依比布拉·阿那亞提,阿依努爾·亞森,羅永明,團(tuán) 勇,玉山江*,齊·阿拉達(dá)爾*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,烏魯木齊 830000; 2. 新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所, 烏魯木齊830000; 3. 伊犁州畜牧科學(xué)研究所, 新疆 伊寧 835000)

人工授精(artificial insemination, AI)在馬的繁育中發(fā)揮著越來越重要的作用,在全球范圍內(nèi)都在逐步普及,但也存在精子保存和運(yùn)輸?shù)碾y題。馬冷凍精液的應(yīng)用范圍比較窄,這是因?yàn)榉N公馬的選擇是基于馬匹運(yùn)動(dòng)特性和競賽成績,對(duì)繁殖性能考慮得比較少,導(dǎo)致馬精子承受溫度變化的能力比較弱。精液的低溫保存可在一定范圍內(nèi)打破時(shí)間和空間的限制,因此馬精液冷凍技術(shù)的研究及商業(yè)化應(yīng)用呈現(xiàn)增長的趨勢(shì),其中對(duì)稀釋液進(jìn)行優(yōu)化組合是個(gè)重要的方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在伊犁州昭蘇馬場(chǎng)種公馬站,選取12匹6～14歲的種公馬作為試驗(yàn)動(dòng)物,包括4匹英純血馬、1匹阿拉伯馬、3匹速步馬和4匹溫血馬,所有馬匹按照繁殖季節(jié)的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂。

1.2 主要試劑及儀器

?；撬?、谷胱甘肽、維生素C、蛋氨酸、原花青素、甲基甲酰胺等,購自Sigma-Aldrich(上海)貿(mào)易有限公司;葡萄糖、棉籽糖、乳糖、二水合檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、甘油、二甲基亞砜等,均購自上海麥克林生化科技股份有限公司;脫脂奶粉和雞蛋,均為市購;馬精液離心墊,購自德國米尼圖公司。

計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀(minitube sperm vision),購自德國米尼圖公司,由新疆畜牧科學(xué)院畜牧研究所繁殖實(shí)驗(yàn)室提供;精子密度儀,購自法國卡蘇公司;精子灌裝機(jī)(MRS1 Dual v2),購自法國卡蘇公司;馬假陰道,購自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)馬研究中心,由昭蘇馬場(chǎng)種公馬站提供。

1.3 溶液的配制

馬精液基礎(chǔ)稀釋液INRA82的配制:5.0 g葡萄糖、0.3 g棉籽糖、0.3 g乳糖、0.06 g檸檬酸鈉、0.082 g檸檬酸鉀、0.476 g HEPES、10 000 IU青霉素、2.0 mg慶大霉素放入無菌容器中,加入雙蒸水溶解,定容至100 mL,用磁力攪拌器攪拌30 min[8]。

低溫稀釋液的配制:基礎(chǔ)稀釋液50 mL,添加50 mL脫脂奶,充分混勻后分裝,用高壓鍋消毒滅菌。

冷凍稀釋液的配制:取低溫稀釋液90 mL,加5 mL卵黃、5 mL甘油、3 mL甲基甲酰胺和二甲基亞砜的混合液,定容至100 mL。配制好的低溫與冷凍稀釋液需要調(diào)整pH至6.8～7.0,滲透壓為300～330 mOsm/kg。

抗氧化劑工作濃度的確定是根據(jù)文獻(xiàn)資料及實(shí)驗(yàn)室前期研究成果,梯度篩選出效果較好的濃度,然后依據(jù)工作濃度計(jì)算相應(yīng)母液濃度并配制,取相應(yīng)的母液量添加到基礎(chǔ)稀釋液中。

表1 不同抗氧化劑濃度及稀釋液的配制

1.4 精液采集與處理

用活體母馬作臺(tái)畜,清潔馬體并用綁帶將尾巴綁起固定在體側(cè),用馬采精專用假陰道進(jìn)行精液采集。采集到的精液先挑除副性腺凝膠,然后用8～12層濾紙進(jìn)行過濾。過濾后的精液每匹馬取相同的量做混池,每次試驗(yàn)至少選擇4匹種公馬精液做混池。

