摘要：目的 探討附子多糖（Aconiti Lateralis Radix Praeparata polysaccharide， ACP）的結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)RAW264.7細(xì)胞的免疫活性影響。方法 采用水提醇沉的方法獲得附子粗多糖，通過(guò)陰離子交換色譜柱和分子篩凝膠色譜柱對(duì)附子粗多糖進(jìn)行分離、純化，獲得ACP。采用高效凝膠滲透色譜法測(cè)定ACP的分子量分布；采用離子色譜法測(cè)定ACP的單糖組成；采用甲基化實(shí)驗(yàn)及核磁圖譜解析ACP的糖苷鍵類(lèi)型及多糖一級(jí)結(jié)構(gòu)。最后，通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，測(cè)定ACP對(duì)于RAW 264.7細(xì)胞的作用。結(jié)果與結(jié)論 從附子中分離得到一種分子量為11.37 kDa的均一多糖，該多糖主要由葡萄糖組成，且以→4）-Glcp-（1→糖苷鍵為主鏈的結(jié)構(gòu)，端基Glcp-（1→為支鏈經(jīng)→4，6）-Glcp-（1→的O-6鏈接到主鏈。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ACP能夠促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6及腫瘤壞死因子（TNF-α）分泌，具有一定的免疫活性。

關(guān)鍵詞：附子；多糖；結(jié)構(gòu)表征；免疫活性；葡聚糖；RAW 264.7細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：R932 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Extraction， purification， structural characterization of polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata and its biological evaluation on immune activity of RAW 264.7 cells

Xie Yiheng， Zhang Rui， Guo HaiYang， Zhang Xue， and Li Xiaojun

（Medical college， Yangzhou University， Yangzhou 225009）

Abstract Objective To characterize the chemical structure of polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata （ACP） and evaluate its immunological activity on RAW 264.7 cells. Methods Crude polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata was extracted by hot water extraction and the alcohol precipitation method， and purified by the anion exchange chromatography column and the gel chromatography column to obtain homogeneous ACP. The homogeneity and molecular weight distribution of ACP were determined by high-performance gel permeation chromatography （HPGPC）， the monosaccharide composition was determined by ion chromatography， and the glycosidic bond type and primary structure of ACP were elucidated by methylation experiments and NMR spectroscopy. Finally， the effects of ACP on macrophages were determined by in vitro cell experiments. Results and conclusions ACP was successfully isolated from Aconiti Lateralis Radix Praeparata with a molecular weight of 11.37 kDa. The ACP was mainly composed of glucose， and the backbone of ACP was →4）-Glcp-（1→ glycosidic bond as the main chain， and the terminal Glcp-（1→ as the brached chain through O-6 linkage of →4，6）-Glcp-（1→ linked to the main chain. The in vitro experiment results showed that ACP promoted the secretion of inflammatory factors including IL-1β， IL-6， iNOS， and TNF-α within a certain concentration range， indicating the immunological activity of ACP.

Key words Aconiti Lateralis Radix Praeparata; Polysaccharide; Structural characterization; Immunoregulatory activity; Glycan; RAW 264.7 cells

附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata），為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品，具有溫經(jīng)散邪止痛、溫臟助陽(yáng)、回陽(yáng)救逆、溫陽(yáng)利水和活血化瘀的功效，在中國(guó)和其他亞洲國(guó)家被廣泛使用的傳統(tǒng)草藥[1]。在臨床實(shí)踐中，它通常用于治療心力衰竭、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和各種疼痛[2]。附子提取物及其活性成分具有顯著的抗癌、抗炎和鎮(zhèn)痛作用[3]。目前認(rèn)為，附子的主要活性成分是水溶性成分，包括生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)、香豆素苷及尿嘧啶

等[4]。附子中生物堿和多糖是其發(fā)揮抗癌作用的主要成分[5-6]，其中生物堿類(lèi)研究較多[7]，附子多糖作為附子的主要功能成分逐漸被關(guān)注[8]。

