于景娜 謝 麗 陳志宇,3 鐘慧芳 屠 潔 李 芳 楊甲甲 羅 茜,3**

（1.河北工程大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，邯鄲，056038；2.中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳，518055；3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京，100049）

中國心理健康調(diào)查報告顯示國內(nèi)精神障礙疾病負(fù)擔(dān)較重，抑郁和焦慮癥患病率較高[1].心理健康受到社會和環(huán)境等多種因素影響，引發(fā)的炎癥、氧化應(yīng)激和神經(jīng)遞質(zhì)紊亂都可能是神經(jīng)系統(tǒng)疾病的致病因素.長期壓力應(yīng)激狀態(tài)會誘發(fā)焦慮、抑郁等精神類疾病，還具有導(dǎo)致器官功能性病變的風(fēng)險[2].環(huán)境污染也可影響疾病的發(fā)生發(fā)展過程，污染物暴露可通過影響下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）的功能和應(yīng)激反應(yīng)而引發(fā)心理疾病[3].研究表明心理應(yīng)激和交通或工業(yè)空氣污染對健康的不良影響存在明顯協(xié)同效應(yīng)[4].慢性壓力應(yīng)激狀態(tài)下，全身易感性增強(qiáng)，環(huán)境污染物的毒性作用更為明顯.據(jù)報道，慢性壓力應(yīng)激和150 mg·kg?1醋酸鉛同時暴露2 個月可顯著影響大鼠基底皮質(zhì)酮水平與HPA 軸功能[5].Zhou 等[6]發(fā)現(xiàn)妊娠期孕婦社會心理壓力較大時，鉛金屬污染物暴露與嬰幼兒神經(jīng)缺陷、認(rèn)知發(fā)育不全等不良健康的關(guān)聯(lián)性增加.Clougherty 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，處于慢性壓力下的大鼠對濃縮細(xì)顆粒空氣污染的呼吸反應(yīng)更強(qiáng)，并可能存在不同易感性的途徑.現(xiàn)有流行病學(xué)數(shù)據(jù)無法確定差異易感性的生理機(jī)制[8]，因此，本文基于毒理代謝組學(xué)闡明慢性壓力應(yīng)激和污染暴露之間的潛在相互作用.

B[a]P 是環(huán)境和食品中常見的污染物，主要通過呼吸和飲食途徑進(jìn)入體內(nèi)，在肝臟蓄積和代謝活化，導(dǎo)致肝功能異?；蚋螕p傷[9].B[a]P 及其代謝物可與體內(nèi)氨基酸、有機(jī)酸、脂質(zhì)等代謝物相互作用而具有肝毒性效應(yīng)[10].長期慢性心理應(yīng)激狀態(tài)下機(jī)體生理功能和免疫力顯著降低[11]，因此可能對B[a]P 暴露的應(yīng)答會產(chǎn)生更復(fù)雜影響，但目前未有明確的影響機(jī)制研究.本研究選用慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredictable mild stimulation，CUMS）作為慢性壓力應(yīng)激模型，采用靶向代謝組學(xué)分析方法研究了不同劑量B[a]P 和CUMS 單獨或兩者同時暴露對雄性C57BL/6J 小鼠肝臟中氨基酸、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝的影響，并通過統(tǒng)計學(xué)分析篩選出了差異代謝物，擬從代謝物差異變化初步探討肝臟對B[a]P 和慢性壓力應(yīng)激的應(yīng)答和代謝機(jī)制.

1 材料與方法（Materials and methods）

1.1 試劑

B[a]P（≥96%，HPLC 級）購自Sigma 化學(xué)公司（St Louis，MO，USA）；甲酸（LC-MS 級）、乙腈（LCMS 級）、甲醇（LC-MS 級）和甲酸銨（LC-MS 級）購自J&K 化學(xué)公司（Beijing，China）；超純水由美國Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Millipore，Billerica，USA）凈化.

1.2 實驗動物

雄性C57BL/6J 小鼠（7 周齡）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司（Beijing，China），并在中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院喂養(yǎng)，保持12 h 光/暗循環(huán)，恒溫20—26 ℃，相對濕度40% —70%.動物實驗經(jīng)中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院動物實驗和實驗動物福利委員會批準(zhǔn)，所有涉及動物的實驗程序都嚴(yán)格按照國家動物實驗法律法規(guī)和參考美國國立衛(wèi)生研究院出版的《實驗動物護(hù)理和使用指南》執(zhí)行.

