李浩宇，賈利，宋婷婷，汪勝，張于，方凌，張其安，嚴(yán)從生，隋益虎，江海坤*

〔1 安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100；2 安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制及生理生態(tài)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物種質(zhì)創(chuàng)制與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（部省共建），安徽合肥 230031〕

辣椒（CapsicumannuumL.）為茄科一年生或有限多年生草本植物，原產(chǎn)于中南美洲熱帶地區(qū)，在亞洲、歐洲等地廣泛栽培。辣椒含有豐富的VC、β-胡蘿卜素、葉酸等成分，含有的辣椒素還具有抗炎抗氧化作用，深受廣大消費(fèi)者喜愛（朱麗等，2023）。

目前，辣椒組織培養(yǎng)已經(jīng)通過子葉（楊博智等，2022）、上胚軸（鐘源源 等，2019）、下胚軸（Won et al.，2021）、帶柄子葉（徐建中 等，2015）、 莖尖、 花藥（ 張?zhí)煜?等，2020）、Flamingo-bill（高玉堯 等，2014）等組織獲得再生植株。Kim 和Lim（2019）從辣椒CM334 和甜椒Dempsey 的子葉上成功誘導(dǎo)出白色和淡黃色的愈傷組織，并且能夠增殖，建立了葉源性愈傷組織形成的條件，最終應(yīng)用基因組編輯工具來提高辣椒的品質(zhì)。O?uz 等（2021）第一次報(bào)道了使用根外節(jié)為外植體，在3 種茄科作物（辣椒、番茄、茄子）上比較了3 種細(xì)胞分裂素〔BAP、TDZ（苯基噻二唑基脲）、GA3（赤霉素）〕對(duì)芽再生能力的影響。Won 等（2021）選取辣椒幼苗第一片葉、子葉和下胚軸3 種外植體，用含8 mol · L-16-BA（6-芐基腺嘌呤）和6 mol · L-1IAA（吲哚乙酸）的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（SIM）誘導(dǎo)外植體產(chǎn)生芽，誘導(dǎo)率分別為69.8%、25.5%和19.5%。

目前在國(guó)內(nèi)外辣椒組織培養(yǎng)成功的報(bào)道中，普遍存在不定芽伸長(zhǎng)困難、分化率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)等問題，限制了辣椒基因工程的發(fā)展。本試驗(yàn)采用子葉、Flamingo-bill 和下胚軸為外植體，對(duì)影響辣椒離體再生的多個(gè)因素進(jìn)行探討，旨在建立辣椒高效離體再生體系，為進(jìn)一步開展辣椒遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試5 種基因型不同的辣椒材料均由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供，代號(hào)分別為綠皮羊角椒9931、綠皮燈籠椒WJ-10、綠皮朝天椒22-33、紫皮燈籠椒H18 和紫皮朝天椒M13。試驗(yàn)于2022 年在安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得 選取顆粒飽滿、色澤鮮艷的種子，先用溫水浸泡6～8 h，75%酒精消毒1 min，無菌水清洗3 次，再用2.5% NaClO 消毒30 min，無菌水清洗8～10 次后，用無菌濾紙吸干種子表面水分，接種于MS 固體培養(yǎng)基（4.74 g · L-1MS 粉 + 30 g · L-1蔗糖 + 8 g · L-1瓊脂）中。溫度27～28 ℃，暗培養(yǎng)至種子露白，再置于光照下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度1 600～1 800 lx，溫度24～26 ℃，培養(yǎng)無菌苗。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo)和分化 選取不同苗齡的無菌苗，制備Flamingo-bill 外植體：將無菌苗的一側(cè)子葉從葉柄基部連同頂芽及周圍分生組織全部切去，留下另一側(cè)子葉與下胚軸、胚根作為一個(gè)外植體。Flamingo-bill 切下來的一片子葉用于制備子葉外植體（0.5 cm × 0.5 cm），將Flamingo-bill 外植體、子葉外植體和下胚軸（切去胚根和上部，切成1 cm的小段）接種于MS 添加不同激素（6-BA 為1、3、5、6 mol · L-1，IAA 為0.3、0.5、1.0 mol · L-1）配比的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每個(gè)處理30 個(gè)外植體，3次重復(fù)，每2 周繼代1 次，培養(yǎng)條件同1.2.1，30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽分化率。