多糖（polysaccharides）是一類(lèi)由多個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子化合物。中藥多糖具有毒性小、安全性高、功能廣泛等優(yōu)點(diǎn)[9]，其開(kāi)發(fā)與研究成了近些年中藥創(chuàng)新研究的熱點(diǎn)，并表現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。中藥多糖可以通過(guò)不同的作用機(jī)制發(fā)揮不同的生物活性，例如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗炎、神經(jīng)保護(hù)和抗病毒等作用[10]。

目前對(duì)附子多糖的藥理特性的研究主要集中在心血管系統(tǒng)方面[8]，且不同來(lái)源、不同處理方式所得到的附子多糖結(jié)構(gòu)不盡相同；更重要的是，大多數(shù)研究局限在附子多糖的提取純化方面，而對(duì)附子多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)研究甚少。因此，進(jìn)一步探究附子多糖精細(xì)結(jié)構(gòu)以及附子多糖構(gòu)效關(guān)系具有重要的意義。本研究首先從附子中提取粗多糖，經(jīng)過(guò)一系列的分離純化獲得均一多糖（ACP），進(jìn)一步對(duì)該均一多糖進(jìn)行結(jié)構(gòu)信息表征并闡明其一級(jí)結(jié)構(gòu)。并采用RAW 264.7細(xì)胞，評(píng)估該均一多糖對(duì)免疫細(xì)胞活性影響，以期為附子的開(kāi)發(fā)利用提供理論參考，并為免疫增強(qiáng)藥物發(fā)現(xiàn)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要用到的儀器有LC-10A型高效液相色譜儀、RI-10A型示差檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）；多糖凝膠純化系統(tǒng)（型號(hào)BTR-GS）、BRT105-103-101

（8.0 mm× 300 mm）串聯(lián)凝膠柱、甲基化試劑盒、BSZ-100型自動(dòng)收集器和單糖標(biāo)準(zhǔn)品（揚(yáng)州博睿糖公司）；ICS5000型離子色譜儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）； 6890-5973型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）（美國(guó)Agilent公司）；Bruker Avance 600型核磁共振光譜儀（德國(guó)Bruker公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek公司）。分子量標(biāo)準(zhǔn)品（1152，5000，11600，23800，48600，80900，148000和273000）（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 多糖的提取、分離與純化

采用常規(guī)的熱水浸提和乙醇沉淀法[11]對(duì)3 kg的烏頭子根（產(chǎn)于四川江油的皺皮附子，經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)曹海峰教授鑒定為附子）進(jìn)行提取。以料液比1 ： 30進(jìn)行熱水提取，每次提取3 h。合并3次提取液，濃縮至1 L，加入無(wú)水乙醇至終濃度為80%攪拌靜止過(guò)夜。對(duì)混懸液進(jìn)行離心，以6000 r/min離心10 min，收集沉淀。用Sevage試劑進(jìn)行脫蛋白處理，詳細(xì)工藝流程，見(jiàn)圖1。隨后，采用DE-52纖維素柱進(jìn)行分離，分別用純水、0.2、0.5和1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。采用苯酚硫酸法于490 nm波長(zhǎng)進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測(cè)，繪制洗脫曲線(xiàn)，并收集洗脫樣品。根據(jù)洗脫曲線(xiàn)收集各部位多糖，進(jìn)行凍干計(jì)算得率，并命名為ACP-W、ACP-0.2、ACP-0.5和ACP-1.0。其中，ACP-W進(jìn)一步經(jīng)多糖凝膠純化系統(tǒng)進(jìn)行在線(xiàn)純化，用0. 2 mol/L氯化鈉溶液洗脫，得到ACP，凍干、備用。

1.3 多糖純度及分子量測(cè)定

采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）配置示差檢測(cè)器和BRT105-103-101串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm），對(duì)ACP進(jìn)行分子量和純度測(cè)定[12]。ACP經(jīng)0.05 mol/L