1.4.1 離心及平衡處理

混池的精液用預(yù)熱的低溫稀釋液按1∶1稀釋,緩慢向離心管底部添加1.0～1.5 mL精液離心緩沖墊,1 500×g離心15 min,棄上清液及管底離心緩沖墊。離心后加入冷凍液,調(diào)整密度至1.0×108/mL,上下混勻后灌裝于0.5 mL細(xì)管,放置在5 ℃平衡柜中平衡150 min。

1.4.2 冷凍及解凍處理

冷凍采用液氮熏蒸法:使用聚苯乙烯泡沫盒,液氮深3 cm,將擺放有細(xì)管的冷凍架放入泡沫盒中,細(xì)管距離液氮面2.5～3.0 cm,熏蒸12 min后投入液氮儲(chǔ)存。解凍:先在46 ℃水中解凍20 s,再在38 ℃水浴鍋中回溫1 min,剪開后的細(xì)管精液保存在2 mL微量無菌離心管中,檢測(cè)精子質(zhì)量指標(biāo)后放置在冰箱冷藏柜(4～5 ℃)中冷藏。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)為評(píng)測(cè)抗氧化劑對(duì)種公馬精液冷凍保存效果的影響,設(shè)置試驗(yàn)組和對(duì)照組。試驗(yàn)組為5個(gè),試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3、試驗(yàn)組4、試驗(yàn)組5的基礎(chǔ)液中分別添加谷胱甘肽(Gsh)、?；撬?Tau)、維生素C、蛋氨酸(Met)、原花青素(Pc),對(duì)照組1不添加抗氧化劑。用試驗(yàn)組和對(duì)照組稀釋液制作的凍精在解凍后分別儲(chǔ)存于4～5 ℃的冰箱中,儲(chǔ)存48 h后測(cè)定馬精子的活力參數(shù)。

(2)進(jìn)一步試驗(yàn)以?；撬釣榛A(chǔ)抗氧化劑,在此基礎(chǔ)上添加其他抗氧化劑,評(píng)估抗氧化劑組合對(duì)凍融后精液質(zhì)量參數(shù)的影響。以添加牛磺酸的組為對(duì)照組2,設(shè)置4個(gè)試驗(yàn)組,試驗(yàn)組6添加?；撬岷凸入赘孰?試驗(yàn)組7添加?；撬岷偷鞍彼?試驗(yàn)組8添加?；撬?、谷胱甘肽與蛋氨酸,試驗(yàn)組9添加谷胱甘肽和蛋氨酸,評(píng)測(cè)抗氧化劑組合添加對(duì)馬精子冷凍保存效果的影響。

(3)在冷凍程序的不同時(shí)間添加抗氧化劑,評(píng)測(cè)抗氧化劑不同添加時(shí)間對(duì)馬精子冷凍保存效果的影響。以?；撬釣榭寡趸瘎?設(shè)置3個(gè)試驗(yàn)組,試驗(yàn)組10(離心前)在鮮精稀釋液和冷凍稀釋液中均添加抗氧化劑;試驗(yàn)組11(冷凍前)在冷凍液中添加抗氧化劑;試驗(yàn)組12(冷凍前后)在冷凍稀釋液中添加抗氧化劑,解凍后再次添加抗氧化劑。

精子活力參數(shù)的測(cè)定:細(xì)管凍精解凍后,在室溫穩(wěn)定30 min后測(cè)定;細(xì)管凍精解凍后再次添加抗氧化劑,在室溫下穩(wěn)定30 min后測(cè)定。

1.6 精液質(zhì)量的測(cè)定

精子在母畜生殖道中的存活時(shí)間直接影響母畜受胎率。而冷凍過程會(huì)使精子受到一系列的損傷(如質(zhì)膜損傷等),從而降低精子在母畜體內(nèi)的存活時(shí)間,這也是凍精人工授精效果不如鮮精的原因之一。為更好地評(píng)估冷凍過程對(duì)精子的影響效果,試驗(yàn)將凍融后精子在4～5 ℃保存48 h后,用精子分析儀測(cè)定精子質(zhì)量指標(biāo)。選擇精子活力、運(yùn)動(dòng)速度及直線性三個(gè)方面,活力參數(shù)包括活精子比例(total motility,TM)、前進(jìn)式活力平均值(progressive motility,PM)和快速運(yùn)動(dòng)精子比例(rapid motility,RAP),在運(yùn)動(dòng)速度和直線性方面選擇了精子平均路徑速度(average path velocity,VAP)和直線性(linear,LIN)。