不定芽分化率 = （分化外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）× 100%

1.2.3 不定芽伸長(zhǎng) 將分化出不定芽的外植體接種至MS 添加不同激素（6-BA 為1、2、3 mol · L-1，IAA 為2 mol · L-1，GA3為0、0.5、1.0、1.5 mol · L-1）配比的伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，每2 周繼代1 次，培養(yǎng)條件同1.2.1，30 d 后統(tǒng)計(jì)伸長(zhǎng)率。

伸長(zhǎng)率 = （伸長(zhǎng)不定芽數(shù)/接種發(fā)生分化外植體數(shù)）× 100%

1.2.4 不定芽生根 將伸長(zhǎng)的不定芽從母體基部切除，接種于MS 添加不同濃度NAA（0、0.1、0.3、0.5 mol · L-1）的生根培養(yǎng)基上，20 d 后觀察不定芽生根情況，統(tǒng)計(jì)生根率。

生根率 = （生根不定芽數(shù)/接種不定芽數(shù)）× 100%

當(dāng)再生苗長(zhǎng)至10～15 cm 時(shí)即可煉苗移栽。先在組培室內(nèi)開瓶煉苗2 d，再放至室外煉苗2 d，之后沖洗干凈根部的培養(yǎng)基，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，待緩苗過后移栽至溫室管理直至開花結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 軟件統(tǒng)計(jì)和處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 苗齡對(duì)辣椒不定芽分化的影響

不同基因型不同苗齡的Flamingo-bill 外植體的不定芽分化有著較大差異。由圖1 可知，隨著苗齡的增加，不定芽分化率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，苗齡10 d 時(shí)，F(xiàn)lamingo-bill 外植體分化率最高，達(dá)81.4%～91.1%；苗齡14 d 時(shí)，不定芽分化率最低為61.5%，最高為69.4%；苗齡大于14 d，不定芽分化率大幅下降；苗齡16 d 時(shí)，不定芽分化率最低僅為48.8%，且多數(shù)只形成愈傷組織。由此得出，制備Flamingo-bill 外植體最適苗齡為10 d。

圖1 苗齡對(duì)辣椒不定芽分化的影響

2.2 不同外植體和激素配比對(duì)辣椒不定芽分化率的影響

將5 種基因型辣椒的Flamingo-bill 和子葉外植體接種到添加不同濃度6-BA 和IAA 組合的MS 分化培養(yǎng)基上（表1），培養(yǎng)1 周左右，在其切口處開始形成愈傷組織，2 周左右開始形成白色松軟（圖2-a）、綠色緊實(shí)（圖2-b）或紫色緊實(shí)（圖2-c）的愈傷組織，4 周左右分化形成不定芽。

圖2 子葉再生過程中不同愈傷組織

從表1 還可以看出，在6-BA 濃度為1～6 mol ·L-1、IAA 為0.3～1.0 mol · L-1范圍內(nèi)，5 種基因型辣椒外植體的不定芽分化率均隨著激素濃度的升高而升高，其中以綠皮羊角椒9931 在6-BA、IAA 濃度分別為6.0 mol · L-1和1.0 mol · L-1時(shí)最高（圖3、4），F(xiàn)lamingo-bill 和子葉的不定芽分化率分別達(dá)到100.0%和86.7%。