1.3 動物實驗

小鼠適應(yīng)環(huán)境一周后被隨機(jī)分成6 組（n=7）：對照組（給予等體積橄欖油）、低劑量B[a]P 暴露組（2.0 mg·kg?1·d?1）、高劑量B[a]P 暴露組（20.0 mg·kg?1·d?1）、CUMS 組（給予等體積的橄欖油和CUMS 刺激）、低/高劑量B[a]P 和CUMS 同時暴露組（不同劑量B[a]P 暴露基礎(chǔ)上進(jìn)行CUMS 刺激）.B[a]P 溶于橄欖油中采用口服灌胃方式暴露；低/高劑量B[a]P 和CUMS 同時暴露組在灌胃2 h 后以隨機(jī)排序給予以下CUMS 刺激操作：①小鼠置于相對濕度40%—70%的潮濕環(huán)境中12 h，②每只小鼠置于50 mL 管中禁食禁水2 h 進(jìn)行約束處理，③將4 只小鼠同時置于3 cm × 5 cm × 7 cm 的盒子中2 h，并禁食禁水.持續(xù)暴露21 d，暴露實驗開始和結(jié)束時記錄小鼠體重.暴露結(jié)束后頸部脫臼法處死小鼠，立即切除肝組織，稱取肝臟濕重用于計算肝臟臟器系數(shù)（肝臟臟器系數(shù)=肝臟濕重/體重 × 100%），隨后在液氮中速凍、轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱儲存.

1.4 靶向代謝組學(xué)分析

1.4.1 樣品前處理

取適量肝臟組織樣本置于2.0 mL 離心管中，加入超純水（肝組織重量:水重量=4:1），在高通量組織研磨儀（SCIENTZ-48L，Scientz，China）中進(jìn)行研磨（4 ℃,2.0 min）.稱取約15 mg 肝組織勻漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL 新離心管中，加入0.2 mL 甲醇，渦旋振蕩20 min，在4 ℃和12000 r·min?1條件下離心15 min，取上清液進(jìn)行儀器分析.

1.4.2 儀器分析

使用超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS 8060，Shimadzu，Japan）對肝臟組織中75 種氨基酸、有機(jī)酸和膽汁酸類相關(guān)代謝物（表1、表2 和表3）進(jìn)行測定，采用外標(biāo)法進(jìn)行定量.具體分析條件如下.

表1 氨基酸代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters for amino acid metabolites

表3 膽汁酸代謝物的質(zhì)譜參數(shù)Table 3 Mass spectrometry parameters for bile metabolites

色譜參數(shù)：色譜柱柱溫為40 ℃，流動相流速為0.2 mL·min?1，進(jìn)樣量為1.0 μL.

氨基酸類：Waters ACQUITY UPLC?HSS T3 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm），流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫程序為：0 — 0.5 min，0% B；6.0 min，75% B；6.1 min，0% B，維持2.0 min.

有機(jī)酸類：Waters ACQUITY UPLC?HSS C18 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動相A 為0.01mol· L?1甲酸銨-水，流動相B 為0.01mol· L?1甲酸銨-甲醇，梯度洗脫順序為：0 min，5% B；2.0 min，60% B；2.1 min，5% B，維持2 min.

膽汁酸類：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18 色譜柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm），流動相A 為0.1%甲酸-水，流動相B 為0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脫程序：0.0 min，40%B；0.5 min，45%B；1.0 min，50%B；2.0 min，52%B；2.5 min，53%B；4.5 min，54%B；5.0 min，55%B，維持1.0 min；7.0 min，70%B；8.0 min，95%B；8.5 min，100%B，維持1.0 min；10.5 min，40% B，平衡2.0 min.

質(zhì)譜參數(shù)：正離子和負(fù)離子模式下電噴霧電壓分別為4.0 kV 和-3.0 kV，霧化氣體流量3.0 L·min?1，干燥氣流量10 L·min?1，加熱氣體流量10 L·min?1，接口溫度300 ℃，DL 溫度250 ℃，加熱模塊溫度400 ℃.各代謝物具體質(zhì)譜參數(shù)如表1、表2 和表3 所示，定量限為0.02—220.44 μg·L?1，檢出限為0.01—77.44 μg·L?1.