取樣本精液4 μL,滴加在恒溫載物臺(tái)的載玻片上,恒溫載物臺(tái)的溫度保持38 ℃恒溫,置于計(jì)算機(jī)精液輔助分析儀下進(jìn)行精液運(yùn)動(dòng)指標(biāo)的測(cè)定。每個(gè)樣本觀察3～5個(gè)視野,數(shù)據(jù)取平均值。采用米尼圖公司的計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀對(duì)馬精子活力參數(shù)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn):TM即活精子(精子側(cè)擺幅度>4 μm,精子鞭打頻率>4次/s)所占比例;PM即精子頭部曲線運(yùn)動(dòng)速率>35 μm/s,直線運(yùn)動(dòng)速率>15 μm/s的精子所占的比例;RAP即精子頭部曲線運(yùn)動(dòng)速率>120 μm/s的直線運(yùn)動(dòng)精子比例;VAP反映的是精子頭部沿其空間平均軌跡的運(yùn)動(dòng)速度;LIN即精子頭部直線移動(dòng)距離的速度(VSL)與精子頭部沿其實(shí)際行走曲線的運(yùn)動(dòng)速度(VCL)的比值,反映精子運(yùn)動(dòng)曲線的直線分離度。

1.7 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

所有精液運(yùn)動(dòng)參數(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0軟件單因素方差分析(One-Way ANOVA)中 的 Turkey’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較分析,以P<0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗氧化劑對(duì)精子低溫保存效果的影響

不同抗氧化劑對(duì)精子低溫保存效果的影響見表2。由表2可知:添加了不同抗氧劑的馬精子凍融保存48 h后,試驗(yàn)組1的TM顯著低于對(duì)照組1(P<0.05),PM、RAP、VAP及LIN均與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)。說明10 mmol/L 谷胱甘肽并不能提升馬精子凍融后的活力指標(biāo)。與對(duì)照組1相比,試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3、試驗(yàn)組4、試驗(yàn)組5能在不同方面提高凍融后的馬精子質(zhì)量指標(biāo)。RAP是與精子的受胎率密切相關(guān)的精子活力指標(biāo),與對(duì)照組1相比,試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3、試驗(yàn)組4、試驗(yàn)組5的RAP均有顯著提高(P<0.05)。在TM、PM和VAP上,試驗(yàn)組3、試驗(yàn)組4、試驗(yàn)組5都顯著優(yōu)于對(duì)照組(P<0.05)。在人類精子常規(guī)檢測(cè)報(bào)告單中, LIN在0.32以上為正常值。在本試驗(yàn)中各組間LIN差異不顯著(P>0.05),但所有試驗(yàn)組數(shù)值均高于對(duì)照組,這也表明?；撬?、維生素C、蛋氨酸和原花青素等抗氧化劑的添加有助于精子形態(tài)和功能的維持。

表2 添加抗氧化劑后的馬精子凍融低溫保存效果(48 h)

2.2 抗氧化劑組合對(duì)精子低溫保存效果的影響

以添加?；撬釣閷?duì)照組2,試驗(yàn)組6為牛磺酸+谷胱甘肽,試驗(yàn)組7為?；撬?蛋氨酸,試驗(yàn)組8為?；撬?谷胱甘肽+蛋氨酸,試驗(yàn)組9為谷胱甘肽+蛋氨酸,抗氧化劑的添加量不變,比較抗氧化劑組合對(duì)馬精子凍融后保存的質(zhì)量參數(shù),結(jié)果見表3。由表3可知:與對(duì)照2組相比,試驗(yàn)組6、試驗(yàn)組7的TM、PM、RAP、VAP均顯著降低(P<0.05),試驗(yàn)組8的TM、PM 、RAP、VAP均低于對(duì)照組2,其中PM顯著低于對(duì)照組2(P<0.05)。試驗(yàn)中需要關(guān)注的是谷胱甘肽,與甲硫氨酸組合的試驗(yàn)組9表現(xiàn)出了優(yōu)于對(duì)照組的趨勢(shì),這表明谷胱甘肽更適合用于抗氧化劑的搭配組合。各試驗(yàn)組間LIN均差異不顯著(P>0.05),但試驗(yàn)組6、試驗(yàn)組7低于0.32,說明試驗(yàn)組6、試驗(yàn)組7的抗氧化劑組合對(duì)精子存活有毒害作用,也說明加入?；撬岷驮囼?yàn)組6,7,8并沒有表現(xiàn)出組合優(yōu)勢(shì)。

