朱錦麗, 喬欣悅, 嚴雪冰, 王成海

(1. 揚州大學附屬醫(yī)院 病案統(tǒng)計科, 江蘇 揚州, 225009; 2. 揚州大學醫(yī)學院 病理教研室, 江蘇 揚州, 225009;3. 揚州大學附屬醫(yī)院 腫瘤科, 江蘇 揚州, 225009)

胃癌(GC)是消化系統(tǒng)常見癌癥類型,是來源于胃黏膜細胞和腺上皮的惡性腫瘤,病理組織學主要類型為胃腺癌。胃癌的發(fā)病率位于全部癌癥的第4位,而病死率卻位居第2位[1]。隨著醫(yī)學的不斷進步,胃癌的診治效果明顯提升,但胃癌患者的5年存活率仍低于20%[2-3]。目前還未發(fā)現(xiàn)胃癌早期特異性和敏感性診斷指標。PIWI蛋白相互作用RNA(piRNA)是一種包含20～30個核苷酸的非編碼RNA, 與PIWI蛋白結合發(fā)揮相應的生物學功能[4-5]。LIN X D等[6]在胃癌組織和鄰近正常胃黏膜組織中檢查了piRNA表達譜異常情況,結果發(fā)現(xiàn)piR-47851表達水平升高。本研究探討piR-47851在大樣本胃腺癌中的表達情況以及其生物學功能,現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

選取2020年1月—2022年12月在揚州大學附屬醫(yī)院接受胃癌根治術并經(jīng)病理檢查確診為胃腺癌的79例患者作為研究對象,其中男56例,女23例,年齡39～70歲,中位年齡55歲。納入標準: ① 胃癌診斷符合《中華醫(yī)學會胃癌臨床診療指南(2021版)》[7], 均經(jīng)術后病理診斷確診者; ② 臨床病理資料完整者; ③ 認知功能正常者,溝通無障礙,可進行術后隨訪; ④ 入組前未接受免疫治療、放化療等相關治療者。排除標準: ① 合并有心腦血管疾病、傳染性疾病、感染性疾病、自身免疫性疾病者; ② 妊娠期或哺乳期女性患者; ③ 有其他類型惡性腫瘤者。本研究經(jīng)揚州大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核備案(批準號: 2023-YKL11-006)。

1.2 細胞和質粒

人胃腺癌細胞SGC7901、AGS購自中科院上海細胞生物庫,培養(yǎng)基分別為RPMI-1640和H-DMEM; GES-1細胞(人胃黏膜上皮細胞系)購自上海賓穗生物科技有限公司,培養(yǎng)基為RPMI-1640。所有細胞培養(yǎng)基中添加1%的青霉素/鏈霉素(Invitrogen公司)。細胞在37 ℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[8]。piR-47851模擬物/抑制劑的相關質粒和對照組均購自漢恒生物科技(上海)有限公司。使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)將相關質粒轉染到胃腺癌細胞株中。主要基因的引物和序列見表1。

表1 主要基因的引物序列

1.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)

使用TRIzol試劑(Invitrogen公司)分離胃癌組織總RNA。RNA的光密度(OD)A260/230比值>1.8。使用PrimeScript第一鏈cDNA合成試劑盒(Takara), 并根據(jù)試劑盒說明書將RNA反向轉錄成cDNA。在Applied Biosystems 7500 PCR儀器上按照實時熒光定量試劑盒(Takara)的步驟進行qRT-PCR實驗,步驟包括預變性(95 ℃ 30 s)、PCR反應(重復40個循環(huán), 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30～60 s)。

1.4 原位雜交實驗

79例新鮮標本進行組織切片。在室溫下,過氧化氫處理可消除內(nèi)源性過氧化物酶; 使用胃蛋白酶消化組織切片; 采用預雜交液在培養(yǎng)箱中孵育組織切片,然后加入雜交液孵育12 h; 清洗后加入密封液; 加入生物素化地高辛; 組織中加入SABC; 加入生物素化過氧化物酶; 組織進行DAB染色、蘇木精復染、洗滌、脫水、透明、封閉; 采用預雜交液代替含有探針的雜交液作為空白對照,piR-47851寡核苷酸探針序列為2條,第1條AUGCAGGCUCACUGCAACUUCCGCCU, 第2條AGAUGCACUUCCGCCUCCTGGGGUCA。