NaCl溶解成5 mg/mL，進(jìn)樣量為20 μL，流動(dòng)相為

0.05 mol/L NaCl，流速為0.6 mL/min。

1.4 單糖組成分析

精確稱(chēng)取4 mg的ACP樣品，加入2 mL 3 mol/L的三氟乙酸在120 ℃進(jìn)行水解。待水解3 h后，進(jìn)行氮吹干。隨后加入4 mL超純水進(jìn)行渦旋，待樣品完全溶解后離心。上清液按照1：20加入去離子水進(jìn)行稀釋后上機(jī)。采用離子色譜系統(tǒng)配置Dionex Carbopac PA20 （3 mm×150 mm） 色譜柱和電化學(xué)檢測(cè)器，對(duì)樣品進(jìn)行分析。進(jìn)樣量為5 μL，流動(dòng)相為A：H2O；B：15 mmol/L NaOH、C：15 mmol/L NaOH中含

100 mmol/L NaOAC。洗脫方法如下表1所示，流速為0.3 mL/min。

1.5 甲基化分析

ACP樣品的糖苷鍵分析采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)的方法。首先，對(duì)ACP樣品進(jìn)行甲基化，隨后甲基化產(chǎn)物進(jìn)行水解和乙酰化反應(yīng)[13]。采用GC-MS測(cè)定乙酰化產(chǎn)物樣品；色譜柱為RXI-5 SIL MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為He，流速為1 mL/min；程序升溫條件為：起始溫度120 ℃，以3 ℃/min升溫至 250 ℃/min，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃。

1.6 核磁共振（NMR）分析

采用重水（99.9% D）溶解ACP樣品，并配置成

110 mg/mL，使用NMR進(jìn)行掃描樣品，獲得ACP的一維、二維NMR光譜，以氘代丙酮（δH 2.225，δC 31.45）作為內(nèi)標(biāo)。數(shù)據(jù)處理采用MestRenova V6.1.0-6224軟件對(duì)C/H信號(hào)進(jìn)行歸屬。

1.7 體外免疫活性評(píng)價(jià)

1.7.1 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW 264.7小鼠巨噬細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫(kù)，采用DMEM高糖培養(yǎng)基添加10%牛血清和1%青霉素/鏈霉素進(jìn)行培養(yǎng)，并置于含5% CO2的37 ℃環(huán)境下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行孵育。

1.7.2 細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)

采用MTT對(duì)ACP的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。首先，將RAW 264.7細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜使貼壁。接著，棄去舊培養(yǎng)基，將用培養(yǎng)基配置好的ACP溶液（0～800 μg/mL）加入細(xì)胞內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。待培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）培養(yǎng)4 h。隨后，棄掉溶液，每孔各加100 μL DMSO溶液，進(jìn)行避光混勻15 min。采用酶標(biāo)儀在570 nm處測(cè)定細(xì)胞的吸光度值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞活力。

細(xì)胞活力=A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組×100%

1.7.3 中性紅吞噬

采用中性紅吞噬實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證樣品對(duì)巨噬細(xì)胞的吞噬能力影響。將RAW 264.7細(xì)胞接種到96孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜使貼壁。接著，棄掉舊培養(yǎng)基，將不同濃度ACP樣品（0～800 μg/mL）加入RAW 264.7細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。待24 h后，收集舊培養(yǎng)基待用，細(xì)胞加入100 μL的中性紅溶液（1 mg/mL）孵育1 h，隨后加入細(xì)胞裂解液（乙醇：乙酸=1：1）進(jìn)行裂解。采用酶標(biāo)儀在540 nm處測(cè)定裂解后細(xì)胞殘?jiān)奈舛戎礎(chǔ)，計(jì)算吞噬指數(shù)。

吞噬指數(shù)= A實(shí)驗(yàn)組/A空白對(duì)照組×100%

1.7.4 一氧化氮（NO）含量測(cè)定

將上述實(shí)驗(yàn)收集得到的上清液與100 μL Griess試劑混合，室溫孵育10 min，以NaNO2為標(biāo)準(zhǔn)品配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用酶標(biāo)儀在492 nm處測(cè)定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。將測(cè)得的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，計(jì)算NO濃度。

1.7.5 qRT-PCR檢測(cè)

