李進良， 胡雙飛， 蒙奮兆， 李沛波，吳灝， 彭維， 蘇薇薇， 王永剛， 孫維廣

1.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 / 廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心 /廣東省熱帶亞熱帶植物資源重點實驗室，廣東 廣州 510275

2.廣州白云山星群（藥業(yè)）股份有限公司，廣東 廣州 510288

干眼癥稱為角結(jié)膜干燥癥（KCS），具有干澀、異物感、燒灼感和流淚增多等多種癥狀，全球干眼癥患病率為5%～50%，女性和老年人群中患病率更高，嚴(yán)重影響了患者的工作效率與生活質(zhì)量（Zhao et al.，2023）。目前，干眼癥治療主要依靠西醫(yī)治療。西醫(yī)治療效果顯著，但副作用嚴(yán)重且價格昂貴，給患者家庭乃至社會造成了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)（吳改萍，2022；Demolin et al.，2023）。因此，亟須尋找一種經(jīng)濟、有效、安全性好的治療方法。中醫(yī)藥具有原材料取自天然藥材，臨床表現(xiàn)為安全性高、副作用低等特點，中醫(yī)治療備受干眼癥患者的關(guān)注。中藥具有多成分、多靶點整體調(diào)節(jié)效果，可能是治療干眼癥的理想用藥。

夏桑菊（XSJ ，Xiasangju）是一種傳統(tǒng)的中藥復(fù)方，主要由夏枯草、桑葉和野菊花組成，源自清代著名溫病學(xué)家吳鞠通《溫病調(diào)辨》中的經(jīng)典方劑“桑菊飲”（孫鵬等，2016）?！吨袊幍洹罚?020 版）中記載其具有清肝明目，疏風(fēng)散熱功效，能夠用于頭暈耳鳴、風(fēng)熱感冒等疾病的治療；且其原料取自藥食兩用藥材，安全可靠。夏桑菊以蒙花苷（linarin）、綠原酸（CA，chlorogenic acid）、迷迭香酸（RA，rosmarinic acid）等化合物為主要藥效成分，抗炎、抗氧化活性效果明顯，具備眼部疾病保健、預(yù)防、醫(yī)療潛力（Wu et al.，2022）。姚向超等（2015）將野菊花開發(fā)成滴眼液治療蒸發(fā)過強型干眼，發(fā)現(xiàn)可以減輕干眼眼表的炎癥反應(yīng)。石守禮（1978）從中草藥中篩選出夏枯草、菊花等配制成紅眼1號眼藥水治療急性結(jié)膜炎患者，發(fā)現(xiàn)治療2～4 d 即可痊愈。魚俊杰等采用中藥菊花、桑葉等制成清明眼藥水，治療電光性眼炎310例，總有效率99.97%。臨床結(jié)果表明，清明眼藥水是一種療效好、療程短的中藥滴眼劑。以上表明，夏桑菊具有治療干眼癥潛力（魚俊杰等，1992）。然而，夏桑菊治療干眼癥的臨床及作用機制研究尚未報道，未充分發(fā)揮藥典對臨床用藥的指導(dǎo)作用。

本研究采用廣州白云山星群（藥業(yè)）股份有限公司的夏桑菊浸膏，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)，探究夏桑菊防治干眼癥相關(guān)的有效成分、關(guān)鍵靶點以及過程中可能涉及的生物過程和信號通路。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用分子對接驗證，通過體外細(xì)胞實驗驗證，進一步探索夏桑菊有效成分對相關(guān)關(guān)鍵靶點的作用，為夏桑菊的外用劑型開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

綠原酸（110753-202119）、蒙花苷（111528-202112）、迷迭香酸（111871-202007）均購于中國食品藥品檢定研究院，其他材料為：HCE-T 人角膜上皮細(xì)胞系（富衡生物，F(xiàn)H1239）、夏桑菊浸膏（廣州白云山星群（藥業(yè)）股份有限公司，B220301）、TNF-α 檢測試劑盒（云克隆Cloud-clone，SEA133 Hu）等。

