化合物為主的提取物,將提取物作用于甜瓜貯藏期主要的致病菌進行抑菌性驗證,分析無花果葉提取物在甜瓜貯藏保鮮上的抑菌性能,研究無花果葉提取液與成膜劑、抗氧化劑、其他助劑配成復合膜,優(yōu)選指標為腐爛率和失重率,利用正交試驗篩選出對甜瓜采后具有最佳保鮮效果的復合保鮮膜配方,為甜瓜采后植物源貯藏保鮮技術提供理論依據(jù)和技術支持。
1.1 材 料
無花果葉片(采自新疆鄯善縣周邊)、蘆丁指示劑、95%的乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、均為分析純;海藻酸鈉、蔗糖酯、檸檬酸均為食品級;FAD培養(yǎng)基。
鐮刀菌和鏈格孢,均從貯藏期的甜瓜腐爛部位分離純化得到,保存在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所甜瓜貯藏與運輸課題實驗室。
超聲波細胞粉碎儀(寧波新芝,型號Scientz-IID),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮,型號RE2000),超凈工作臺。
以甜瓜西州密25號為材料,選取相近糖度(可溶性固形物在14%~16%)、果形大小均勻的無病蟲斑、無機械損傷的果實。
1.2 方 法
1.2.1 原料預處理
除去無花果葉上的殘根雜質(zhì)、洗凈、自然陰干,放置于60℃干燥箱中烘干后粉碎,過80目篩成干粉備用。
1.2.2 無花果葉黃酮類的提取和測定
(1)無花果葉黃酮的提取。稱取無花果葉干粉5.0 g放入150 mL錐形瓶中,加入70%乙醇溶液100 mL,在室溫下浸泡12 h,放入超聲波細胞粉碎儀內(nèi)超聲30 min。用濾紙過濾處理后的無花果葉乙醇提取液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(溫度60℃)減壓蒸餾10 min,獲得無花果葉濃縮液,密封保存。
(2)無花果葉總黃酮標準曲線的繪制。取蘆丁標準品10 mg,用60%乙醇溶液溶解,定容于50 mL的容量瓶內(nèi),配成0.5 mg/mL的標準溶液。分別取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL的標準溶液加入到10 mL帶刻度的試管內(nèi),首先加入0.4 mL 5% 的NaNO2溶液靜置6 min;加入0.4 mL 10% 的Al(NO3)3溶液后靜置6 min;再加入4.0 mL 4.2% NaOH溶液后加蒸餾水定容至10 mL,靜置10 min。在波長510 nm下測定吸光值,根據(jù)吸光值繪制標準曲線。
標準曲線方程為:
C=0.107 3A-0.099 4R2=0.999 4.
式中,C為標準品蘆丁濃度C(mg/mL);A為吸光值。
(3)無花果葉黃酮取得率的計算。量取無花果葉浸提液4 mL,放入10 mL的刻度試管內(nèi),首先加入0.4 mL 5%的NaNO2溶液靜置6 min;然后加入0.4 mL 10%的Al(NO3)3溶液后靜置6 min;再加入4.0 mL 4.2%NaOH溶液后加蒸餾水定容至10 mL,靜置10 min。在波長510 nm下測定吸光值,代入標準曲線獲得樣品液的質(zhì)量濃度C(mg/mL)。由樣品液的體積V(mL)、樣品的質(zhì)量m(g)計算無花果葉總黃酮取得率(%)。
Y=(無花果葉黃酮質(zhì)量/無花果葉質(zhì)量)×100%=(C×V/m)×100%.