設(shè)置空白組、脂多糖（LPS，0.5 μg/mL）陽(yáng)性對(duì)照組、ACP低劑量組（25 μg/mL）和ACP高劑量組（100 μg/mL），處理24 h后收集4組培養(yǎng)后的細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)用TRIzol （Invitrogen）提取總RNA，采用qRT-PCR分析各組細(xì)胞因子iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α的基因表達(dá)?？鄢尘埃?jì)算ACP及LPS的相對(duì)表達(dá)量。基因序列見(jiàn)表2所示。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均為3次重復(fù)，生物學(xué)活性的結(jié)果以（x±s）表示，并使用Graphpad Prism軟件進(jìn)行分析。當(dāng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果中包含2個(gè)以上組時(shí)，進(jìn)行單向方差分析（ANOVA），然后進(jìn)行Dunnett-t多重比較檢驗(yàn)。Plt; 0.05定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ACP的分離純化

經(jīng)DE-52纖維素柱層析后的各組分使用硫酸苯酚法進(jìn)行糖顯色反應(yīng)，并在490 nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)，繪制呈曲線(xiàn)如圖2A所示。從左到右依次對(duì)應(yīng)峰進(jìn)行收集，得到水洗脫組分、0.2 mol/L NaCl洗脫組分、0.5 mol/L NaCl洗脫組分和1.0 mol/L NaCl洗脫組分，得率分別為3.77%，2.90%，2.83%和1.41%。將其中得率相對(duì)較高的水洗脫組分進(jìn)一步經(jīng)多糖凝膠純化系統(tǒng)進(jìn)行純化，示差檢測(cè)器在線(xiàn)檢測(cè)如圖2B所示，收集對(duì)稱(chēng)峰部位，進(jìn)行凍干。

2.2 純度及分子量分布

如圖2C所示，ACP為表現(xiàn)出了單一對(duì)稱(chēng)峰的特征，說(shuō)明經(jīng)過(guò)該分離、純化過(guò)程，所制備的ACP為均一多糖。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)帶入峰的保留時(shí)間，可得ACP的重均分子量（Mw）為11367 Da，數(shù)均分子量（Mn）為8507 Da，峰位分子量（Mp）為9970 Da。

2.3 單糖組成分析

如圖3所示， 單糖標(biāo)準(zhǔn)品在離子色譜中能夠很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)，ACP樣品在色譜圖的16.6 min出現(xiàn)1個(gè)強(qiáng)度較高的色譜峰，峰面積為71.3。并與標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖相同保留時(shí)間峰進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)其為葡萄糖（Glc）成分，說(shuō)明ACP樣品中主要含有的單糖是葡萄糖，即該ACP多糖可能為葡聚糖型結(jié)構(gòu)。

2.4 糖苷鍵類(lèi)型分析

通過(guò)甲基化分析確定了ACP樣品中的糖苷鍵殘基的類(lèi)型和比例。如圖4所示，ACP的GC-MS譜圖中，分別在17.04、21.59和26.75 min等3處有明顯的色譜峰，對(duì)應(yīng)各色譜峰提取質(zhì)譜碎片，可見(jiàn)在17.04 min處的例子碎片主要含有m/z 43、71、87、101、117、129、145、161和205，對(duì)應(yīng)為2，3，4，6-Me4-Glcp的裂解特征峰；而21.59 min處色譜峰對(duì)應(yīng)的特征質(zhì)譜碎片m/z 101、113、129、161、173和233，主要為2，3，6-Me3-Glcp的裂解特征峰；而26.75 min處對(duì)應(yīng)的主要質(zhì)譜碎片為85、99、117、127、159、161和201，對(duì)應(yīng)為2，3-Me2-Glcp的裂解特征峰。由此，可以推測(cè)出ACP中主要糖苷鍵類(lèi)型為Glcp-（1→、→4）-Glcp-（1→、→4，6）-Glcp-（1→，摩爾比為0.118 ： 0.642 ： 0.050。