1.2 方法

1.2.1 夏桑菊化學(xué)成分檢測色譜條件參照《中國藥典》夏桑菊顆粒含量測定方法。離子源：ESⅠ（正、負(fù)離子模式檢測）；噴霧電壓正模式5 500 Ⅴ，負(fù)模式-4 500 Ⅴ；噴霧氣為 55 psi（1 psi = 1/145 MPa）；輔助加熱氣50 psi；離子源溫度500 ℃；氣簾氣35 psi；碰撞器壓力10 psi；掃描范圍m/z50～1 500。

1.2.2 化學(xué)成分對應(yīng)靶點及疾病相關(guān)靶點收集通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索活性成分作用靶點，根據(jù)類藥性（DL） ≥ 0.18，并結(jié)合文獻對未納入篩選標(biāo)準(zhǔn)但報道有生物活性和藥理作用的成分也納入候選活性成分，篩選得到夏桑菊浸膏活性成分的作用靶點。以“xerophthalmia”為關(guān)鍵詞，在Gene‐cards 數(shù)據(jù)庫中檢索干眼癥相關(guān)靶點，整理合并得到干眼癥對應(yīng)的疾病靶點。

1.2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”及PPⅠ網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建利用網(wǎng)站Ⅴenny 2.1.0 得到夏桑菊浸膏活性成分主要作用靶點。將上述靶點導(dǎo)入Cytoscape3.9.1 及String 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建“夏桑菊浸膏-成分-靶點-疾病”及PPⅠ網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4 信號通路富集分析及分子對接利用DAⅤⅠD 數(shù)據(jù)庫對作用靶點進行GO（gene ontology）及KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析，選取夏桑菊浸膏核心成分和PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中score排名前4的核心靶點，利用PubChem 數(shù)據(jù)庫、ChemBioOffice Ultra 13.0.2-Chem3D、PyMOL 2.5.2、AutoDockTools-1.5.7軟件進行分子對接。

1.2.5 夏桑菊有效成分體外細(xì)胞模型驗證

1） MTS 法檢測細(xì)胞活力。細(xì)胞用不同濃度（30、50、70、90、110、130 mmol/L）NaCl 分別模擬（350、400、450、500、550、600 mOsm/L）滲透壓處理人角膜上皮細(xì)胞24 h，更換培養(yǎng)基，加入20 μL MTS 孵育2 h 后，采用酶標(biāo)儀測定波長490 nm 處吸光度值，按公式計算得各組的細(xì)胞活力

2）研究有效成分對高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞的保護作用。實驗分設(shè)不同組，采用600 mOsm/L（130 mmol/L NaCl ）滲透壓造模并同時給藥，MTS檢測細(xì)胞活力。

3）劃痕實驗。使用移液管在人角膜上皮細(xì)胞上劃出數(shù)條劃痕，倒置顯微鏡拍0、24 h 圖像，觀察實驗重復(fù)3次，并計算平均值。

4）Elisa 法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清中炎癥因子TNF-α 的蛋白濃度。細(xì)胞按實驗設(shè)計分組并做相應(yīng)處理，每組處理24 h，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清。

5）對高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)的檢測。細(xì)胞按實驗設(shè)計分組并做相應(yīng)處理，處理24 h，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA 后于-20 ℃條件下保存。采用實時熒光定量基因擴增儀擴增各組cDNA目的基因。

以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

6）統(tǒng)計學(xué)分析。采用GraphPad Prism 8.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果采用單因素方差分析，P＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 夏桑菊浸膏活性組分的UFLC-Triple-TOFMS/MS分析

采用UFLC-Triple-TOF-MS/MS 技術(shù)，分別在正、負(fù)離子模式下分析夏桑菊浸膏組成，其總離子流圖如圖1所示。通過與標(biāo)準(zhǔn)品和公開數(shù)據(jù)庫的一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對，共指認(rèn)了61個化合物，其中包括19 種黃酮類化合物，17 種有機酸及其酯類化合物，5 種氨基酸類化合物，3 種核苷類化合物以及17 種其他化合物。為進一步利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測其治療干眼癥藥效及藥效作用機制提供了物質(zhì)組成的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖1 夏桑菊浸膏總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of Xiasangju extracts