1.2.3 響應面法優(yōu)化無花果葉中總黃酮的提取工藝
分別以乙醇濃度、料液比、超聲時間為影響因素,設置三個因素的不同水平,分析不同提取條件下無花果葉中總黃酮取得率的影響,采用Box-behnken設計方法進行試驗設計。
1.2.4 無花果葉提取液抑菌性測定
將無花果葉按照提取工藝的優(yōu)化方案制備母液,將母液制成含系列濃度藥劑的PDA培養(yǎng)基中,有效成分濃度設計為100.000 0、50.000 0、25.000 0、12.500 0、6.250 0、3.125 0、1.562 5、0.781 25 μg/mL,采用無菌水作空白對照,各處理重復3次。選取殺菌劑阿米西達500倍液(主要成分25% 醚菌酯)與無花果葉提取液(相同濃度)進行對比試驗。將分離純化的鐮刀菌、鏈格孢菌株,在PDA培養(yǎng)基28℃下活化72 h, 然后用打孔器在近菌落邊緣取菌制成直徑為6 mm的菌餅,并轉(zhuǎn)接到含無花果葉提取液的PDA平皿和空白對照中。28℃ 培養(yǎng)72、96 h,采用十字交叉法量取菌落直徑。
菌絲生長平均抑制率 =[(對照菌落直徑均值-處理菌落直徑均值)/(對照菌落直徑均值-接種菌餅直徑)]×100%。
1.2.5 無花果提取液復合膜保鮮劑的配制
稱取一定量的成膜劑海藻酸鈉,加入適量蒸餾水溶脹8 h,攪拌溶解;然后加入檸檬酸,攪拌溶解;再加入溶解后的蔗糖酯,最后加入無花果提取液,各組分按1∶1∶1∶1比例混合,攪拌均勻,配制成各種濃度的無花果提取液復合膜保鮮劑,備用。
1.2.6 甜瓜采后處理最佳復合保鮮膜配方篩選
選取海藻酸鈉作為被膜劑,檸檬酸作為抗氧化劑,并添加蔗糖酯作為助劑,無花果葉提取劑作為殺菌劑,組成無花果葉提取劑復合膜。每種成分設置3個濃度,采用L9(34)即3水平4因素的正交試驗。表1
表1 L9(34)3水平4因素的正交試驗
按正交試驗設計順序手工均勻涂膜各種果實,于干燥陰涼處自然晾干。每個處理10個果實,共計81個處理,將各處理哈密瓜置于6~8℃冷庫內(nèi)貯藏,每5 d統(tǒng)計各處理的腐爛率和失重率。以腐爛率和失重率為正交試驗主要指標,進行極差及方差分析,確定應用于甜瓜生產(chǎn)中無花果葉提取液復合膜保鮮劑的最佳組成配方。
1.3 數(shù)據(jù)處理
每個指標測定值利用Excel進行統(tǒng)計分析并繪圖,響應面分析采用designer expert軟件完成,數(shù)據(jù)的方差分析(ANOVA)利用SPSS.17.0數(shù)據(jù)處理軟件完成,并采用Duncan’s多重比較法進行差異顯著性分析。
2.1 響應面法各因素各水平的判定
2.1.1 響應面法優(yōu)化無花果葉總黃酮的提取工藝
研究表明,以乙醇濃度%(A)、超聲時間min(B)、料液比%(C)為自變量,總黃酮得率Y為響應值,采用designer expert軟件對響應面分析。響應值Y與自變量A、B、C擬合得到的響應面二次方程為:
Y(mg/g)=-42.550 84+0.766 06A+0.771 22B+56.270 23C-2.100 001 0-4AB+0.329 63AC-1.566 67BC-5.145 001 0-3A2-9.705 001 0-3B2-118.655 69C2。
2.1.2 響應面
研究表明,失擬項不顯著(P=0.105 9>0.05),模型中一次項C為極顯著,二次項A2、B2為極顯著,B、C為顯著;整體模型的顯著水平P<0.01,該模型為極顯著。Pred(R2)為0.952 8而Adj(R2)為0.892 1,擬合的模型方程較好。表2,表3
表2 響應面結果
表3 回歸模型方差
2.1.3 各因素相互作用對無花果葉總黃酮取得率的影響
研究表明,無花果葉總黃酮取得率的影響最為顯著的因素為料液比和乙醇濃度,表現(xiàn)為曲線較陡,超聲時間影響較小,曲線較平滑,無花果葉黃酮取得率的變化較小。圖1
圖1 各因素對提取率的響應面
2.1.4 條件的優(yōu)化與驗證