2.5 NMR核磁圖譜分析

對(duì)樣品進(jìn)行NMR掃描，氫譜的異頭區(qū)在4.6～5.3 ppm內(nèi)有5個(gè)信號(hào)峰，在碳譜中同樣出現(xiàn)5個(gè)異頭碳；另外，DEPT135圖譜中出現(xiàn)5個(gè)倒峰，歸屬為亞甲基的信號(hào)，即C6的信號(hào)峰。進(jìn)一步通過(guò)二維圖譜的HSQC圖譜（圖5A）對(duì)同核碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行歸屬，根據(jù)1H-1H COSY對(duì)相鄰氫信號(hào)進(jìn)行歸屬（圖5B）。具體而言，糖苷鍵α-D-Glcp-1→（指定為A）的異頭區(qū)H/C信號(hào)為5.26/101.33 ppm，在1H-1HCOSY中對(duì)應(yīng)H1-H2信號(hào)為δ 5.26/3.6，進(jìn)一步根據(jù)HSQC得出C2的化學(xué)位移為δ71.94，同理可得到H2-H3、H3-H4、H4-H5、H5-H6的化學(xué)位移，對(duì)應(yīng)的C3-C6的化學(xué)位移依次可得出，分別為δ74.03、70.61、71.68和62.65。糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→（指定為B）的異頭區(qū)H/C信號(hào)為5.31/100.89 ppm，在1H-1HCOSY中對(duì)應(yīng)H1-H2、H2-H3、H3-H4、H4-H5的化學(xué)位移分別為δH 5.31/3.55、3.55/3.90、3.90/3.58、3.58/3.78。在HSQC中，根據(jù)歸屬得到的H的化學(xué)位移，可以歸屬出C2-C5的化學(xué)位移。同理，對(duì)→4，6）-α-D-Glcp-（1→（指定為C）、→4）-β-D-Glcp（指定為D）和→4）-α-D-Glcp（指定為E）進(jìn)行了化學(xué)位移的歸屬，見(jiàn)表3。

從1H-13C HMBC圖譜及NOESY對(duì)糖苷鍵之間的連接方式進(jìn)行分析。如圖5C～D所示，糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→（B）的異頭氫（5.31 ppm）與其自身的C4（78.31 ppm）有相關(guān)信號(hào)峰；另外異頭碳（100.89 ppm）與其自身的H4（3.58 ppm）有相關(guān)信號(hào)峰；表明存在→4）-α-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-（1→的鏈接方式。此外，→4）-α-D-Glcp-（1→（B）的異頭氫（5.31 ppm）與糖苷鍵→4，6）-α-D-Glcp-（1→（C）的C4（77.1 ppm）有相關(guān)峰，表明存在糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→4，6）-α-D-Glcp-（1→。在NOESY圖譜中，→4）-α-D-Glcp-（1→（B）的異頭氫（5.31 ppm）與→4，6）-α-D-Glcp-（1→（C）的H4（3.36 ppm）有相關(guān)峰，表明存在糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→4，6）-α-D-Glcp-（1→。且α-D-Glcp-（1→（A）的異頭氫（5.26 ppm）與→4，6）-α-D-Glcp-（1→（C）的H6（3.78， 3.89 ppm）有相關(guān)峰，表明存在糖苷鍵α-D-Glcp-（1→4，6）-α-D-Glcp-（1→。由此可以推斷，ACP樣品的一級(jí)化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖5E所示。

2.6 ACP的免疫調(diào)節(jié)作用

首先通過(guò)MTT法對(duì)ACP的細(xì)胞活性影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，如圖6A所示，ACP濃度在0～200 μg/mL下，RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞活力呈穩(wěn)定趨勢(shì)，為80%左右。當(dāng)達(dá)到400和800 μg/mL時(shí)細(xì)胞活力明顯下降。而ACP對(duì)細(xì)胞吞噬中性紅的活力并沒(méi)有明顯提高。但與空白對(duì)照組相比，ACP能夠顯著性促進(jìn)NO的釋放。

進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR對(duì)iNOS及細(xì)胞因子的基因表達(dá)情況進(jìn)行分析，如圖7所示，與空白對(duì)照組相比，ACP呈濃度依賴(lài)性升高RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、iNOS及TNF-α的基因表達(dá)水平，且高濃度ACP處理組與LPS（0.5 μg/mL）陽(yáng)性對(duì)照組效果幾乎持平。