1.5 CCK-8實驗

將胃癌細胞懸浮在96孔板的孔洞里,每個孔洞里加入100 μL[(4～5)×103個細胞],設置3個復孔; 置入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱里中培養(yǎng),直到鋪滿整個孔底; 每個孔中加入10 μL CCK-8溶液,輕輕擊打培養(yǎng)板使細胞與溶液混勻,細胞培養(yǎng)箱中孵育4 h。使用酶標儀在450 nm可見光上計算吸收值(注意在結果中需要減去具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光值),計算出降低表達/過表達piR-47851對細胞的增殖活性影響。

1.6 雙熒光素酶報告基因實驗

PCR擴增包含piR-47851結合位點的MAPK1 3′UTR區(qū)域500個堿基,插入在熒光素酶表達載體pGL4.20載體質粒中,構建目的序列的重組載體,使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen)根據(jù)產(chǎn)品說明書將相關pGL4.20質粒轉染進胃癌細胞株中。使用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒,觀察熒光素酶的發(fā)光情況,檢測piR-47851對MAPK1 3′UTR的調(diào)控。實驗分組分為MAPK1-WT(野生型)組和MAPK1-Mut(突變型)組。首先將樣本和雙熒光素酶報告試劑盒置于室溫中,然后每孔加入100 μL螢火蟲熒光素酶檢測試劑,迅速加入20 μL樣本,混勻后酶標儀讀數(shù),空白對照組為細胞裂解液組; 然后每孔中再加入100 μL海腎熒光素酶試劑,混勻后讀數(shù)。比值計算: 海腎熒光素酶測定值/螢火蟲熒光素酶測定值。

1.7 免疫組化實驗

切片厚度4 μm, 烤片后二甲苯脫蠟,經(jīng)無水酒精及梯度酒精直至水洗。采用H2O2孵育切片10 min, 滅活組織切片內(nèi)源性的過氧化物酶,采用磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗凈。將切片置于抗原修復液中修復抗原, PBS緩沖液沖洗。在正常羊血清封閉液中封閉。把封閉液去除后,滴加即用型一抗,放入4 ℃冰箱過夜; 滴加二抗(生物素標記), 37 ℃培養(yǎng)箱中孵育0.5 h, PBS緩沖液洗滌; 滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液, 37 ℃孵育20 min, PBS緩沖液洗滌; DAB染色液顯色,蘇木素藍色復染胞核,脫水,透明,封片,光鏡下觀察。陽性染色為棕黃色顆粒。采用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.8 裸鼠皮下移植瘤模型

BALB/C-nu/nu裸鼠來源于揚州大學動物實驗中心,裸鼠質量25～28 g, 5～7周齡,分為實驗組20只和對照組20只,飼養(yǎng)在SPF級動物培養(yǎng)箱里。在第4天于裸鼠右側腋腹壁的皮下接種胃癌細胞100 μL, 約5×106個細胞。接種后每天監(jiān)測裸鼠生活情況及皮下瘤組織生長情況。50 d后拉頸迅速處死裸鼠,完整剝離瘤體,對腫瘤體積大小和重量進行測量,并給予拍照。裸鼠研究獲得揚州大學動物實驗倫理委員會批準。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0和Graph Pad 5.0軟件分析數(shù)據(jù)和編輯圖片。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗,計量資料采用均數(shù)±標準差表示,均符合正態(tài)分布,組間比較采用t檢驗,多組間比較采用ANOVA檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 piR-47851在胃腺癌組織中的表達

qRT-PCR實驗檢測了79對胃腺癌腫瘤標本和鄰近正常組織。在胃腺癌標本中, piR-47851表達水平為(3.120±1.564), 高于癌旁正常組織標本的(1.466±0.554), 差異有統(tǒng)計學意義(t=9.071,P<0.05); 在胃腺癌細胞SGC7901和AGS中, piR-47851表達水平均高于正常胃黏膜上皮GES-1細胞,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。該結果提示piR-47851在胃腺癌中發(fā)揮促癌基因的作用。見圖1。

2.2 原位雜交(RISH)檢測piR-47851的陽性表達

采用RISH檢測79對胃腺癌組織和癌旁正常組織中piR-47851的陽性表達情況。在胃腺癌組織中, piR-47851主要為陽性表達,陽性物質為棕黃色, piR-47851陽性率為72.15%(57/79), 高于鄰近正常組織的陽性率15.19%(12/79), 差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.461,P=0.019)。見圖2。

2.3 piR-47851的陽性表達及其臨床意義

根據(jù)piR-47851的陽性表達情況,探討其與臨床資料的相關性。首先將胃腺癌病例分為陽性表達組(n=57)和陰性表達組(n=22), 結果顯示, piR-47851陽性表達與腫瘤直徑、分化程度密切相關(χ2=5.955、7.611,P<0.05), 而與患者性別、年齡、浸潤深度、淋巴結轉移和TNM分期無相關性(P>0.05)。該結果提示piR-47851參與了胃腺癌的生長增殖過程。見表2。

