吳成憲，王益，劉賦斌

武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院，湖北 武漢 430000

肝細(xì)胞癌已成為世界范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因。乙型病毒性肝炎是由于乙型肝炎病毒（HBV）感染導(dǎo)致，可引起個(gè)體患肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加[1-2]。既往研究表明，我國(guó)是全球乙肝患者數(shù)量最多的國(guó)家，乙型病毒性肝炎患者的肝臟疾病進(jìn)展與病毒的活性復(fù)制密切相關(guān)，發(fā)展到一定程度會(huì)引發(fā)肝細(xì)胞癌變[3-5]。這對(duì)人類的生存造成了極大的威脅，目前治療肝癌的主要手段是肝切除術(shù)，此外，新輔助治療、輔助治療、靶向治療、免疫治療等近年來也逐漸興起。白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚有機(jī)化合物，是許多植物受到刺激時(shí)產(chǎn)生的一種抗毒素。既往研究表明葡萄內(nèi)含有較為豐富的白藜蘆醇[6]，而體外實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示白藜蘆醇有抗氧化、抗炎、抗癌及心血管保護(hù)等作用[7-11]。研究表明，白藜蘆醇可能通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路來治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌，但其內(nèi)在機(jī)制仍不明確[12-13]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合了藥理學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)的交叉學(xué)科，其基于生物網(wǎng)絡(luò)平衡原理，用以解釋疾病的病理生理過程[14]。通過對(duì)廣泛數(shù)據(jù)庫的深度挖掘，建立了一個(gè)復(fù)雜的“藥物–靶點(diǎn)–疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，著重強(qiáng)調(diào)了多靶點(diǎn)和多信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制。這一領(lǐng)域?yàn)橹形麽t(yī)結(jié)合治療提供了深遠(yuǎn)的理論指導(dǎo)。本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)對(duì)白藜蘆醇在治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌中的潛在靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行了預(yù)測(cè)，并揭示了其可能的作用機(jī)制。這些結(jié)果為未來的臨床應(yīng)用和深入研究提供了重要的學(xué)術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 白藜蘆醇靶點(diǎn)的篩選

通過數(shù)據(jù)庫PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）得到化合物白藜蘆醇化學(xué)結(jié)構(gòu)，并保存對(duì)應(yīng)Canonical SMILES 號(hào)，將得到的白藜蘆醇的SMILES 號(hào)分別輸入到 Swiss Target Prediction（https://swisstargetprediction.ch）和Target Net 數(shù)據(jù)庫（https://targetnet.scbdd.com）中，種屬定義為“Homo sapiens”“probability＞0”，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后篩選得到白藜蘆醇的潛在靶點(diǎn)。

1.2 乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的靶點(diǎn)篩選

通過GeneCards（https://www.genecards.org）、OMIM（https://www.omim.org）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫對(duì)關(guān)鍵詞“hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma”進(jìn)行檢索，種屬定義為“Homo sapiens”“score＞0”，剔除重復(fù)靶點(diǎn)后篩選得到乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的潛在靶點(diǎn)。

1.3 “藥物–疾病–靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

將數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)的白藜蘆醇的靶點(diǎn)和乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的靶點(diǎn)分別上傳到Venny 2.1.0平臺(tái)（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），得到白藜蘆醇和乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的交集靶點(diǎn)，并繪制白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的交集靶點(diǎn)韋恩圖。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將篩選出的白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌交集靶點(diǎn)，導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），種屬定義為“Homo sapiens”進(jìn)行分析，構(gòu)建交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，其閾值取“medium confidence”得到靶蛋白相互作用的核心網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，將結(jié)果導(dǎo)出為TSV 格式并導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件包，進(jìn)一步繪制藥物靶蛋白和疾病PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。通過網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霾寮–ytohubba）進(jìn)行拓?fù)浞治龊陀?jì)算，得到各個(gè)靶點(diǎn)的degree 值，篩選得到排名前10 名的靶標(biāo)蛋白為核心靶點(diǎn)。