1.5 代謝擾亂度計算

代謝擾亂度（Metabolic effect level index,MELI）是一種用于評估暴露后生物體代謝產(chǎn)物、特定代謝途徑或整體代謝反應(yīng)的定量終點指標(biāo)[12].首先根據(jù)公式（1）計算不同組別樣品中每個代謝物的變化（MCi）.其中，Ai為暴露組與對照組中單個代謝物i平均濃度的比值，ln（1）用于抵消對照組代謝水平.

將各代謝物的代謝變化匯總為累積代謝變化，根據(jù)公式（2）計算MELI 值：

當(dāng)MELIComb值接近MELIB[a]P和MELICUMS平方和的算術(shù)平方根時，B[a]P 和CUMS 的聯(lián)合效應(yīng)類型為加和效應(yīng)；當(dāng)MELIComb值大于MELIB[a]P和MELICUMS之和時，聯(lián)合效應(yīng)類型為協(xié)同效應(yīng)；當(dāng)MELIComb值小于MELIB[a]P或MELICUMS時，聯(lián)合效應(yīng)類型為拮抗效應(yīng).

1.6 統(tǒng)計分析

使用MetaboAnalyst 5.0 在線分析軟件進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析，基于KEGG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析（https://www.metaboanalyst.ca/），GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和繪圖.使用單因素方差分析P＜ 0.05，偏最小二乘判別分析模型變量影響重要性因子（Variable importance in the projection，VIP）值 ＞1.0 和ROC 曲線下面積（Area under curve，AUC）值 ＞ 0.75，作為顯著差異代謝物的篩選準(zhǔn)則.所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（Mean ± SD）表示，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）分析組間差異，P＜0.05 為組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果和討論（Results and discussion）

2.1 不同暴露條件對小鼠體重和肝臟臟器系數(shù)的影響

暴露實驗結(jié)束時小鼠體重增加系數(shù)見圖1a.連續(xù)暴露21 d，除2.0 mg·kg?1·d?1的B[a]P 暴露組外，20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 單獨暴露及不同劑量B[a]P 與CUMS 共同暴露的小鼠體重平均增長系數(shù)均低于對照組，表明高劑量B[a]P 與CUMS 單獨暴露及B[a]P 與CUMS 同時暴露均可在一定程度上抑制小鼠的體重增長，減緩小鼠的生長速率.如圖1b 所示，不同劑量B[a]P 與CUMS 單獨或二者同時暴露的小鼠肝臟臟器系數(shù)均低于對照組，表明B[a]P 與CUMS 均可引發(fā)肝臟出現(xiàn)一定程度萎縮，說明肝臟是B[a]P 與CUMS 暴露的重要靶器官.

圖1 不同劑量B[a]P 和CUMS 單獨或同時暴露后變化情況（a）小鼠體重；（b）肝組織臟器系數(shù)數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=7，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01 為組間具有顯著差異Fig.1 Different doses of B[a]P and CUMS alone or in combination with post-exposure mouse body weight（a）and changes in the coefficients of liver tissue organs（b）Data were shown in Means ± SD,n=7,*P ＜ 0.05 and **P ＜ 0.01 represented significant differences among each group

2.2 B[a]P 暴露對小鼠肝臟代謝的影響

采用PLS-DA 評估不同劑量B[a]P 暴露后小鼠肝臟氨基酸、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝的變化.模型累計貢獻(xiàn)率（R2）和模型預(yù)測能力（Q2）分別為0.947 和0.676，置換檢驗P值為0.021，表明建立的PLSDA 模型具有良好的解釋和預(yù)測能力，且不存在過擬合情況.如圖2a 所示，兩個暴露組和對照組在第一主成分上得到良好區(qū)分，說明兩個劑量B[a]P 暴露均可引起小鼠肝臟代謝紊亂.

