高 梅，湯連升，鄭智勇，馬 會(huì)，秦春雪，曹 沖

(山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101)

細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames 試驗(yàn))作為一項(xiàng)體外遺傳毒性試驗(yàn)，是食品、醫(yī)療器械、化妝品、化學(xué)品、農(nóng)藥和藥物等研發(fā)常規(guī)開(kāi)展的毒理學(xué)試驗(yàn)項(xiàng)目，目的是檢測(cè)受試物能否引起細(xì)菌堿基置換或移碼突變，從而評(píng)價(jià)其是否具有致突變性。

在Ames 試驗(yàn)相關(guān)的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)規(guī)范和指導(dǎo)原則中[1-8]，均規(guī)定了應(yīng)采用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株組合作為試驗(yàn)菌株，組合方式一是鼠傷寒沙門氏菌菌株間進(jìn)行組合，二是鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌進(jìn)行組合。實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行Ames試驗(yàn)時(shí)，多采用第一種組合，如TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 組 合[9-11]，TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535 組合[12-14]，TA97、TA98、TA100、TA102 組 合[15-16]，TA97a、TA98、TA100、TA102 組 合[17-18]，TA97、TA98、TA100、TA102、TA1535、TA1537 組合[19]等。無(wú)論采用哪種組合，都需要對(duì)菌株特性進(jìn)行鑒定，鑒定合格后才能用于正式試驗(yàn)。GB 15193.4-2014、GBZ/T 240.8-2011、YY/T 0127.10-2009、YY/T 0870.1-2013、GB/T 15670.14-2017 和化妝品安全技術(shù)規(guī)范等標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范中，都規(guī)定需對(duì)菌株進(jìn)行組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷(rfa 突變)鑒定、氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定、四環(huán)素抗性(pAQ1質(zhì)粒)鑒定和uvrB修復(fù)缺陷型(紫外線敏感性)鑒定，但鑒定方法不盡相同，本文就這幾種菌株基因型鑒定的試驗(yàn)方法進(jìn)行比較分析，并對(duì)TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 等5 株試驗(yàn)菌株進(jìn)行了鑒定，以期為Ames試驗(yàn)菌株鑒定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，由Molecular Toxicology公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

牛肉膏、胰蛋白胨、瓊脂粉、結(jié)晶紫，均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；D-生物素、L-組氨酸、氨芐青霉素、四環(huán)素，均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

HFsafe-1500TE 型生物安全柜，購(gòu)自上海力申科學(xué)儀器有限公司；SPX-250B-Z 型生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHWY-100B 型恒溫培養(yǎng)振蕩器，購(gòu)自上海智城分析儀器制造有限公司；15 W 紫外線殺菌燈，購(gòu)自廣東雪萊特光電科技股份有限公司。

1.3 菌株組合

Ames試驗(yàn)相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)、規(guī)范和指導(dǎo)原則中，對(duì)試驗(yàn)菌株組合要求不盡相同，見(jiàn)表1。食品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 15193.4-2014、化學(xué)品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 21786-2008、《藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中要求使用TA98、TA100、TA1535、TA97a 或TA97 或TA1537、TA102 或大腸桿菌WP2 uvrA 或大腸桿菌WP2 uvrA(pKM101)5 株菌株組合；口腔醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0127.10-2009、《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中要求使用TA97、TA98、TA100和TA102 4株菌株組合；化學(xué)品國(guó)家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GBZ/T 240.8-2011、醫(yī)療器械行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0870.1-2013 和農(nóng)藥國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15670.14-2017則推薦使用4株菌株組合，需要時(shí)可增加菌株。

表1 Ames試驗(yàn)相關(guān)的國(guó)家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)規(guī)范、指導(dǎo)原則

1.4 組氨酸缺陷型鑒定

1.4.1 試驗(yàn)原理組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)需要組氨酸，其本身沒(méi)有合成組氨酸的能力，若培養(yǎng)基不含組氨酸，則菌株不能正常生長(zhǎng)，只能在補(bǔ)充組氨酸的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。