表3 添加抗氧化劑組合后馬精子冷凍保存效果(48 h)

2.3 抗氧化劑添加程序?qū)永鋬霰４嫘Ч挠绊?/h3>

在冷凍程序的不同時(shí)間添加抗氧化劑,可以明確抗氧化劑起作用的時(shí)間,從而優(yōu)化凍精制作程序。不同時(shí)間添加抗氧化劑后馬精子凍融低溫保存效果見表4。由表4可知:冷凍前后兩次添加抗氧化劑的試驗(yàn)組12,其5項(xiàng)評(píng)測(cè)指標(biāo)都顯著低于只在冷凍前添加一次抗氧化劑的試驗(yàn)組10、試驗(yàn)組11(P<0.05),其中能反映精子授精能力的快速運(yùn)動(dòng)精子比例的RAP數(shù)值降了一半還多,說明兩次添加抗氧化劑不利于精子存活。在離心前添加抗氧化劑的試驗(yàn)組10、冷凍前添加抗氧化劑的試驗(yàn)組11比較,發(fā)現(xiàn)兩者PM、RAP和VAP無顯著差異(P>0.05),但TM、LIN差異顯著(P<0.05),其中LIN差異比較大,說明離心前添加抗氧化劑對(duì)于精子形態(tài)和功能的維持有益,也證明了冷凍程序中在鮮精稀釋液中添加抗氧化劑是有益的。

表4 不同時(shí)間添加抗氧化劑后馬精子凍融低溫保存效果

3 討 論

馬精子主要是依靠氧化磷酸化(oxidative phosphorylation, OXPHOS),而不是糖酵解產(chǎn)生能量。這種情況下,精子線粒體的活性更高,容易產(chǎn)生更多的ROS[9];同時(shí),白細(xì)胞的免疫抗炎機(jī)制也是馬精液中ROS產(chǎn)生的主要來源之一;另外,精液中死亡精子比例增加也會(huì)導(dǎo)致ROS增多。正常條件下,精子和精漿中的抗氧化系統(tǒng)能保護(hù)精子免受ROS的有害影響。但在凍精制作過程中,為了避免精漿蛋白在體外使精子過早獲能,大部分馬精漿在精液離心后被丟棄,精漿中的抗氧化酶也一并被消除了,從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。過多的ROS帶來的危害有:脂質(zhì)過氧化、DNA斷裂、蛋白質(zhì)氧化、線粒體功能障礙等[1]。為減輕ROS對(duì)精子凍后質(zhì)量所帶來的不利影響,需要添加抗氧化劑來平衡ROS的產(chǎn)生,建立抗氧化防御系統(tǒng)。