1.5 基因本體（GO）和京都基因組百科全書（KEGG）富集分析

為了解釋核心靶點(diǎn)對(duì)基因功能的影響，將以上選取的白藜蘆醇和乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org）中，以P＜0.05 為篩選條件，獲得了對(duì)應(yīng)的GO和KEGG 通路富集的結(jié)果，進(jìn)一步使用“微生信”平臺(tái)對(duì)GO 分析與KEGG 富集分析進(jìn)行可視化。隨后進(jìn)行“藥物–靶點(diǎn)–通路”互作網(wǎng)絡(luò)的建立。

1.6 分子對(duì)接

通過進(jìn)一步在 PubChem 數(shù)據(jù)庫 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）檢索獲取白藜蘆醇的3D結(jié)構(gòu)式。在PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）將前10 位核心靶點(diǎn)的PDB 格式進(jìn)行下載。使用Pymol軟件對(duì)核心靶點(diǎn)去水和去配體，并保存。利用Autodock 軟件將degree 值前10 位核心靶點(diǎn)分別與白藜蘆醇進(jìn)行分子對(duì)接，將對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇藥物靶點(diǎn)及乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌疾病靶點(diǎn)的獲取

從Swiss Target Prediction 與Target Net 數(shù)據(jù)庫得到白藜蘆醇相關(guān)基因496 個(gè)；從GeneCards、OMIM、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫篩選得到乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的基因整合去重后得到1 018個(gè)基因。

2.2 白藜蘆醇藥物靶點(diǎn)及乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌疾病交集靶點(diǎn)的獲取

將得到的白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌靶點(diǎn)取交集并繪制韋恩圖，得到交集靶點(diǎn)48個(gè)，見圖1。

圖1 白藜蘆醇與乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌靶點(diǎn)Venn 圖Fig.1 Venn diagram of resveratrol and hepatitis B virusrelated liver cancer targets

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

在STRING 網(wǎng)站中提交白藜蘆醇–乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，物種選擇為“Home Sapiens”和“P＜0.05”，隱藏在網(wǎng)絡(luò)圖中未連接的點(diǎn)，最低置信度為0.400，見圖2。導(dǎo)出為“tsv”格式文件，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2 軟件，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化，然后使用Cytoscape 中的Cytohubba 進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，degree 值越高表示該節(jié)點(diǎn)在所有靶點(diǎn)中越重要，取degree 值前10位的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，依次為腫瘤壞死因子（TNF）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、B 細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、趨化因子C-XC-基元受體4（CXCR4）、熱休克蛋白90α 家族A類成員1（HSP90AA1）、熱休克蛋白90α 家族B 類成員1（HSP90AB1）、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、激酶插入?yún)^(qū)受體（KDR）、雌激素受體α（ESR1），見圖3。

圖2 交集靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)Fig.2 PPI network of intersection targets

圖3 基于degree 算法排名前10 位的核心靶點(diǎn)Fig.3 Top 10 core targets based on degree algorithm

2.4 GO 和KEGG 通路富集分析

將白藜蘆醇藥物靶點(diǎn)及乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 數(shù)據(jù)庫，設(shè)定P＜0.01 為篩選條件，分別進(jìn)行GO 分析與KEGG富集分析，得到446 個(gè)分子功能（MF）、3 148 個(gè)生物過程（BP）、285 個(gè)細(xì)胞組分（CC）和205 條信號(hào)通路，其中MF 前8 位的分別是C-C 趨化因子受體活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)子活性、內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、泛素蛋白連接酶結(jié)合、病毒受體活性、轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合。BP 前8 位分別是磷代謝過程的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控、對(duì)無機(jī)物的響應(yīng)、對(duì)激素的反應(yīng)、第二信使介導(dǎo)的信號(hào)、管的形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、組織形態(tài)發(fā)生。CC 前8 位分別是質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、胞體、細(xì)胞投射膜、細(xì)胞外基質(zhì)、黏著斑、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔。