1.4.2 鑒定方法鑒定方法見(jiàn)表2?；痉椒ㄊ侵谱鲀煞N平板，一種同時(shí)含有L-組氨酸和D-生物素，另一種只含D-生物素。將菌株分別接種在兩種平板上，培養(yǎng)24 或48 h 觀察菌株是否生長(zhǎng)，但平板制作方法和培養(yǎng)時(shí)間有所不同。

表2 組氨酸缺陷型鑒定試驗(yàn)方法

在平板制作方面，食品、醫(yī)藥器械、化妝品、農(nóng)藥平板制作方法基本相同，在底層培養(yǎng)基中加入組氨酸和/或生物素溶液混合后倒平板，口腔醫(yī)療器械是將組氨酸和/或生物素溶液平鋪在底層培養(yǎng)基平板表面；在培養(yǎng)時(shí)間上，食品、醫(yī)療器械、農(nóng)藥要求在菌株接種后培養(yǎng)48 h觀察，口腔醫(yī)療器械、化妝品、化學(xué)品則要求培養(yǎng)24 h觀察。

參考食品試驗(yàn)方法對(duì)TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 菌株進(jìn)行鑒定。用移液器分別吸取0.1 mL菌液，使用涂布棒在含組氨酸和不含組氨酸的培養(yǎng)基平板上涂成一條帶，37 ℃培養(yǎng)48 h 觀察結(jié)果。同時(shí)，參考其他文件，也對(duì)菌株接種后培養(yǎng)24 h的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了觀察。

1.5 脂多糖屏障缺陷鑒定

1.5.1 試驗(yàn)原理具有脂多糖屏障缺陷(rfa 突變)的試驗(yàn)菌株，表面一層脂多糖屏障缺損，細(xì)胞壁屏障功能喪失，通透性增加，結(jié)晶紫等一些大分子物質(zhì)與其接觸后，能穿透菌膜進(jìn)入菌體，菌株的生長(zhǎng)被抑制。

1.5.2 鑒定方法鑒定方法見(jiàn)表3?；痉椒ㄊ菍⒕号c0.1%的結(jié)晶紫溶液接觸24 h，觀察結(jié)晶紫是否能抑制菌株生長(zhǎng)，但平板制作方法和結(jié)晶紫溶液與菌液接觸方法有所不同。

表3 脂多糖屏障缺陷鑒定試驗(yàn)方法

食品、醫(yī)療器械和農(nóng)藥試驗(yàn)方法相同，將0.1 mL菌液與營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基混合后制備平板，再放上濾紙片滴加結(jié)晶紫溶液；口腔醫(yī)療器械和化學(xué)品試驗(yàn)方法基本相同，將菌液加到頂層培養(yǎng)基試管混合后平鋪到營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面，再放上浸過(guò)結(jié)晶紫溶液的濾紙片或者放上濾紙片后再滴加結(jié)晶紫溶液；化妝品則是將菌液于營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面劃線，將浸過(guò)結(jié)晶紫溶液的濾紙條與劃線處交叉放置。

參考食品試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。用移液器吸取0.1 mL菌液，使用涂布棒在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面涂成一條帶，待其干后，將無(wú)菌濾紙片放入條帶中，并輕壓濾紙片，用移液器在濾紙片上滴加0.1%結(jié)晶紫溶液10 μL，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

1.6 氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定

1.6.1 試驗(yàn)原理試驗(yàn)菌株若含R因子則具有氨芐青霉素抗性，與氨芐青霉素接觸后能照常生長(zhǎng)，不含R因子則無(wú)氨芐青霉素抗性，生長(zhǎng)會(huì)被抑制。

