蔣 尊, 安紅艷, 孫創(chuàng)奇, 葛佳儀, 梁 倩, 鮮思美,2

(1. 貴州大學動物科學學院,貴州 貴陽 550025;2. 貴州省動物疫病研究所,貴州 貴陽 550025)

羊口瘡又稱羊傳染性膿皰(Contagious ecthyma,CE),是由羊口瘡病毒(Orfvirus,ORFV)引起的急性、嗜上皮性、高度接觸性人獸共患傳染病,主要感染山羊和綿羊, 臨床主要表現(xiàn)為增生性炎癥,舌、鼻、口、唇等部位出現(xiàn)水皰、膿皰、丘疹、結痂[1～4]。該病發(fā)病率高,病死率低,分布廣泛,給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴重經(jīng)濟損失,同時也威脅人類健康。 ORFV是痘病毒科、副痘病毒屬的線性雙鏈DNA病毒,基因組全長134～139 kb,高度保守基因88個,大部分可變區(qū)位于基因組末端,中央核心區(qū)基因相對保守[5]。F1L基因位于病毒基因組的中央高度保守區(qū),編碼大小約39 ku的F1L蛋白;F1L蛋白為單克隆抗體的主要結合位點,可誘導機體產(chǎn)生中和抗體,具有肝素受體結合活性,可促進動物細胞膜與病毒外膜的融合,與病毒的吸附、成熟及發(fā)病機理相關[6]。本研究以ORFV-DZ分離株基因組為模板,擴增其F1L基因,構建真核表達載體,為羊口瘡病毒的致病機理研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

病毒基因組DNA提取試劑盒(購自TIANGEN公司),EcoR Ⅰ、XhoⅠ 限制性內切酶(購自TaKaRa公司),質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒(購自上海生工生物工程股份有限公司),PCR Master Mix (2×)、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、PageRuler Prestained Protein Ladder(購自Thermo Fisher公司),NeofectTMDNA transfection reagent(購自北京碼因科技有限公司),RIPA高效組織細胞裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑(購自Solarbio公司),pEGFP-N1質粒、ORFV-DZ毒株、HEK-293t(人胚腎細胞)、F1L-B2L融合蛋白多抗(由貴州大學預防獸醫(yī)學實驗室提供)。

1.2 主要儀器

PCR儀(型號:9902,Applied Biosystems公司)、核酸電泳儀(型號:BG-POWER 300,BAYGENE公司)、凝膠成像儀(型號:SYDDR4/2752,SYNGENE公司)、倒置熒光顯微鏡(型號:IX73,OLYMPUS公司)。

1.3 引物的設計與合成

以GenBank中ORFV標準株(登錄號:HQ197753.1)的F1L基因為參考序列,使用Oligo 7.0軟件設計1對用于F1L基因的特異引物。F1L-F:5’-CCCTCGAGATGGATCCACCCGAAATCAC-3’(下劃線為XhoⅠ酶切位點);F1L-R:5’-CGGAATTCGCACAATGGCCGTGAC-3’(下劃線為EcoRⅠ酶切位點),Tm值59 ℃,預擴增片段1 029 bp。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.4 F1L基因的PCR擴增

按照病毒基因組DNA提取試劑盒說明書方法提取ORFV-DZ病毒總DNA,以此為模板進行F1L基因PCR擴增(高保真PCR)。PCR體系20 μL:ddH2O 6 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,2×TaqPCR Master Mix 10 μL,DNA模板2 μL。擴增程序:98 ℃ 10 s;59 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,35個循環(huán);72 ℃ 10 min 。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳,按膠回收試劑盒說明書方法純化回收。