圖3 9931 的Flamingo-bill 離體再生情況

圖4 9931 的子葉離體再生情況

同時(shí)，不同基因型辣椒不定芽分化率也有較大差異，綠皮辣椒9931、WJ-10、22-33 的Flamingobill 和子葉不定芽分化率最高分別為100.0%、90.0%、96.7% 和86.7%、73.3%、80.0%，紫皮辣椒H18 和M13 Flamingo-bill 不定芽分化率最高均為100.0%，但子葉外植體均沒有不定芽分化，只形成紫色緊實(shí)的愈傷組織（圖2），后續(xù)采用ZT（玉米素）和IAA 激素組合也沒有誘導(dǎo)出不定芽。5 種基因型的辣椒下胚軸均沒有誘導(dǎo)出不定芽，且下胚軸容易誘導(dǎo)形成不定根。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)子葉和下胚軸外植體容易發(fā)生褐化，但Flamingo-bill 外植體未出現(xiàn)該現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加了5.0 mol · L-1的AgNO3后，褐化現(xiàn)象得到明顯改善。綜合試驗(yàn)結(jié)果，選用9931 進(jìn)行下一步不定芽伸長(zhǎng)和生根工作。

2.3 不同激素配比對(duì)辣椒不定芽伸長(zhǎng)的影響

由子葉外植體誘導(dǎo)分化出的不定芽呈叢生狀，多數(shù)為葉狀體，不定芽較難分辨，因此將叢生芽連同愈傷組織一同移至伸長(zhǎng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)伸長(zhǎng)。結(jié)果表明（表2），F(xiàn)lamingo-bill 外植體不定芽伸長(zhǎng)率隨著GA3濃度升高不斷增加，在不添加GA3的條件下仍達(dá)到22.2%。將子葉產(chǎn)生的不定芽轉(zhuǎn)至較低濃度6-BA 的培養(yǎng)基上，伸長(zhǎng)率為僅4.4%；在添加GA3的培養(yǎng)基上，配合6-BA和IAA能有效伸長(zhǎng)不定芽，GA3濃度為1.5 mol · L-1時(shí)，與3.0 mol · L-1的6-BA和2.0 mol · L-1的IAA 配合使用，不定芽伸長(zhǎng)效果最好，子葉和Flamingo-bill 不定芽伸長(zhǎng)率分別達(dá)到30.0%和66.7%。由此得出辣椒9931 不定芽最優(yōu)伸長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為：MS + 3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol ·L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3+ 5.0 mol · L-1AgNO3。

表2 不同激素配比對(duì)辣椒不定芽伸長(zhǎng)的影響

2.4 不同NAA 濃度對(duì)辣椒不定芽生根的影響

試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)9931 的Flamingo-bill 外植體生根較容易，在不添加任何激素的MS 培養(yǎng)基上，20 d 就可生根，生根率為100.0%。由子葉外植體形成的不定芽，在低濃度NAA 培養(yǎng)基下，根系生長(zhǎng)緩慢，不定根瘦弱短細(xì)，多數(shù)為雞爪根（圖5-a、b），且移栽較難成活，NAA 濃度為0.3～0.5 mol · L-1時(shí)，不定根生長(zhǎng)正常，主根粗壯，須根較多（圖5-c、d），移栽成活率為100.0%（表3）。由此得出最適子葉生根培養(yǎng)基配方為：MS + 0.5 mol · L-1NAA。

表3 不同濃度NAA 對(duì)辣椒不定芽生根的影響

圖5 添加不同濃度NAA 對(duì)不定芽生根的影響

3 討論

3.1 苗齡對(duì)辣椒不定芽分化的影響

在外植體制備時(shí)，不同苗齡階段所獲取的外植體具有不同的分化能力。以子葉為外植體時(shí)，生長(zhǎng)周期過短，兩片子葉尚未平展，切取時(shí)不易操作；培養(yǎng)周期過長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)消耗大量養(yǎng)分，同時(shí)會(huì)降低不定芽的分化能力。以Flamingo-bill 為外植體時(shí)，生長(zhǎng)周期過短，莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)還未發(fā)育完全，制備時(shí)無法完全切除，從而導(dǎo)致后期遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)出現(xiàn)假陽(yáng)性植株；培養(yǎng)周期過長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)消耗大量養(yǎng)分，長(zhǎng)勢(shì)太快，不易操作且不定芽分化率也大大降低。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同基因型的辣椒無菌苗生長(zhǎng)也有較大差異，這可能與不同品種的發(fā)育快慢有關(guān)（蔡文，2018）。李偉等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，不同苗齡的朝天椒子葉外植體，其芽分化率差別較大，隨著子葉外植體苗齡的增大，不定芽分化率呈先增大后減小的趨勢(shì)。子葉誘導(dǎo)、分化能力以苗齡14 d 時(shí)最強(qiáng)，且能不經(jīng)愈傷而直接誘導(dǎo)形成不定芽。本試驗(yàn)采用苗齡10 d 的幼苗制備外植體時(shí)，不定芽分化率較高，再生效果較好。