KEGG 富集分析以P值由小到大的順序排列，結(jié)果癌癥中的通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、趨化因子信號(hào)通路、白細(xì)胞介素（IL）-17 信號(hào)通路、人巨細(xì)胞病毒感染、人類免疫缺陷病毒1 型感染、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物–晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（AGERAGE）信號(hào)通路；缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路等。使用“微生信”平臺(tái)對(duì)GO、KEGG 富集分析得到的結(jié)果繪制氣泡圖，見圖4。進(jìn)一步繪制“藥物–靶點(diǎn)–通路”互作網(wǎng)絡(luò)，見圖5。

圖5 “藥物–靶點(diǎn)–通路”互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 “Drug– target -pathway”interaction network

2.5 分子對(duì)接分析

對(duì)Cytoscape 使用拓?fù)浞治龅玫降?0 個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)TNF、MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1，分別和白藜蘆醇進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)合能均小于0，結(jié)合能越小則越容易結(jié)合，結(jié)合能越小配體與靶點(diǎn)之間的結(jié)合越穩(wěn)定，對(duì)接結(jié)合能見表1。利用Autodock4 導(dǎo)出的對(duì)接化合物結(jié)果導(dǎo)入Pymol 中，利用Pymol 對(duì)化合物進(jìn)行分子三維展示，見圖6。

表1 核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)合能Table 1 Molecular docking binding energy of core targets

圖6 白藜蘆醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接三維示意圖Fig.6 3D schematic diagram of molecular docking of resveratrol with key targets

3 討論

白藜蘆醇是多酚類型化合物的一種，其具有抗癌、抗菌、抗炎等藥理作用[15]，既往的研究表明，白藜蘆醇具備多種影響癌細(xì)胞生物學(xué)行為的特性，包括對(duì)癌細(xì)胞的增殖、凋亡和血管生成過程的干預(yù)，這些作用可顯著地抑制多種腫瘤的發(fā)展[16-17]。此外，白藜蘆醇還能夠逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞對(duì)多種藥物的耐藥性；當(dāng)與臨床藥物聯(lián)合使用時(shí)，白藜蘆醇不僅能夠提高癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[18-19]，還以劑量相關(guān)性的方式刺激淋巴細(xì)胞減少、IL-2 的釋放，增加IL-4 的分泌，從而進(jìn)一步增強(qiáng)抗癌治療效果[20]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究白藜蘆醇對(duì)乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的潛在作用機(jī)制，完成了藥物及疾病的靶點(diǎn)篩選、PPI 分析、功能富集分析、藥物–疾病–靶點(diǎn)–通路分析、分子對(duì)接模型的構(gòu)建。利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫，確定了48 個(gè)白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的靶基因，這表明白藜蘆醇對(duì)乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌具有一定的抗癌作用。通過Cytoscape 的拓?fù)浞治鲲@示，TNF、

MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1 為白藜蘆醇對(duì)乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。既往的研究表明白藜蘆醇通過調(diào)節(jié)TNF-β 信號(hào)通路，從而抑制MMP9、CXCR4 在腫瘤細(xì)胞中的激活[21-22]。此外，NK 細(xì)胞通過釋放TNF-α 等抗癌細(xì)胞因子來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[23]，而白藜蘆醇能增強(qiáng)NK 細(xì)胞的活性及抗癌能力[24]。EGFR 過度活化會(huì)引起磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt 信號(hào)通路的過度活化，從而引起腫瘤細(xì)胞的增殖[25]。在體外實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇處理人子宮癌細(xì)胞系（HeLa）細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HeLa 細(xì)胞中EGFR 顯著下調(diào)[26]，這表明白藜蘆醇能夠下調(diào)EGFR 從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。有研究表明，白藜蘆醇能夠增加腫瘤蛋白p53 與p53 靶基因的表達(dá)，其中就包括了Bcl-2[27-28]，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[29]。既往的研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤作用，而熱休克蛋白（HSP）的缺失，能夠增強(qiáng)白藜蘆醇對(duì)癌細(xì)胞的促凋亡作用[30]，相反HSP 的激活反而能夠抑制細(xì)胞凋亡[31]。Che 等[32]研究表明，白藜蘆醇通過降低PTGS2 從而抑制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展和促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Kiamehr 等[33]的研究表明低劑量的白藜蘆醇可促進(jìn)血管生成，而高劑量的白藜蘆醇會(huì)抑制VEGFR-2 磷酸化、抑制腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究表明，在人肝癌樣本中ESR1 的表達(dá)上調(diào)，而在體外使用白藜蘆醇處理人肝癌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)ESR1 表達(dá)下調(diào)，這提示ESR1可能作為白藜蘆醇發(fā)揮抗肝癌的藥物靶點(diǎn)[34]。