3 討論

最近，有研究者對(duì)附子多糖的結(jié)構(gòu)、構(gòu)效關(guān)系及生物活性進(jìn)行了綜述[14]，發(fā)現(xiàn)對(duì)附子多糖的結(jié)構(gòu)表征，主要集中在分子量、單糖組成及糖苷鍵類(lèi)型方面，僅有少量研究解析了附子多糖的一級(jí)精細(xì)結(jié)構(gòu)。對(duì)烏頭（母根）和附子（子根）中提取的水溶性多糖進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其分別主要由淀粉型和非淀粉型α-D-葡聚糖組成。非淀粉型多糖組分具有良好的抗腫瘤活性和顯著的非特異性的免疫刺激活性。另外，非淀粉型多糖組分還能恢復(fù)抗腫瘤藥物抑制的免疫功能[15]。本研究中，通過(guò)一系列的分離純化，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，最終明確了所獲得ACP的精細(xì)結(jié)構(gòu)為α-1，4-葡聚糖結(jié)構(gòu)。因此，推測(cè)ACP可能為潛在的免疫刺激調(diào)節(jié)劑。

巨噬細(xì)胞在先天免疫防御系統(tǒng)對(duì)抗感染過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。巨噬細(xì)胞通過(guò)吞噬作用和產(chǎn)生免疫介質(zhì)如NO和細(xì)胞因子等，引起免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)而抵抗入侵者。其中，NO是一種具有多種生理和病理功能的親脂性自由基。它是由一種稱(chēng)為一氧化氮合酶（NOS）的酶家族氧化L-精氨酸產(chǎn)生的[17]。已知的NOS有3種不同亞型，其中由免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）表達(dá)的誘導(dǎo)異構(gòu)體（iNOS），在免疫原性和炎癥刺激下釋放高產(chǎn)量的NO，介導(dǎo)抗菌和抗腫瘤活性[18]。本研究中，進(jìn)一步選擇巨噬細(xì)胞進(jìn)行活性評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，通過(guò)ACP處理后，RAW 264.7細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO，且具有濃度依賴(lài)性。PCR分析發(fā)現(xiàn)低濃度和高濃度的ACP糖均具有顯著提高iNOS基因表達(dá)的作用，且高濃度（100 μg/mL）的效果明顯。由此說(shuō)明，ACP具有一定的促進(jìn)NO釋放的活性。

另外，細(xì)胞因子在體內(nèi)的免疫和局部或全身炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其中TNF-α是炎癥反應(yīng)中出現(xiàn)最早的促炎細(xì)胞因子，可以促使IL-6等其他炎性細(xì)胞因子的合成和分泌。IL-6是腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌的可溶性介質(zhì)，可誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖分化參與機(jī)體的免疫應(yīng)答，促進(jìn)慢性炎癥和腫瘤細(xì)胞免疫抑制的過(guò)程[19]。IL-1β則通過(guò)喚醒機(jī)體免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)各種免疫反應(yīng)的發(fā)生，促進(jìn)其他炎癥因子表達(dá)。本研究中，與空白對(duì)照組相比，ACP處理的RAW 264.7細(xì)胞具有明顯誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6基因表達(dá)升高的特點(diǎn)，且具有濃度依賴(lài)性，說(shuō)明ACP可能通過(guò)刺激RAW 264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，而提高免疫活性。

4 結(jié)論

從附子中經(jīng)水提醇沉得到附子粗多糖，經(jīng)分離純化后得到分子量11.37 kDa且主要含有葡萄糖的均一多糖ACP。該均一多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)為→4）-Glcp-（1→糖苷鍵為主鏈，Glcp-（1→為支鏈的葡聚糖結(jié)構(gòu)。ACP在0～200 μg/mL濃度范圍內(nèi)，對(duì)RAW 264.7細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性，在25～800 μg/mL濃度范圍內(nèi)，均能夠顯著性刺激RAW 264.7細(xì)胞釋放NO。進(jìn)一步，經(jīng)ACP低濃度（25 μg/mL）和高濃度（100 μg/mL）處理后的RAW 264.7細(xì)胞，與空白對(duì)照組相比，均能夠提高細(xì)胞因子iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表達(dá)。由此說(shuō)明，ACP多糖能夠刺激RAW 264.7細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌進(jìn)而發(fā)揮增強(qiáng)免疫的活性，詳細(xì)的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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