3.2 不同激素配比對(duì)辣椒不定芽分化的影響

影響辣椒離體再生的因素有多個(gè)方面，首先，不定芽的誘導(dǎo)和分化起著關(guān)鍵作用；其次，不定芽的伸長(zhǎng)是離體再生過程中的重難點(diǎn)。多數(shù)研究認(rèn)為6-BA、IAA 等激素對(duì)芽分化有誘導(dǎo)作用。高藝等（2021）用5.0～9.0 mol · L-16-BA + 0.05 mol · L-1IAA 誘導(dǎo)分化，子葉的分化率高達(dá)100%，用5.0～9.0 mol · L-16-BA 與3.0～9.0 mol · L-1ZT 配比組合，離體子葉再生形成的葉狀體大部分呈玫瑰花瓣?duì)?，少部分呈正常長(zhǎng)條形，且生長(zhǎng)速度較快。鐘源源等（2019）發(fā)現(xiàn)NAA 與6-BA 相配合可協(xié)同促進(jìn)不定芽分化，通過優(yōu)化試驗(yàn)得到高辣度辣椒不定芽分化最優(yōu)的培養(yǎng)基組合為MS + 2.5 mol · L-16-BA + 0.05 mol · L-1NAA + 5 mol · L-1AgNO3，平均誘導(dǎo)率達(dá)93.3%。張根蓮等（2019）以子葉和下胚軸為外植體，在添加1.0 mol · L-1IAA + 5.0 mol ·L-16-BA 的基礎(chǔ)上再添加2.0 mol · L-1ZT，可加快誘導(dǎo)外植體的分化，但形成的葉狀體呈簇狀生長(zhǎng)，后期導(dǎo)致不定芽伸長(zhǎng)困難，由此說明ZT 對(duì)不定芽分化無明顯促進(jìn)作用。覃芳（2016）認(rèn)為最適合誘導(dǎo)芽的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合是3 mol · L-16-BA + 0.8 mol · L-1NAA。由此可見，較高濃度的6-BA（3～6 mol · L-1）在辣椒不定芽誘導(dǎo)分化過程中起著重要作用。本試驗(yàn)采用6.0 mol · L-16-BA + 1.0 mol · L-1IAA 誘導(dǎo)再生芽分化，可得到80%以上的分化率。此外，蔡文（2018）以辣椒59 號(hào)的子葉、帶柄子葉、下胚軸和Flamingo-bill 為外植體，發(fā)現(xiàn)Flamingobill 外植體不定芽分化率最高（85%），子葉和帶柄子葉容易形成簇狀芽，下胚軸容易出現(xiàn)生根現(xiàn)象，后期莖伸長(zhǎng)培養(yǎng)困難，這與本試驗(yàn)過程中遇到的問題相似。