2.2 活性成分及疾病相關(guān)靶點收集

根據(jù)UFLC-Triple-TOF-MS/MS 結(jié)果，采用DL≥0.18標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合文獻對未納入篩選標(biāo)準(zhǔn)但報道有生物活性和藥理作用的成分（高蒲星等，2023），共獲得24 個活性成分，通過數(shù)據(jù)庫搜索及可視化處理，共得夏桑菊浸膏活性成分相關(guān)靶點315個及“夏桑菊-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)圖中共有339個節(jié)點和605條邊。

圖2 “夏桑菊浸膏-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Xiasangju extracts-component-target network diagram

通過Genecards 數(shù)據(jù)庫檢索得到干眼癥相關(guān)靶點共146 個，與夏桑菊浸膏成分對應(yīng)靶點取交集，如圖3所示，得到夏桑菊浸膏治療干眼癥主要作用靶點21個。

圖3 夏桑菊浸膏成分潛在靶點與疾病靶點 Ⅴenny 圖Fig.3 Ⅴenny diagram of potential targets and disease targets of compounds of Xiasangju extracts

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

2.3.1 “夏桑菊-成分-主要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)將上述夏桑菊主要靶點及疾病靶點可視化處理，構(gòu)建“夏桑菊-成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。節(jié)點熊果酸、山柰酚、迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷、蘆丁的度值（degree）排名前6。這6種成分作用靶點數(shù)量較多，表明它們可能是夏桑菊中主要藥理活性成分。參考2020年版《中國藥典》選擇夏枯草、桑葉、野菊花測定指標(biāo)分別為迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷作為夏桑菊顆粒成分定量測定的3個質(zhì)量控制成分，因此選取這3 種成分作為夏桑菊核心成分，后續(xù)進行分子對接操作及體外細(xì)胞實驗驗證。

圖4 “夏桑菊浸膏-成分-主要靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Xiasangju extracts-component-target-disease network diagram

2.3.2 PPⅠ網(wǎng)絡(luò)將21 個交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫分析，得到PPⅠ蛋白互作圖（圖5）。其中度值排名前4 的節(jié)點為MMP9、IL-1β、Caspase1、IL-6，表明這些節(jié)點在PPⅠ網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，節(jié)點聯(lián)系較為緊密，可能為夏桑菊治療干眼癥的核心靶點。因此選取這4個靶點作為核心靶點進行后續(xù)分子對接操作及體外細(xì)胞實驗驗證。

2.3.3 GO 和KEGG 富集分析利用DAⅤⅠD 數(shù)據(jù)庫對作用靶點富集分析。靶點基因主要參與T細(xì)胞增殖的正調(diào)控細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞表面受體信號通路等生物學(xué)進程，對應(yīng)細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜外側(cè)、細(xì)胞表面等細(xì)胞組分以及細(xì)胞因子活性、生長因子活性、信號受體活性等分子功能。GO 分析結(jié)果按P值從小到大排序，排名前10的條目見圖6。

圖6 GO分析結(jié)果Fig.6 GO analysis results

此外，上述靶點共富集得到66條KEGG 通路，相關(guān)通路有細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、晚期糖基化產(chǎn)物-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGE-RAGE）信號通路、TNF 信號通路、ⅠL-17 信號通路、NF-κ B 信號通路等。富集通路按P值從小到大排序，將上述結(jié)果導(dǎo)入R 語言進行可視化，結(jié)果如圖7所示。

圖7 KEGG分析Fig.7 KEGG analysis results

2.4 分子對接

利用Ⅴina 軟件將綠原酸、迷迭香酸、蒙花苷分別與MMP9、Caspase1、IL-1β、IL-6這4 個核心靶點對應(yīng)的蛋白質(zhì)建立分子對接模型，預(yù)測12 種對接結(jié)果見表1。其中，結(jié)合能數(shù)值＜ -5.0 kJ /mol時表示結(jié)合較好，＜ -7.0 kJ/mol代表結(jié)合強烈（鄭蘇楠等，2022）。結(jié)果顯示預(yù)測結(jié)合能均＜ -6 kJ /mol，代表結(jié)合的可能性較高。如圖8 顯示MMP9 通過GLU-402、GLY-186、TYR-423 與蒙花苷形成氫鍵結(jié)合，Caspase1 通過ARG-240、GLU-241、ARG-391與蒙花苷形成氫鍵結(jié)合。