1.6.2 鑒定方法鑒定方法見(jiàn)表4。基本方法是將菌液與氨芐霉素接觸，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察氨芐青霉素是否能夠抑制菌株生長(zhǎng)，但在平板制備、菌液使用量和菌液與氨芐青霉素接觸的方法有所不同。食品、醫(yī)療器械、農(nóng)藥和化學(xué)品試驗(yàn)方法相同，先將氨芐青霉素溶液在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，再交叉劃線菌液；化妝品是在氨芐青霉素平板上劃線接種0.1 mL菌液；口腔醫(yī)療器械則包括兩種平板方法，在使用營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板時(shí)，是將沾有氨芐青霉素溶液的濾紙條與菌液劃線處交叉放置。鑒定方法中只規(guī)定了氨芐青霉素的使用量，除化妝品技術(shù)規(guī)范外，都未規(guī)定劃線接種時(shí)菌液使用量。

表4 氨芐青霉素抗性鑒定試驗(yàn)方法

參考食品試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。用移液器吸取10 μL 0.8%的氨芐青霉素，用涂布棒在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面平板涂成一條帶，待其干后，將待測(cè)菌株0.1 mL 與條帶交叉處用涂布棒涂成一條帶，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

1.7 四環(huán)素抗性(pAQ1質(zhì)粒)鑒定

1.7.1 試驗(yàn)原理試驗(yàn)菌株若含pAQ1 質(zhì)粒則對(duì)四環(huán)素有抗性，與四環(huán)素接觸后能照常生長(zhǎng)，不含pAQ1質(zhì)粒則無(wú)四環(huán)素抗性，生長(zhǎng)會(huì)被抑制。

1.7.2 鑒定方法鑒定方法見(jiàn)表5?；痉椒ㄊ菍⒕号c四環(huán)素接觸，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察四環(huán)素是否能夠抑制菌株生長(zhǎng)，但平板制備、菌液使用量和菌液與四環(huán)素接觸方法有所不同。食品、醫(yī)療器械、農(nóng)藥試驗(yàn)方法相同，先將四環(huán)素溶液和氨芐青霉素溶液在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，再交叉劃線接種菌液；化學(xué)品也是使用營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板，僅四環(huán)素與菌株接觸無(wú)需使用氨芐青霉素；化妝品是在氨芐青霉素/四環(huán)素平板上劃線接種0.1 mL 菌液；口腔醫(yī)療器械則包括兩種平板方法，在使用營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板時(shí)，也不使用氨芐青霉素與菌株接觸。鑒定方法中只規(guī)定了氨芐青霉素、四環(huán)素的使用量，除化妝品技術(shù)規(guī)范外，均未規(guī)定劃線接種時(shí)的菌液使用量。

表5 四環(huán)素抗性鑒定試驗(yàn)方法

參考化學(xué)品和食品試驗(yàn)方法進(jìn)行鑒定。用移液器吸取10 μL 0.8%的四環(huán)素溶液，用涂布棒在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面涂成一條帶，待干后，將待測(cè)菌株0.1 mL 與條帶交叉處用涂布棒涂成一條帶，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

1.8 uvrB修復(fù)缺陷型(紫外線敏感性)鑒定

1.8.1 試驗(yàn)原理試驗(yàn)菌株若具有uvrB突變，切除修復(fù)功能有缺陷，被紫外線照射后不能生長(zhǎng)，具有野生型切除修復(fù)酶的菌株，具有損傷修復(fù)功能，被紫外線照射后照常生長(zhǎng)。

1.8.2 鑒定方法食品、醫(yī)療器械、口腔醫(yī)療器械、化妝品、化學(xué)品、農(nóng)藥試驗(yàn)方法一致，基本方法是在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板表面劃線接種菌液，然后用黑紙遮蓋住劃線的一半，紫外線照射后37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株能否生長(zhǎng)。鑒定方法中規(guī)定了紫外線照射的強(qiáng)度、距離和時(shí)間，除化妝品技術(shù)規(guī)范外，均未定劃線接種時(shí)菌液使用量。