1.5 F1L基因的克隆及篩選

以內切酶XhoⅠ、EcoRⅠ分別雙酶切pEGFP-N1質粒(攜帶熒光標簽)、純化PCR產(chǎn)物。酶切體系30 μL:XhoⅠ、EcoRⅠ各2 μL,10×K Buffer 3 μL,pEGFP-N1 10 μL(純化的PCR擴增產(chǎn)物 12 μL),ddH2O 13 μL(ddH2O 11 μL),37 ℃酶切3 h。純化酶切產(chǎn)物16 ℃連接過夜,連接體系10 μL:酶切pEGFP-N1 1 μL,酶切PCR產(chǎn)物4 μL,SolutionⅠ5 μL。連接產(chǎn)物轉化至DH5α感受態(tài)細胞,轉化方法:感受態(tài)細胞(DH5α)50 μL與連接產(chǎn)物10 μL混勻,冰浴30 min,42 ℃熱擊90 s,冰浴1 min,加入LB液體培養(yǎng)基800 μL,37 ℃振蕩培養(yǎng)40～60 min,8 000 r/min離心2 min,留上清液200 μL,涂布于含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基,37 ℃過夜培養(yǎng),隨機挑取3個單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基(5 mL),37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,PCR、雙酶切篩選陽性重組質粒,送上海生物工程有限公司測序。

1.6 pEGFP-F1L重組質粒的表達

將HEK-293t細胞接種于6孔板中,細胞融合度達80%左右時按照Neofect轉染試劑說明書方法,將pEGFP-F1L重組質粒轉染至HEK-293t細胞。設置HEK-293t細胞、pEGFP-N1質粒為對照。轉染24 h于倒置熒光顯微鏡下觀察。以蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)冰浴裂解30 min,12 000 r/min,4 ℃離心后收集蛋白上清,Western blotting檢測融合蛋白的特異表達。

2 結果與分析

2.1 F1L基因PCR

由圖1可見:PCR產(chǎn)物長度為1 029 bp,與預期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1～2:F1L基因

2.2 pEGFP-F1L重組質粒

由圖2、圖3可見:EcoRⅠ、XhoⅠ雙酶切PCR陽性質粒產(chǎn)生2個條帶,分別為4 723 bp的線性pEGFP-N1、1 029 bp的F1L基因條帶,與預期相符。

M:DL 2 000 DNA Marker;1～2:F1L基因雙酶切產(chǎn)物;3:pEGFP-N1空載體雙酶切產(chǎn)物

M:DL 5 000 DNA Marker;1～3:重組質粒pEGFP-F1L雙酶切產(chǎn)物

2.3 pEGFP-F1L的細胞轉染及表達

由圖4可見:pEGFP-N1對照組和pEGFP-F1L轉染組可觀察到大量綠色熒光斑,而HEK-293t對照組未見熒光。由圖5可見:Western Blotting檢測到pEGFP-F1L轉染組于約65 ku處有1條蛋白條帶,與預期相符。

A:HEK-293t對照組;B:pEGFP-N1對照組;C:pEGFP-F1L重組質粒轉染組

M:PageRuler Prestained Protein Ladder;1:HEK-293t對照組;2:pEGFP-F1L轉染組;3:pEGFP-N1對照組

3 結論

試驗構建了真核表達質粒pEGFP-F1L,并成功在HEK-293t細胞中表達。

4 討論

目前市場上對于ORFV亞單位疫苗的開發(fā)大多針對已知的F1L篩管蛋白和B2L囊膜蛋白2種保護性抗原蛋白。其中F1L蛋白參與組成病毒表面微管,可作為抗原蛋白激發(fā)機體免疫應答,誘導產(chǎn)生中和抗體,介導機體的細胞免疫和體液免疫[7],具有較大的疫苗開發(fā)潛力。F1L蛋白具有肝素結合活性,能結合宿主細胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)受體,推測可能參與病毒的吸附、侵入過程[8]。另一方面,F1L基因可通過影響宿主的PI3K-AKt信號通路[9～11],促進ORFV在宿主細胞中的復制增殖,但F1L蛋白是否能直接影響病毒的增殖和復制還需要進一步探究。F1L蛋白雖然是ORFV的獨有蛋白,但其他病毒可能存在類似作用的蛋白,比如通過調控宿主細胞周期促進病毒復制,這一假設也需要進一步驗證。