表1 分子對接最低結(jié)合能Table 1 Minimum binding energy for molecular docking kJ/mol

圖8 分子對接模式圖Fig.8 Molecular docking model diagram

2.5 不同滲透壓對人角膜上皮細(xì)胞活力的影響

MTS 結(jié)果如圖9 所示，不同滲透壓處理24 h，滲透壓350、400、450 mOsm/L 時對人角膜上皮細(xì)胞的活性無顯著性影響，500～600 mOsm/L 時降低了人角膜上皮細(xì)胞活性?；跐B透壓為600 mOsm/L時能夠顯著降低人角膜上皮細(xì)胞活力（P＜ 0.01）。因此，后續(xù)選用600 mOsm/L 滲透壓處理，以探究迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷3種有效成分對細(xì)胞的保護作用；滲透壓 ≤ 450 mOsm/L 時，對人角膜上皮細(xì)胞的活性無顯著性影響，故選用450 mOsm/L滲透壓造模探究迷迭香酸、綠原酸、蒙花苷對細(xì)胞的保護作用機制及遷移能力。

圖9 不同滲透壓處理24 h對人角膜上皮細(xì)胞細(xì)胞活性的影響 （n=3）Fig.9 Effects of different hyperosmosis treatment for 24 h on the cell activity of human corneal epithelial cells (n=3)

2.6 主要活性成分對高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的保護作用

將人角膜上皮細(xì)胞在600 mOsm/L 滲透壓培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后，與對照組相比，600 mOsm/L 組的細(xì)胞活力降至49.3%（P＜ 0.01）。與600 mOsm/L比較，蒙花苷可顯著提高人角膜上皮細(xì)胞活性，細(xì)胞活性提高到74.8%（P＜ 0.05），如圖10 所示。表明蒙花苷對高滲透壓所致的細(xì)胞活性降低具有顯著抑制作用。

圖10 3種主要活性成分對高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的保護作用的影響（n=3）Fig.10 Effects of 3 major active components on the protection of human corneal epithelial cells induced by hyperosmosis (n=3)

2.7 對高滲誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞的遷移能力的影響

為探討3種活性成分是否在體外對人角膜上皮細(xì)胞具有促進修復(fù)的功能，通過劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力。在24 h 高滲刺激后，正常對照組中角膜上皮細(xì)胞的遷移率為54.55%，450 mOsm/L的刺激條件下僅為9.04%，正常組與模型組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.01）；在綠原酸及蒙花苷的作用下，遷移率升高到32%及18%，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜ 0.05），研究表明 450 mOsm/L 的高滲刺激會降低角膜上皮細(xì)胞的遷移能力，而綠原酸及蒙花苷能提升高滲下角膜上皮細(xì)胞的移行能力，如圖11顯示。

圖11 實驗條件下24 h后的20 倍鏡劃痕實驗的代表性圖和量化統(tǒng)計圖 （n=3）Fig.11 Representative diagram and quantitative statistical plots of 20-fold mirror scratch experiment after 24 hours under experimental conditions （n=3）

2.8 對高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞IL-1β 及Caspase1基因的表達(dá)

PCR 結(jié)果顯示，450 mOsm/L 組IL-1β、Cas‐pase1mRNA 的相對表達(dá)量與正常對照組相比升高（P＜0.01）；與450 mOsm/L 相比，迷迭香酸、綠原酸組中的Caspase1、IL-1βmRNA 的相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），蒙花苷組中的Caspase1mRNA的相對表達(dá)量顯著降低。如圖12 所示3 種有效成分能夠有效抑制高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞中IL-1β及Caspase1基因表達(dá)。

圖12 3種活性成分對高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞IL-1β、Caspase1基因的表達(dá)的影響（n=3）Fig.12 Effects of 3 major active components on the expression of IL-1β and Caspase1 genes in human corneal epithelial cells induced by hyperosmosis (n=3)

2.9 對高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞分泌TNF-α 水平的影響

Elisa 結(jié)果顯示， 與正常對照組相比，450 mOsm/L 組中的TNF-α 蛋白濃度明顯升高（P＜ 0.05）；與450 mOsm/L 組相比，迷迭香酸、綠原酸組的TNF-α蛋白濃度明顯降低（P＜ 0.05）如圖13 所示。表明迷迭香酸、綠原酸有效抑制了細(xì)胞中炎癥因子TNF-α的分泌。