研究表明,最優(yōu)提取工藝條件為:乙醇濃度79.73%、超聲時間為36.81 min、料液比為1∶24,理論含量為1.58%,試驗所得結果為1.53%,實際含量和理論含量相對誤差為2.96%,二者較為接近,因此響應面設計所得結果準確可靠。
2.2 無花果葉提取液的抑菌效果
研究表明,隨著各處理濃度的增大,兩種菌株的菌株直徑逐漸減小,無花果葉具有抑制甜瓜貯藏期真菌病害的作用。各處理濃度之間差異達到顯著甚至極顯著水平,其中無花果葉提取液各處理濃度之間對鐮刀菌的抑制均達到了極顯著水平。對比無花果葉提取液和藥劑阿米西達的抑制效果,無花果葉提取液的抑制效果較化學殺菌劑略差,100 μg/mL 處理濃度抑菌率低于化學殺菌劑的18.17%和17.84%。表4
表4 無花果葉提取液和阿米西達下甜瓜真菌病害鐮刀菌和鏈格孢抑菌性變化
2.3 無花果葉提取液復合保鮮膜的研制
研究表明,各因素水平對哈密瓜失重率影響的強弱順序為A3>A1>A2,B3>B1>B2,C2>C3>C1,D2>D1>D3。表5
表5 單因素統(tǒng)計(失重率)
各因素在不同水平下腐爛率的平均值,通過分析,可以判定各因素水平對哈密瓜腐爛率影響的強弱順序為A3>A2>A1,B2>B3>B1,C2>C1>C3,D1>D2>D3。表6
表6 單因素統(tǒng)計(腐爛率)
最優(yōu)組合是A3B2C2D1,失重率來看,最優(yōu)組合是A3B3C2D2。A因素對腐爛率和失重率的影響均排名第一,A因素應取A3;B因素對腐爛率和失重率的影響分別排名第二位和第三位,分析結果看,B因素應取B2、B3,取B2時,失重率比取B3減少6.35%,取B3時,腐爛率比B2減少19.47%,所以B因素應取B2; C因素對腐爛率和失重率的影響分別排名第四位和第三位,C因素應取C2,D因素對腐爛率和失重率的影響分別排名第四位和第三位,D因素應取D1、D2,取D1時,腐爛率比取D2減低12.89%,取D2時,失重率比取D1減少2.31%,所以D因素應取D2。所以得到的最優(yōu)組合為A3B2C2D2,即80 mg/mL無花果提取液+1.5%海藻酸鈉+500 mg/L檸檬酸+0.5%蔗糖酯的混合液。表7
表7 甜瓜植物復合保鮮膜正交試驗與極差
3.1模型的擬合程度良好,殘差均由隨機誤差引起,未知因素對試驗結果干擾較小[26]。響應曲面圖中,曲線走勢越陡,影響越顯著,曲線走勢越平滑,影響越小[27]。植物源殺菌劑低毒、低殘留、易降解、不易引起抗藥性等特點是有機合成農(nóng)藥無法比擬的[28-29]。通過design expert 軟件得出的最優(yōu)提取工藝條件為:乙醇濃度79.73%、超聲時間為36.81 min、料液比為1∶24,理論得率為1.58%,試驗所得結果為1.53%,實際得率和理論得率相對誤差為2.96%,二者較為接近,因此響應面設計所得結果準確可靠,此模型可以用于無花果葉總黃酮提取工藝的優(yōu)化。
3.2通過十字交叉法測定無花果葉提取液對甜瓜貯藏期主要的病原菌鐮刀菌和鏈格孢菌的抑菌試驗,與市售的殺菌劑阿米西達抑菌性進行比較。發(fā)現(xiàn)無花果葉具有抑制甜瓜貯藏期真菌病害的作用,且不同濃度之間差異達到顯著和極顯著水平。但抑制效果較化學殺菌劑略差,100 μg/mL 處理濃度時抑菌率低于化學殺菌劑的18.17%和17.84%。植物源殺菌劑低毒、低殘留、易降解、不易引起抗藥性。
無花果葉提取液的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇體積百分比為79.73%、超聲時間為36.81 min、料液比為1∶24。并采用十字交叉法測定提取液對甜瓜采后主要病原菌鐮刀菌、鏈格孢的抑菌效果,無花果葉提取液各處理濃度對鐮刀菌的抑制效果達到了極顯著水平。無花果葉提取液復合膜保鮮的最佳組合是A3B2C2D2,即80 mg/mL無花果提取液+1.5%海藻酸鈉+500 mg/L檸檬酸+0.5%蔗糖酯按1∶1∶1∶1比例混合。無花果葉提取液的復合保鮮膜在減少甜瓜貯藏期腐爛率和失重率降低上效果明顯。