谷胱甘肽作為一種抗氧化劑,在豬、牛、羊、兔的精液稀釋液中都有應(yīng)用,可以顯著改善精液稀釋液的抗氧化特性,能通過保持精子頂體和質(zhì)膜完整性來維持精液質(zhì)量,從而提高精子在凍融過程中的受精能力[10]。谷胱甘肽是一種三肽,由氨基酸L-半胱氨酸、L-谷氨酰胺和甘氨酸組成。半胱氨酸含有巰基或硫醇基。硫醇基團(tuán)是強(qiáng)還原劑,谷胱甘肽作為電子供體的特性可減少H2O2的產(chǎn)生,并催化谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)氧化形成谷胱甘肽二硫鍵[11]。通過研究發(fā)現(xiàn),馬精子可能利用外源半胱氨酸調(diào)節(jié)谷胱甘肽[12-13],即說明種公馬精子可以生成谷胱甘肽。此外,半胱氨酸的巰基可穿透精子的質(zhì)膜,增加谷胱甘肽的細(xì)胞內(nèi)生物合成,從而通過清除ROS保護(hù)精子的DNA、蛋白質(zhì)及膜脂含量[10]。與其他動(dòng)物相比,馬精子中谷胱甘肽平均濃度為(8.2±2.1)μmol/L[12],遠(yuǎn)高于其他哺乳動(dòng)物。阿娜爾等[14]報(bào)道,5.0 mg/mL谷胱甘肽組蒙古馬精液凍融后的PM和頂體完整率(AI)顯著提升,但TM和質(zhì)膜完整率(MI)僅略提升; 5.0 mg/mL谷胱甘肽組精液中抗氧化指標(biāo)GSH-Px和谷胱甘肽還原酶(GR)活性顯著高于其他試驗(yàn)組,同時(shí)表現(xiàn)出大劑量的谷胱甘肽可以導(dǎo)致GSH-Px和GR活性降低。Baumber等[15]將10 mmol/L(3.07 mg/L)谷胱甘肽添加到馬精液中,發(fā)現(xiàn)對(duì)精液的TM和PM沒有改善作用。本研究中,谷胱甘肽對(duì)馬精子活力參數(shù)沒有改善提升作用,這一結(jié)果與Baumber等[15]的試驗(yàn)結(jié)果相似,但不支持阿娜爾等[14]的結(jié)論。這可能是由于谷胱甘肽添加量不同和測(cè)定精子活力指標(biāo)的時(shí)間不同導(dǎo)致。

?；撬崾且环N含硫的氨基酸,可以促進(jìn)牛、豬、兔等物種胚胎的體外發(fā)育[16]。作為一種抗氧化劑,主要通過參與清除自由基、維持生物膜穩(wěn)定性、抑制ROS產(chǎn)生酶類等方面發(fā)揮作用。在豬精液保存中的應(yīng)用研究證明,?；撬峥商岣呔涌偪寡趸芰?降低丙二醛濃度,從而達(dá)到提高精液活力參數(shù)的目的[17]。?；撬徇€被應(yīng)用于牛、羊、狗和魚的精液冷凍中,能改善提高精子活力指標(biāo)[18]。Lone等[19]指出,小鼠精漿40 mmol/L牛磺酸組公羊的精子質(zhì)量顯著提高,丙二醛含量顯著低于對(duì)照組,說明?；撬峥勺鳛橐环N有效的抗氧化劑用于公羊精液的冷凍保存。徐文慧等[10]報(bào)道,25 mmol/L?；撬崽幚韺?duì)種公馬精液的TM和PM提升不顯著,但RAP顯著高于對(duì)照組。本試驗(yàn)結(jié)果與徐文慧等[10]的結(jié)果相似,與對(duì)照組相比,添加?；撬岬脑囼?yàn)組2的TM和PM沒有顯著提升,但RAP和LIN有顯著提高,說明牛磺酸對(duì)維護(hù)馬精子授精能力和功能完整性有幫助。

維生素C是一種非酶類的抗氧化劑,作為水溶性的維生素,它主要搭配在動(dòng)物日糧中,具有明顯的清除ROS的能力[1]。以人類精液為例,維生素C在精漿中的濃度是血清的10倍[1]。這種高濃度表明其在保護(hù)DNA完整性方面具有重要作用,飲食中增加維生素C攝入與精漿中濃度升高相關(guān)。此外,維生素C具有中和特定自由基如羥基、超氧化物和H2O2的能力,可防止內(nèi)源性氧化損傷[1]。Rakha等[20]報(bào)道,在冷凍過程中添加2.0 mmol/L維生素C可以使凍融后的印度紅禽精子活力、質(zhì)膜和頂體完整性均顯著提高。Sampaio等[21]報(bào)道,維生素C和維生素E單獨(dú)使用并不能提高馬精液的活力參數(shù),但可以降低精液中MDA含量,二者混合使用可以顯著提高冷藏馬精子(5 ℃)的運(yùn)動(dòng)能力。徐文慧等[10]研究發(fā)現(xiàn),添加維生素C能夠顯著改善精液低溫保存后的活力,但對(duì)凍融后精液運(yùn)動(dòng)能力、質(zhì)膜完整性、線粒體膜電勢(shì)及頂體完整性均無顯著影響。本試驗(yàn)中,添加維生素C的試驗(yàn)組3 PM、TM、VAP、RAP均顯著提高。此外,對(duì)幾種抗氧化劑進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組3的VAP值較高,僅次于試驗(yàn)組5,說明維生素C對(duì)于精子活力有促進(jìn)作用。本研究結(jié)果與徐文慧等[10]的報(bào)道略有不同,這可能是由于試驗(yàn)所用的精子分析儀對(duì)于PM、TM和RAP的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)和凍融后精子活力指標(biāo)測(cè)定時(shí)間不同導(dǎo)致的。