GO 功能富集分析顯示，交集靶點(diǎn)主要參與的BP 包括磷代謝過程的正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控、對(duì)無機(jī)物的響應(yīng)；參與的MF 主要包括C-C 趨化因子受體活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)子活性、內(nèi)肽酶活性等；CC 主要包括質(zhì)膜外側(cè)、膜筏、胞體、細(xì)胞投射膜、細(xì)胞外基質(zhì)等。KEGG 富集通路分析顯示，白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的主要作用通路包括癌癥中的通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、前列腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、趨化因子信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路等。蛋白聚糖在癌癥血管生成、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用[35]，此外，蛋白聚糖通過影響細(xì)胞代謝、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡信號(hào)、促進(jìn)細(xì)胞侵襲和參與免疫破壞的作用來促進(jìn)肝癌的發(fā)生與發(fā)展[36]。趨化因子在先天性與適應(yīng)性免疫中起積極作用，其由CXC、CC、C 或CX3C 亞型組成[37]，CXCR4 常常在惡性腫瘤中過度表達(dá)，CXCRL12/CXCR4 軸通過調(diào)節(jié)血管生成，誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)癌癥的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移[38]。近來越來越多的研究表明IL-17 在癌癥的形成中起重要作用[39]，其中的IL-17A 是一種促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，有研究表明IL-17A 阻斷劑可預(yù)防高?；颊甙l(fā)生肝細(xì)胞癌[40-41]。有學(xué)者提出，IL-17 同樣能通過促進(jìn)組織慢性炎癥來加快腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[42]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，人巨細(xì)胞病毒（CMV）能夠限制腫瘤細(xì)胞增殖并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡，此外，有很多的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ桶l(fā)現(xiàn)，CMV 感染能夠減緩腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)內(nèi)在半胱天冬酶癌細(xì)胞凋亡[43]，1 項(xiàng)研究中同樣發(fā)現(xiàn)在肝癌患者接受肝移植后，CMV 感染能夠降低肝癌的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[44]。在人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染患者中，常常伴隨著HBV 感染，是肝細(xì)胞癌發(fā)生的最重要危險(xiǎn)因素[45]。AGE 與其受體RAGE 結(jié)合能增加氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，這共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[46]。此外，AGEs-RAGE 信號(hào)通路通過對(duì)細(xì)胞凋亡的負(fù)反饋調(diào)節(jié)和對(duì)自噬、壞死性凋亡等促生存機(jī)制介導(dǎo)的DAMPs 釋放來促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[47]。HIF-1 是在缺氧癌細(xì)胞中代謝重編程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，癌細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下發(fā)生代謝重編程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活與增殖[48]。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，白藜蘆醇與核心靶點(diǎn)（TNF、MMP9、EGFR、Bcl-2、CXCR4、HSP90AA1、HSP90AB1、PTGS2、KDR、ESR1）具有良好的對(duì)接活性，這表明白藜蘆醇可能是通過作用于TNF、BCL2、CXCR4、EGFR 等核心靶點(diǎn)來調(diào)節(jié)AGERAGEs 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、趨化因子通路等多條信號(hào)通路來發(fā)揮治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的作用。

綜上，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接的方式，預(yù)測(cè)了白藜蘆醇治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌多靶點(diǎn)、多通路的機(jī)制，總結(jié)出白藜蘆醇可能通過TNF、BCL2、CXCR4、EGFR 等多個(gè)靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)AGERAGE 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路、趨化因子通路等多條信號(hào)通路，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡等來發(fā)揮治療乙型病毒性肝炎相關(guān)性肝癌的作用。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突