表2 胃腺癌組織中piR-47851表達與臨床資料的相關性[n(%)]

2.4 piR-47851表達對胃癌患者生存預后的影響

piR-47851陽性表達組中位總生存期為23個月(四分位區(qū)間為4～44個月), piR-47851陰性表達組中位總生存期為32個月(四分位區(qū)間為7～51個月)。陰性表達組總生存期長于陽性表達組,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=5.864,P=0.016), 見圖3。

2.5 piR-47851促進胃癌細胞的增殖活性

CCK-8實驗分析piR-47851對胃腺癌細胞增殖活性的結果顯示,在72 h時,過表達piR-47851后的SGC7901細胞的增殖活性為(0.89±0.05), 高于對照組的(0.72±0.04), 差異有統(tǒng)計學意義(t=6.425,P<0.05); 降低piR-47851表達后, SGC7901細胞的增殖活性為(0.54±0.03), 低于對照組的(0.75±0.04), 差異有統(tǒng)計學意義(t=4.091,P<0.05)。該結果表明piR-47851能促進胃癌細胞的增殖活性,有助于腫瘤的生長。見圖4。

2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測piR-47851與MAPK1的關系

通過生物信息學預測piR-47851與MAPK1 3′非翻譯區(qū)(UTR)有29個基因的互補結合位點(圖5A), 然后在SGC7901細胞中進行了雙熒光素酶報告實驗。實驗結果顯示piR-47851與野生型MAPK13′UTR結合后能降低熒光素酶的活性,而與突變型結合卻沒有降低熒光素酶的活性(圖5B), 說明piR-47851與MAPK13′UTR結合后能抑制MAPK1的蛋白翻譯,因此MAPK1是piR-47851的下游直接靶基因。

2.7 Rescue實驗佐證piR-47851對MAPK1調(diào)控及對增殖活性的影響

因為piR-47851是非編碼RNA,故本研究僅能在RNA水平上通過qRT-PCR實驗進行Rescue實驗檢測。實驗共分為8組: 第1組為piRNA-NC+si-NC; 第2組為piRNA-NC+si-MAPK1; 第3組為si-piR-47851+Vector; 第4組為si-piR-47851+MAPK1; 第5組為piR-47851+MAPK1; 第6組為piR-47851+Vector; 第7組為si-piR-47851+si-NC; 第8組為si- piR-47851+si-MAPK1。Rescue實驗結果表明,在改變piR-47851的表達后再改變MAPK1的表達,然后通過qRT-PCR檢測MAPK1的表達水平,得到MAPK1都能受到piR-47851的調(diào)控,見圖6。進一步的CCK-8增殖活性實驗表明,過表達MAPK1可以增強piRNA-47851對胃腺癌細胞增殖的促進作用,而敲低MAPK1可進一步抑制胃腺癌細胞的增殖活性。見表3。

表3 Rescue實驗對MAPK1和增殖活性的影響

2.8 裸鼠實驗驗證降低piR-47851表達對胃腺癌細胞增殖的影響

BALB/c小鼠實驗分為2組,即降低piR-47851表達組(20只, 5周)和對照組(20只,5周); 每只小鼠在右側腋腹壁的皮下接種SGC7901細胞(每200 μL含有4×106個)。每天監(jiān)測裸鼠及瘤體生長情況,計算每組裸鼠移植瘤瘤體的體積均值,制作出移植瘤生長曲線。50～60 d后,麻醉處死裸鼠,取出腫瘤組織并測量體積和大小,拍照并進行后續(xù)實驗。大體觀察顯示,降低piR-47851表達后移植瘤生長體積和質量均小于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖7。細胞增殖指標Ki-67染色結果顯示,降低piR-47851表達組中Ki-67陽性細胞比率為(16.9±2.4)%, 低于對照組的(79.2±6.8)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖8。

3 討 論

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮和腺上皮的消化道惡性腫瘤,其發(fā)生發(fā)展涉及多種因素、多個環(huán)節(jié),與飲食習慣、幽門螺桿菌感染和遺傳等密切相關[9]。胃癌在全球范圍內(nèi)具有高死亡率,大多數(shù)胃癌患者確診時已為晚期,不適合手術治療[10]。

piRNA是一類與PIWI蛋白相互作用的RNA, 其長度為24～31 nt, 為單鏈非編碼小RNA。piRNA主要存在于哺乳動物的生殖細胞和干細胞中,通過與PIWI亞家族蛋白結合形成piRNA復合物來調(diào)控基因沉默途徑[11-13]。piRNA的生物學功能包括沉默轉錄基因過程,調(diào)節(jié)蛋白質翻譯和維持mRNA的穩(wěn)定性等[14]。研究[15]表明, piRNAs在腫瘤的形成、發(fā)展和進展中起著促癌基因或抑癌基因的作用, piRNA已成為惡性腫瘤研究的熱點之一。