蛋氨酸是谷胱甘肽的前體氨基酸之一,可以通過促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的形成而發(fā)揮抗氧化作用, Coyan等[22]報(bào)道,1 mmol/L蛋氨酸組山羊精液低溫保存后的精子活力顯著高于對(duì)照組。Bucak等[23]報(bào)道,在5 ℃低溫保存條件下,添加2,4 mmol/L蛋氨酸的稀釋液可使羊精液保存(5 ℃)至96 h,精子存活率和精子線粒體活性百分比均顯著高于對(duì)照組。Toker等[24]報(bào)道,在羊精液冷凍過程中,2.5,5.0 mmol/L蛋氨酸組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于對(duì)照組。徐文慧等[10]報(bào)道,2.5 mmol/L蛋氨酸組的馬精子凍融后活力指標(biāo)沒有明顯提高,但馬精子的線粒體膜電勢(shì)顯著提高,質(zhì)膜完整性也有提高。說明蛋氨酸對(duì)質(zhì)膜完整性、線粒體起到了保護(hù)作用。本試驗(yàn)中,添加蛋氨酸的試驗(yàn)組4 TM、PM、RAP及VAP顯著高于對(duì)照組,但LIN提升不顯著。

原花青素是一種天然多酚,廣泛存在于自然界,具有保護(hù)細(xì)胞免受H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的作用,并具有抑制細(xì)胞凋亡、抗癌、抗衰老、抗氧化等多種生物活性[25]。在精液抗氧化方面,Wang等[26]報(bào)道,添加50 mg/L OPC能提高冷凍精子的質(zhì)量,與2 mg/L 竹葉黃酮聯(lián)合使用顯著提高了精子的運(yùn)動(dòng)能力,提高了精子過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的水平,降低了精子的MDA濃度。Li等[27]報(bào)道,在17 ℃保存條件下,50 μg/mL OPC組關(guān)中黑豬精液的精子活力、頂體完整性、膜完整性和線粒體膜電位顯著提高,同時(shí)試驗(yàn)組的MDA和ROS含量降低。在本試驗(yàn)中,原花青素處理的試驗(yàn)組5 TM、PM、RAP、VAP和LIN都顯著優(yōu)于對(duì)照組,其中RAP和LIN還優(yōu)于其他試驗(yàn)組,說明原花青素(OPS)的添加對(duì)馬精子在凍融過程中維持授精能力和頂體完整率有保護(hù)作用。