3.3 不同外植體對(duì)辣椒不定芽誘導(dǎo)率的影響

近年來辣椒離體再生所用的外植體大致為子葉、帶柄子葉、上胚軸、下胚軸、莖尖、真葉和Flamingo-bill，不同外植體的不定芽誘導(dǎo)率差異較大。王佳偉（2022）以觀賞辣椒子葉、帶柄子葉、下胚軸為外植體，篩選出最佳外植體類型為帶柄子葉，愈傷組織誘導(dǎo)能力強(qiáng)弱依次為帶柄子葉 ＞ 子葉 ＞ 下胚軸?？佃ぃ?013）研究發(fā)現(xiàn)3 種外植體的分化能力從強(qiáng)到弱依次為Flamingo-bill ＞ 下胚軸 ＞ 帶柄子葉。羅紅萍（2010）和蔡文（2018）認(rèn)為分化能力從強(qiáng)到弱依次為Flamingo-bill ＞ 帶柄子葉 ＞ 子葉。曹艷玲（2009）和徐建中等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，不同外植體芽分化率呈現(xiàn)帶柄子葉 ＞子葉塊 ＞ 下胚軸。本試驗(yàn)中，不定芽分化率呈現(xiàn)Flamingo-bill ＞ 子葉 ＞ 下胚軸，由于Flamingobill 保留了一片子葉和胚根，極大程度減少了外植體的損傷，同時(shí)能夠產(chǎn)生大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)激素，能夠保證不定芽的形成，而子葉外植體容易形成簇狀芽，較難伸長(zhǎng)，下胚軸容易出現(xiàn)生根現(xiàn)象，因此外植體的選擇對(duì)不定芽誘導(dǎo)有至關(guān)重要的影響。

3.4 不同激素配比對(duì)辣椒不定芽伸長(zhǎng)的影響

不定芽伸長(zhǎng)是離體再生的關(guān)鍵，但多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)辣椒不定芽伸長(zhǎng)尤為困難。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為在伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入GA3可以促進(jìn)不定芽伸長(zhǎng)，同時(shí)通過降低6-BA 濃度、增加IAA 濃度對(duì)不定芽伸長(zhǎng)效果也有一定影響。Gammoudi 等（2018）研究發(fā)現(xiàn)用GA3處理辣椒8 號(hào)，子葉誘導(dǎo)率為33.5%，下胚軸誘導(dǎo)率為62.6%。徐建中等（2015）和臧順（2014）認(rèn)為在MS 培養(yǎng)基中添加2.0 mol · L-1GA3促進(jìn)芽伸長(zhǎng)的效果最好，當(dāng)GA3水平達(dá)到4.0 mol ·L-1時(shí)，不定芽伸長(zhǎng)率反而降低，伸長(zhǎng)的不定芽細(xì)長(zhǎng)瘦弱，不易生長(zhǎng)為正常植株，可能是GA3在體內(nèi)累積過多引起的。本試驗(yàn)中，在含有6-BA、IAA 和GA3組合中，不定芽伸長(zhǎng)率隨著6-BA、GA3濃度升高而增加，在3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol · L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3時(shí)，不定芽伸長(zhǎng)率最高。同時(shí)，不同外植體的不定芽伸長(zhǎng)效果有明顯差異，F(xiàn)lamingo-bill 外植體不定芽伸長(zhǎng)率最高達(dá)到66.7%，明顯大于子葉外植體不定芽伸長(zhǎng)率，這可能是由于Flamingo-bill 外植體留下的子葉與胚根能產(chǎn)生大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)激素，而頂端分生組織也會(huì)產(chǎn)生大量的調(diào)節(jié)激素，從而有利于愈傷組織分化和促進(jìn)不定芽形成（高玉堯 等，2014）。

3.5 不同激素配比對(duì)辣椒不定芽生根的影響

辣椒不定芽生根相對(duì)容易，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lamingo-bill 外植體在不添加任何激素的MS 培養(yǎng)基中，不定芽能正常生根。子葉外植體形成的不定芽在添加少量的NAA 或者搭配IAA 使用的MS 培養(yǎng)基中能得到較好的生根效果。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了綠皮羊角椒9931 Flamingo-bill和子葉外植體的高效離體再生體系，其不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS + 6.0 mol · L-16-BA + 1.0 mol ·L-1IAA + 5.0 mol · L-1AgNO3，F(xiàn)lamingo-bill 和子葉誘導(dǎo)率分別為100.0%和86.7%；不定芽伸長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為MS + 3.0 mol · L-16-BA + 2.0 mol ·L-1IAA + 1.5 mol · L-1GA3+ 5.0 mol · L-1AgNO3，F(xiàn)lamingo-bill 和子葉不定芽伸長(zhǎng)率分別為66.7%和30.0%；不定芽生根的最適培養(yǎng)基為MS + 0.5 mol ·L-1NAA，生根率均為100.0%。