胃癌組織中piRNA也出現(xiàn)了表達異常,例如在轉移性胃癌患者的血液中, piR-004918、piR-019308表達水平升高,可以與CEA和CA19-9聯(lián)用成為胃癌的可靠生物標記物[16]。CHENG J等[17]發(fā)現(xiàn)piR-651在人類胃癌組織和細胞系中表達過高,通過抑制細胞周期在G2/M期的停滯可促使胃癌細胞生長加速, piR-651有望成為胃癌的候選診斷標志物。體內(nèi)和體外實驗[18]發(fā)現(xiàn),使用piR-823模擬物移植裸鼠皮下后可顯著抑制胃癌細胞的生長和增殖。本研究發(fā)現(xiàn),胃腺癌組織中piR-47851表達水平升高,說明了piR-47851作為piRNA的一員,在胃腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用和功能。

本研究RISH實驗提示,胃腺癌組織中piR-47851主要在胞漿中呈陽性表達,且qRT-PCR實驗顯示piR-47851表達水平上調(diào),提示piR-47851在胃腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著促癌基因的作用。進一步分析piR-47851陽性表達與胃腺癌的腫瘤直徑大小、分化程度和生存預后密切相關,而與患者年齡、性別、淋巴結轉移和TNM分期無相關性。這一結果表明, piR-47851與胃腺癌細胞的增殖和分化有關,即piR-47851在胃腺癌中表達水平越高,腫瘤細胞分化越低,越能生長增殖,且患者預后不佳,說明piR-47851是一個促癌基因,可成為胃腺癌增殖和預后判斷的生物標志物。TNM分期中的T代表原發(fā)腫瘤的大小和浸潤深度,本研究結果顯示piR-47851表達與胃腺癌的TNM分期無關(P=0.062), 這可能是本研究劃分的腫瘤直徑與TNM分期原發(fā)腫瘤大小不一致且本研究標本數(shù)量偏少有關。通過CCK-8實驗證明過表達piR-47851后,細胞的增殖活性升高; 降低piR-47851表達后,細胞的增殖活性下降,提示piR-47851促進了胃腺癌細胞的增殖活性,參與了胃癌的生長過程。

piR-47851位于GenBank: DQ579 739.1, 共30個堿基序列。通過生物信息學預測MAPK1是其下游靶基因之一, piR-47851與MAPK13′非翻譯區(qū)基因有互補的29個結合位點。進一步通過雙熒光素酶報告實驗證實piR-47851與MAPK13′非翻譯區(qū)結合后,抑制了MAPK1蛋白的表達,從而得出MAPK1是piR-47851下游的直接靶基因。MAPK1是MAP激酶家族的成員之一,參與多種細胞過程,例如增殖、分化、轉錄調(diào)控和發(fā)育[19]。MAPK1蛋白作為一種轉錄抑制因子獨立于其激酶活性[20]。盧燕華等[21]研究發(fā)現(xiàn),胃癌細胞中MAPK1表達水平下調(diào),抑制了癌細胞的侵襲轉移,而在肺癌[22]、宮頸癌[23]中MAPK1表達水平上調(diào),發(fā)揮促癌基因的作用。本研究表明,胃腺癌組織中MAPK1表達水平下調(diào),發(fā)揮抑癌基因的作用。Rescue實驗顯示, MAPK1都會受到piR-47851的調(diào)控,也說明了piR-47851/MAPK1信號通路參與胃腺癌細胞的增殖過程。在裸鼠體內(nèi)移植瘤實驗中,降低piR-47851表達后腫瘤生長緩慢,體積減小,瘤體質量也較輕。對移植瘤組織檢測增殖指標Ki-67時發(fā)現(xiàn),降低piR-47851表達組中Ki-67陽性比率顯著低于對照組,進一步驗證了piR-47851發(fā)揮促癌基因的作用。

綜上所述, piR-47851在胃腺癌組織中表達水平上調(diào),與腫瘤的直徑大小和預后密切相關; 在胃腺癌細胞中, piR-47851直接靶向MAPK13′UTR區(qū)域,抑制MAPK1的表達而促進胃腺癌細胞的增殖生長。