篩選出兩種B[a]P 暴露劑量下的顯著差異代謝物，結(jié)果如圖2b 所示（篩選準(zhǔn)則見1.6 節(jié)所述）.與對照組相比，2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 可使小鼠肝臟中精氨琥珀酸、精氨酸、丙氨酸水平顯著上升（P＜0.05）而谷氨酰胺水平顯著下降（P＜ 0.01）；20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 導(dǎo)致小鼠肝臟中谷氨酰胺水平顯著降低（P＜ 0.01）和丙氨酸顯著升高（P＜ 0.05）.以往研究也發(fā)現(xiàn)，腹腔注射1 mg·kg?1·d?1的B[a]P 可使SD 大鼠肝臟組織中氨基酸代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致谷氨酰胺顯著下降，精氨酸、丙氨酸等顯著升高，谷草轉(zhuǎn)氨酶顯著升高[13].作為細(xì)胞增殖分化的必需營養(yǎng)物質(zhì)，肝臟中谷氨酰胺含量下降可能與癌細(xì)胞增殖攝取有關(guān)，并有可能促發(fā)肝細(xì)胞凋亡[14].Wang 等[15]發(fā)現(xiàn)，10 mg·kg?1和20 mg·kg?1B[a]P 暴露3 個月大鼠肝癌發(fā)生率分別為26.3%和35.3%，Michurina 等[16]也發(fā)現(xiàn)，200 mg·kg?1B[a]P 暴露3 d 后可致大鼠肝細(xì)胞凋亡.同時，谷氨酰胺與丙氨酸還是肝糖原異生的重要底物[17]，推測B[a]P 暴露也會影響小鼠肝臟中糖異生能量轉(zhuǎn)化途徑.此外，精氨酸與精氨琥珀酸是尿素循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，2.0 mg·kg?1B[a]P 暴露后兩者顯著上升表明尿素循環(huán)代謝被擾亂，可能會引發(fā)肝功能衰竭、化學(xué)性肝損傷等肝臟疾病[18].

如圖2c 和2d 所示，通過對顯著差異代謝物進(jìn)行KEGG 代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，兩個不同劑量B[a]P 暴露主要影響小鼠肝臟丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氨基?；?tRNA 生物合成、氮代謝、精氨酸代謝合成，而2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 影響的9 個代謝通路，20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 影響的8 個代謝通路.這些結(jié)果表明，B[a]P 經(jīng)口暴露后主要影響肝臟氨基酸代謝，低劑量B[a]P 暴露的影響更為明顯.

2.3 B[a]P 與慢性壓力應(yīng)激暴露對小鼠肝臟代謝影響

如圖3a 所示，從PLS-DA 因子得分圖（R2=0.729，Q2=0.357，P＜ 0.001）可以看出，CUMS 單獨暴露和與B[a]P 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸和膽汁酸代謝都有明顯影響.根據(jù)差異代謝物篩選準(zhǔn)則，發(fā)現(xiàn)CUMS 刺激后，小鼠肝組織中同型半胱氨酸水平顯著下降（P＜ 0.05），這與以往有關(guān)CUMS 刺激后小鼠肝臟組織代謝變化的結(jié)果一致[19].同時，發(fā)現(xiàn)兩個劑量B[a]P 和CUMS 同時暴露小鼠肝臟的氨基酸和膽汁酸代謝物變化，如圖3b 中所示，2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 同時暴露使得小鼠肝組織中5-羥基吲哚乙酸、同型半胱氨酸、組氨酸、瓜氨酸、甘氨酸、絲氨酸水平顯著降低（P＜ 0.05）；而20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 同時暴露則主要干擾肝臟膽汁酸代謝途徑，表現(xiàn)為甘膽酸、?；切苊撗跄懰?、?；悄懰?、膽酸和α-鼠膽酸水平顯著升高（P＜ 0.05）.即2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 共同暴露后肝臟氨基酸代謝紊亂而20.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 與CUMS 共同暴露后肝臟膽汁酸代謝異常.作為參與機(jī)體膽固醇和脂質(zhì)代謝的內(nèi)源性小分子代謝物，膽汁酸在肝組織中的累積會誘導(dǎo)肝損傷的發(fā)生[20].此外，次級膽汁酸如甘膽酸、?；切苊撗跄懰岬乃阶兓c肝性腦病和2-型糖尿病有關(guān)[21].同時氨基酸代謝與肝臟正常生理功能密切相關(guān)，其紊亂還與肝炎、肝硬化等疾病的發(fā)生有關(guān)[22].已有文獻(xiàn)報道，CUMS 和B[a]P 暴露都可使小鼠肝功能血清生化指標(biāo)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性升高[23?24]，且肝組織HE 染色后可觀察到明顯的組織病理學(xué)變化[25?26]，表明CUMS 和B[a]P 可導(dǎo)致肝功能異常和肝損傷.因此，推測B[a]P 與CUMS 暴露引發(fā)的小鼠肝臟氨基酸和膽汁酸代謝物的變化是其誘導(dǎo)肝功能異常和肝損傷可能的機(jī)制之一.