氧化應(yīng)激可以損害精子質(zhì)膜、DNA結(jié)構(gòu)等,添加或補(bǔ)充抗氧化劑可以抵抗細(xì)胞損傷,這一做法已經(jīng)得到了廣泛的認(rèn)可。但研究表明,過量加入抗氧化劑可能會(huì)破壞氧化和還原之間的平衡,導(dǎo)致一種還原性壓力狀態(tài)[28]。Halliwell等[29]提出的一個(gè)術(shù)語“抗氧化悖論”,強(qiáng)調(diào)了過度使用抗氧化劑的潛在負(fù)面影響。稀釋液中抗氧化劑添加的目的應(yīng)該是建立精子生存小環(huán)境內(nèi)的氧化還原平衡,不同的抗氧化劑發(fā)揮作用的方式和途徑是不一樣的,因此依據(jù)種公馬精子產(chǎn)生活性氧的特點(diǎn),將不同的抗氧化劑進(jìn)行組合添加,這將有助于建立更完善、平衡的氧化還原小環(huán)境。Olfati等[30]報(bào)道,在種公牛稀釋液中組合添加谷胱甘肽和超氧化物歧化酶,與對(duì)照組相比,降低了MDA含量,改善了精液解凍后的品質(zhì)。Nogueira等[31]測(cè)試了抗氧化劑輔酶Q10 (CoQ10)和褪黑激素單獨(dú)和聯(lián)合應(yīng)用對(duì)馬精液凍融后精子質(zhì)量的影響,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比,單獨(dú)或聯(lián)合使用抗氧化劑在任何時(shí)候都降低了脂質(zhì)過氧化水平,但單獨(dú)處理組和聯(lián)合處理組之間無顯著差異。Kumar等[32]在種公驢精液冷凍的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)添加谷胱甘肽和維生素C相比,組合添加(0.9 g/L維生素C+2.5 mmol/L 谷胱甘肽)組的質(zhì)膜、頂體完整性和染色質(zhì)完整性均顯著提高。本試驗(yàn)中,以?；撬釣榛A(chǔ)抗氧化劑,組合搭配其他抗氧化劑的3個(gè)試驗(yàn)組,精液的活力參數(shù)多數(shù)低于對(duì)照組,說明?；撬岵贿m合組合其他抗氧化劑。谷胱甘肽與蛋氨酸搭配的組合,精液活力參數(shù)與對(duì)照組相比無顯著差異,但在數(shù)值上表現(xiàn)出了優(yōu)于對(duì)照組的趨勢(shì)。另外,試驗(yàn)組7,9同樣是搭配蛋氨酸組成抗氧化劑組合,谷胱甘肽+蛋氨酸組合顯著優(yōu)于牛磺酸+蛋氨酸組合,說明谷胱甘肽更適合與其他抗氧化劑搭配,更有助于氧化還原穩(wěn)態(tài)的建立。

馬精液在冷凍處理過程中,由于溫度和所處環(huán)境的變化,容易受到氧化機(jī)制不平衡而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。Castro等[33]發(fā)現(xiàn),馬精子在冰凍溫度下時(shí),ROS水平會(huì)顯著增加,這是因?yàn)榧?xì)胞中可用的抗氧化酶不足以維持氧化平衡。這是由于精液在冷凍預(yù)處理過程中,精子細(xì)胞質(zhì)的體積減少,其中含有的少量抗氧化酶不足以抵消ROS顯著增加而產(chǎn)生的不良影響。Burnaugh等[34]報(bào)道,當(dāng)種公馬精子暴露于低滲或高滲環(huán)境時(shí)(解凍或者冷凍初始),會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子。大多數(shù)的研究都在強(qiáng)調(diào)冷凍前后ROS水平會(huì)增加,那么在冷凍程序的不同時(shí)間添加抗氧化劑是否會(huì)影響到種公馬精液凍融后的活力參數(shù)呢?Contreras等[35]報(bào)道,在馬精液在冷凍前后二次添加抗氧化劑的錳卟啉(MnTBAP)處理組和n-乙酰半胱氨酸(NAC)處理組,兩個(gè)組精子活力都有明顯下降,其中NAC處理組精子活力顯著下降,表明二次添加抗氧化劑對(duì)馬精子保存有毒害作用。在本試驗(yàn)中,離心前和冷凍前添加抗氧化劑在精子活力參數(shù)上明顯優(yōu)于冷凍前后二次添加,其中RAP數(shù)值降了一半還多,說明二次添加抗氧化劑不僅不利于氧化還原平衡,而且可能對(duì)精子有毒害作用。這一結(jié)果與Contreras等[36]的試驗(yàn)結(jié)論一致。

4 結(jié) 論

低溫保存種公馬精液時(shí)添加抗氧化劑維生素C、牛磺酸、蛋氨酸及原花青素可以提高凍融后精子的活力參數(shù);?；撬崤c其他抗氧化劑的搭配組合對(duì)凍融后精子活力提升沒有幫助;馬精子冷凍前后兩次添加抗氧化劑可能對(duì)精子有損害。