用移液器吸取0.1 mL菌液，用涂布棒在營(yíng)養(yǎng)肉湯瓊脂培養(yǎng)基表面涂成一條帶，待其干后，用黑紙遮蓋涂布帶的一半，在距離平板33 cm 處用15 W 紫外線滅菌燈照射8 s，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 組氨酸缺陷型鑒定

鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1 和圖2。結(jié)果顯示，接種后培養(yǎng)48 h，TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 菌株在無(wú)組氨酸培養(yǎng)基平板上僅有自發(fā)回變菌落生長(zhǎng)，而在有組氨酸培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)出一條菌膜，表明5 株菌株生長(zhǎng)均需要組氨酸。

圖1 組氨酸缺陷型鑒定結(jié)果(不含組氨酸平板)

圖2 組氨酸缺陷型鑒定結(jié)果(含組氨酸平板)

此外，在組氨酸缺陷型鑒定中，不同文件中培養(yǎng)時(shí)間要求不同，對(duì)TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535 菌株接種后培養(yǎng)24 h，結(jié)果顯示菌株在未添加組氨酸的平板上未見(jiàn)自發(fā)回變菌落生長(zhǎng)，而在添加了組氨酸的平板上均生長(zhǎng)出菌膜。

2.2 脂多糖屏障缺陷(rfa突變)鑒定

鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 在濾紙片周圍均出現(xiàn)抑制環(huán)，說(shuō)明5株菌株均對(duì)結(jié)晶紫敏感，為rfa突變型菌株。

圖3 脂多糖屏障缺陷鑒定結(jié)果

2.3 氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定

鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示，TA97a、TA98、TA100、TA102 與氨芐青霉素接觸后生長(zhǎng)正常，說(shuō)明這4 株菌株均含有R 因子，生長(zhǎng)不被氨芐青霉素抑制；TA1535在氨芐青霉素帶附近生長(zhǎng)被抑制，表明該菌株不含R因子。

圖4 氨芐青霉素抗性鑒定結(jié)果

2.4 四環(huán)素抗性(pAQ1質(zhì)粒)鑒定

鑒定結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，TA102 菌株與四環(huán)素接觸后生長(zhǎng)正常，說(shuō)明該菌株含有pAQ1 質(zhì)粒，生長(zhǎng)不被四環(huán)素抑制；TA97a、TA98、TA100、TA1535在四環(huán)素條帶附近生長(zhǎng)均被抑制，表明這4 株菌株不含pAQ1質(zhì)粒。

圖5 四環(huán)素抗性鑒定結(jié)果

2.5 uvrB修復(fù)缺陷型(紫外線敏感性)鑒定

鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果顯示，TA97a、TA98、TA100、TA1535菌株經(jīng)紫外線輻射后不生長(zhǎng)，僅在未照射過(guò)的一半生長(zhǎng)，說(shuō)明這4 株菌株對(duì)紫外線敏感，有uvrB突變；TA102經(jīng)紫外線輻射后仍生長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株對(duì)紫外線不敏感，具有完整的切除修復(fù)系統(tǒng)。

圖6 uvrB修復(fù)缺陷型鑒定結(jié)果

3 討 論

Ames試驗(yàn)是采用原核細(xì)胞測(cè)試受試物能否致細(xì)菌基因突變的體外試驗(yàn)，預(yù)測(cè)其致突變性和潛在的致癌作用。試驗(yàn)菌株生長(zhǎng)需要組氨酸或色氨酸，若培養(yǎng)基不含組氨酸或色氨酸，則菌株不能正常生長(zhǎng)，菌株與有致突變作用的受試物作用后，回復(fù)突變?yōu)橐吧投哂泻铣山M氨酸或色氨酸的能力，從而回變菌落數(shù)增多，因此可以通過(guò)菌落數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)受試物是否有遺傳毒性。在使用5株菌株組合進(jìn)行Ames試驗(yàn)時(shí)，國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室較多的是組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA1535、TA97/TA97a、TA98、TA100 和TA102 組合[9-14]，較少使用色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌WP2 uvrA[20]，國(guó)外實(shí)驗(yàn)室使用此菌株頻率較高[21-23]。