2.4 B[a]P 與慢性壓力應(yīng)激同時暴露的作用效應(yīng)類型

環(huán)境污染和心理健康是疾病發(fā)生與發(fā)展的兩大因素，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)空氣污染暴露對處于慢性壓力狀態(tài)機(jī)體的不良影響顯著增加[27]，但具體的生理機(jī)制及兩者間相互作用尚不完全清楚.毒理代謝組學(xué)可從代謝物角度揭示壓力應(yīng)激和環(huán)境污染暴露之間的效應(yīng)，代謝擾亂度（MELI）可將信息量豐富的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成一個綜合的定量終點，目前已被用于評估反映PM2.5、氯化石蠟等污染物暴露后細(xì)胞代謝的的總體變化情況[28?29].小鼠肝組織中氨基酸代謝、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝在B[a]P 與CUMS 單獨或同時暴露后MELI 值見圖4.

圖4 不同劑量B[a]P 與CUMS 單獨或二者同時暴露后小鼠肝組織中代謝擾亂度值（a）氨基酸代謝，（b）TCA 循環(huán)，（c）膽汁酸代謝（數(shù)據(jù)以均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=7）Fig.4 The MELI of amino acids metabolism（a）TCA cycle（b）and bile acids metabolism（c）of mice liver after single or combined exposure to CUMS and B[a]P with different dose Data were shown in Mean ± SD,n=7

從圖4 中看出，20.0 mg·kg?1·d?1的B[a]P 對氨基酸代謝、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝的影響更大.如圖4a 所示，氨基酸代謝MELILow-CUMS值小于MELILow和MELICUMS表明低劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸代謝的聯(lián)合效應(yīng)為拮抗效應(yīng)；MELIHigh-CUMS值接近于MELILow2+MELICUMS2算術(shù)平方根的值，說明高劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸的聯(lián)合效應(yīng)為加和效應(yīng).TCA 循環(huán)的MELILow-CUMS值大于MELILow+MELICUMS，而MELIHigh-CUMS值小于MELIHigh且大于MELICUMS（圖4b），說明低劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟TCA 循環(huán)具有協(xié)同效應(yīng)，而高劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟TCA 循環(huán)具有拮抗效應(yīng).不同劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟氨基酸代謝和TCA 循環(huán)的聯(lián)合效應(yīng)均不同，其效應(yīng)的類型與共同暴露時B[a]P 的劑量有關(guān).此外，膽汁酸代謝的MELILow-CUMS與MELIHigh-CUMS值分別接近MELILow2+MELICUMS2和MELIHigh2+MELICUMS2（圖4c），表明不同劑量B[a]P 與CUMS 同時暴露對小鼠肝臟膽汁酸代謝的聯(lián)合效應(yīng)類型均為加和效應(yīng).

3 結(jié)論（Conclusion）

本研究通過靶向代謝組學(xué)分析方法，發(fā)現(xiàn)了暴露在B[a]P 下主要影響氨基酸代謝且不同劑量條件下小鼠肝臟代謝應(yīng)答存在明顯差異.不同劑量B[a]P 均可導(dǎo)致谷氨酰胺水平顯著下降，丙氨酸顯著上升；同時2.0 mg·kg?1·d?1B[a]P 還可使精氨琥珀酸、精氨酸顯著上升.不同劑量B[a]P 對肝臟代謝影響的機(jī)制是不同的.慢性壓力應(yīng)激影響小鼠肝臟氨基酸代謝，同型半胱氨酸含量顯著下降.B[a]P 與CUMS 同時暴露，使得小鼠肝臟氨基酸和膽汁酸代謝發(fā)生顯著變化，差異的代謝物與兩者單獨暴露明顯不同.利用MELI 評估污染物和精神因素對小鼠肝臟代謝的聯(lián)合作用，不同劑量B[a]P 與CUMS 對氨基酸代謝、TCA 循環(huán)和膽汁酸代謝具有不同的作用，差異的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究.本研究初步闡明了兩大因子對肝臟氨基酸、有機(jī)酸和膽汁酸代謝的影響，但對脂質(zhì)、激素等代謝的影響及具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究.綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的代謝異常與肝損傷、肝功能異常、肝細(xì)胞炎癥和肝癌等病變的發(fā)生有關(guān)，這有助于進(jìn)一步理解環(huán)境污染物與精神因素對機(jī)體健康的作用.