圖13 3種活性成分對高滲誘導(dǎo)下人角膜上皮細(xì)胞分泌TNF-α 水平的影響（n=3）Fig.13 Effects of 3 major active components on the secretion of TNF-α by human corneal epithelial cells induced by hyperosmosis (n=3)

3 討 論

通過UFLC-Triple-TOF-MS/MS 技術(shù)共指認(rèn)61個化合物，篩選獲得夏桑菊中24 種化合物成分，在“夏桑菊-化合物-靶點”網(wǎng)絡(luò)中，發(fā)揮藥效作用最活躍的成分為熊果酸、山柰酚、綠原酸、迷迭香酸、蘆丁、蒙花苷。研究表明，這6種化合物能夠抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕眼部炎癥和細(xì)胞損傷（Chen et al，2021；李亞梅等，2020；胡盼盼，2021；羅飛等，2021）。夏桑菊浸膏中的6 種活躍成分起到治療干眼癥的關(guān)鍵作用。

PPⅠ網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點分析，夏桑菊通過MMP9、IL-1β、Caspase1、IL-6等關(guān)鍵靶點發(fā)揮藥效作用。該4個靶點與干眼癥密切相關(guān)，其中Caspase1、ⅠL-1β 為已報道ROS-NLRP3-ⅠL-1β 信號通路中的成分（周洋等，2020）。高滲產(chǎn)生的ROS可誘導(dǎo)NLRP3的激活，進而促進Caspase-1 激活導(dǎo)致ⅠL-1β 分泌增加，突出了ROS-NLRP3-ⅠL-1β 信號軸在干眼癥進展過程中的啟動作用（Dai et al.，2019）。因此，本研究利用氯化鈉誘導(dǎo)的人角膜上皮細(xì)胞高滲模型研究發(fā)現(xiàn)，迷迭香酸、綠原酸及蒙花苷對高滲誘導(dǎo)下對人角膜上皮細(xì)胞具有保護及提升遷移能力作用；在基因轉(zhuǎn)錄水平上，3 種有效成分下調(diào)Caspase1和IL-1β的mRNA 表達(dá)，減少促炎介質(zhì)產(chǎn)生；這與本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果相互印證。

通過GO、KEGG 結(jié)果分析，細(xì)胞因子和其受體相互作用在干眼癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。例如，ⅠL-1β、ⅠL-6、ⅠL-17、TNF 等多種細(xì)胞因子及受體的水平在干眼癥患者的淚液中明顯升高，這些細(xì)胞因子刺激角膜、結(jié)膜和淚腺上皮細(xì)胞分泌更多的炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，從而引起眼部組織的炎癥反應(yīng)和損傷（Liu et al.，2020；Liang et al.，2020；Wei et al.，2014）。AGE-RAGE 信號通路在干眼癥的發(fā)病過程中也發(fā)揮了重要作用。RAGE是一種跨膜受體，廣泛表達(dá)于多種類型細(xì)胞上，包括免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和肌肉細(xì)胞等，與AGE結(jié)合后可以激活多種信號通路，從而引起炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡等（Kaji et al.，2006）。研究表明，在干眼癥患者的淚液和角膜中，AGE 和RAGE 的水平均明顯升高，這與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)（Wang et al.，2011）。AGE-RAGE 的激活使得炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的發(fā)生，從而導(dǎo)致眼部組織的損傷和炎癥反應(yīng)。本研究通過體外細(xì)胞模型驗證了高滲誘導(dǎo)下IL-1β基因表達(dá)及TNF-α 蛋白分泌水平升高，進一步揭示了GO與KEGG結(jié)果的可靠性。

分子對接結(jié)果表明，3 種化合物與4 個靶點有較好的結(jié)合能力，此外，體外實驗結(jié)果也顯示3種化合物能對相關(guān)蛋白及基因發(fā)揮作用。進一步說明分子對接結(jié)果的可靠性。后續(xù)將對該研究進一步探究，確定這些化合物的治療劑量和途徑。

綜上，本研究聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與體外細(xì)胞實驗，初步闡釋了夏桑菊的物質(zhì)基礎(chǔ)與其防治干眼癥的作用機制，并挖掘了更多可能靶點，為進一步研究其機制提供了基礎(chǔ)與方向。