Ames試驗(yàn)中用到的菌株為突變型菌株，其某些特性易丟失或變異，以下情況應(yīng)鑒定菌株的基因型：新購(gòu)入菌株后；制備冷凍保存菌株時(shí)；重新挑選菌株時(shí)；當(dāng)自發(fā)回變數(shù)不在正常范圍時(shí)；對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誘變劑喪失敏感性時(shí)；使用主平板傳代時(shí)；用長(zhǎng)期保存的菌株進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)[1，3-6]。GB 15193.4-2014、GBZ/T 240.8-2011、YY/T 0127.10-2009、YY/T 0870.1-2013、GB/T 15670.14-2017 和化妝品安全技術(shù)規(guī)范等文件中[1-6]，均規(guī)定需對(duì)菌株進(jìn)行組氨酸缺陷型鑒定、脂多糖屏障缺陷(rfa突變)鑒定、氨芐青霉素抗性(R因子)鑒定、四環(huán)素抗性(pAQ1 質(zhì)粒)鑒定和uvrB 修復(fù)缺陷型(紫外線敏感性)鑒定等基因型鑒定，并詳細(xì)地說(shuō)明了各種試劑的配制及鑒定的具體操作方法。藥物指導(dǎo)原則中[8]要求菌株特性鑒定需符合要求，未介紹具體的試驗(yàn)方法，ICH S2(R1)[24]和OECD TG471[25]中亦未規(guī)定相關(guān)鑒定方法。此外，氨芐青霉素抗性、四環(huán)素抗性鑒定和紫外線敏感性鑒定試驗(yàn)中，對(duì)接種時(shí)菌液的使用量規(guī)定也不盡相同，建議控制劃線接種的菌液量，均勻劃線或涂布，避免菌液分布不均勻?qū)е妈b定結(jié)果不準(zhǔn)確。較其他文件，食品安全標(biāo)準(zhǔn)GB 15193.4-2014 還要求進(jìn)行生物素缺陷型的鑒定。Maron 和Ames[26]建議紫外線敏感性鑒定中，不含R因子的菌株用紫外線照射6 s，而且用到的紫外線滅菌燈應(yīng)定期監(jiān)測(cè)紫外線輻射照度；另外，他們認(rèn)為不需要進(jìn)行生物素需求試驗(yàn)。雖然不同文件中鑒定方法不同，但是判定標(biāo)準(zhǔn)和鑒定結(jié)果相同[27]， TA97/TA97a、 TA98、 TA100、TA102 和TA1535 菌株生長(zhǎng)均需組氨酸，均具有rfa 突變，除TA1535 外均具有氨芐青霉素抗性，除TA102外均對(duì)紫外線敏感和均無(wú)四環(huán)素抗性(見(jiàn)表6)。

表6 試驗(yàn)菌株生物需特性鑒定結(jié)論

此外，除基因型鑒定外，還應(yīng)進(jìn)行自發(fā)回變、對(duì)誘變劑敏感性的生物特性鑒定[1-4]，各實(shí)驗(yàn)室在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)建立自己實(shí)驗(yàn)室的菌株自發(fā)回變菌落數(shù)和對(duì)陽(yáng)性誘變劑的回變菌落數(shù)的歷史背景數(shù)據(jù)庫(kù)。其中，張慧君等[28]研究顯示多次傳代后會(huì)影響菌株的自發(fā)回變數(shù)，建議實(shí)驗(yàn)室控制菌株傳代次數(shù)，必要時(shí)對(duì)傳代后用于試驗(yàn)的菌株進(jìn)行鑒定?？傊鱾€(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)規(guī)定好試驗(yàn)菌株鑒定的試驗(yàn)方法和鑒定頻率，只有菌株合格，才能為Ames 試驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)、可靠提供根本保障。