張 霞, 王 慧, 張人俊, 劉顯明, 張中義, 劉妍罕, 楊 穎, 溫貴蘭, 文 明

(1. 貴州省動物疫病預防控制中心,貴州 貴陽 550008;2. 威寧自治縣動物疫病預防控制中心,貴州 威寧 553100;3. 羅甸縣養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中心,貴州 羅甸 550100;4. 貴州大學動物疫病研究所,貴州 貴陽 550025)

貴州省是我國生態(tài)環(huán)境較好的省份之一,林下生態(tài)家禽養(yǎng)殖是全省畜牧產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向。林下生態(tài)養(yǎng)殖家禽容易接觸到野生動物,而這些野生動物是自然界中病毒、細菌和寄生蟲等病原的天然宿主,容易傳染林下養(yǎng)殖的家禽,使家禽感染發(fā)病而造成經(jīng)濟損失。本研究于2019年9月1日至2022年8月30日在貴州省具有區(qū)域代表性的畢節(jié)市威寧自治縣和黔南自治州羅甸縣開展林下生態(tài)養(yǎng)雞場環(huán)境野生動物及其腸道微生物群落調(diào)查,以期為林下生態(tài)養(yǎng)雞場的疫病防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品

野生動物采自威寧自治縣和羅甸縣2個具有區(qū)域代表性的生態(tài)養(yǎng)雞場周圍環(huán)境,采用頸椎錯位法處死后采集腸道樣品,于8 ℃左右保溫箱中保存并及時送至貴州大學動物疫病研究所,置于 -83 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

細菌基因組DNA提取試劑盒、SanPrep-DNA凝膠提取試劑盒、QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit、QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit、SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase Kit、Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(96 Samples),均購自Sangon Biotech公司。

1.3 主要儀器

臺式高速離心機(型號:Centrifuge 5418R,德國Eppendorf公司)、PCR儀(型號:MyCycler,美國Bio-Rad公司)、QIAxtractor(型號:SN002358,德國QIAGEN公司)、NanoDrop(型號:L200,美國Thermo Fisher公司)、Bioanalyzer(型號:L2100,美國Aglient公司)、酶標檢測儀(型號:Epoch,美國BioTeK公司)、Illumina PE 150測序平臺(型號:Miniseq,美國Illumina公司)。

1.4 野生動物種類調(diào)查

1.4.1 鳥類調(diào)查

根據(jù)養(yǎng)雞場周圍環(huán)境情況和鳥類生活習性,采用樣線法和網(wǎng)捕法相結(jié)合,每個養(yǎng)雞場選擇2條樣線,每條樣線長約3 km,每條樣線每季度觀察1次和設(shè)立網(wǎng)捕1次,調(diào)查期1年。觀察時選擇晴朗天氣,時間分別為7:00～10:00、15:00～17:00,使用Bushnell 8×42倍望遠鏡和Cannon數(shù)碼照相機以約1.0 km/h 速度沿樣線活動,觀察和拍照樣線兩側(cè)50 m 內(nèi)的鳥類。網(wǎng)捕時選擇大小10 m×2.6 m、網(wǎng)孔2 cm的霧網(wǎng),每個養(yǎng)雞場設(shè)置22張霧網(wǎng),各季節(jié)位置相對固定,張網(wǎng)時網(wǎng)長軸方向隨地勢而定,網(wǎng)面與地面垂直,網(wǎng)下緣與地面距離不超過10 cm,每個季節(jié)張網(wǎng)5 d,每天早、晚各觀察1次,收集捕獲鳥。健康鳥采集泄殖腔樣品并記錄相關(guān)信息后放飛,瀕死或死亡鳥鑒定其種類并收集其腸道內(nèi)容物于 -83 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹1]。

1.4.2 鼠類調(diào)查

在養(yǎng)雞場周圍環(huán)境1 km范圍內(nèi),采用夾板法(7 cm×17 cm木夾板),每30 m2左右設(shè)置1個木板夾?；ㄉ鬃稣T餌,晚放早收。每季度調(diào)查1次,每次調(diào)查5 d,調(diào)查期1年。對捕獲的鼠類標本進行編號和屬種鑒定,并收集其腸道內(nèi)容物于 -83 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 兔類調(diào)查

以養(yǎng)雞場為中心,向東西南北4個方向設(shè)置調(diào)查樣帶,沿樣帶兩側(cè)仔細搜索和觀察兔類的足跡、糞便、啃食痕跡、洞穴等情況,采用籠網(wǎng)法捕獲野兔。每季度調(diào)查1次,每次5 d,調(diào)查期1年。對捕捉的野兔進行種類鑒定后處死并收集腸道內(nèi)容物于-83 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 野生動物腸道細菌群落調(diào)查

采用16S rRNA基因測序方法[2]:取保存的野鳥、野鼠、野兔腸道內(nèi)容物樣品,用細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌總DNA,以通用引物(343F-5’-TACGGRAGGCAGCAG-3’;798R-5’-AGGGTATCTAATCCT-3’)擴增細菌16S rRNA,SanPrep-DNA凝膠提取試劑盒分離純化并測定含量后,以TruSeq DNA試劑盒制備測序文庫,送至Illumina公司使用Illumina Miseq測序儀進行高通量測序,使用Uparse(7.0.1090)軟件分析細菌群落結(jié)構(gòu)。

1.6 野生動物腸道病毒群落調(diào)查

采用病毒宏基因組學方法[3]:取保存的野鳥、野鼠、野兔腸道內(nèi)容物樣品,分別加入de DPBS 500 mL,反復劇烈振蕩3次后低溫超速離心(3 000 r/min,10 min),收集上清液,核酸酶充分消化后,用QIAamp Viral MinElute Virus Spin Kit提取病毒核酸,再用SuperScript Ⅲ Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,用Nextera XT DNA Sample Preparation Kit(96 Samples)構(gòu)建cDNA文庫,再進行cDNA文庫擴增、純化和文庫片段篩選,取符合條件的樣品送至 Illumina 公司進行高通量測序,使用Ventoy軟件(v1.0.94)進行解讀和數(shù)據(jù)處理,分析腸道病毒群落結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生動物種類

2個養(yǎng)雞場環(huán)境觀察或捕捉的野生動物包括鳥類、鼠類、兔類共計1 778只(見表1)。其中:鳥類1 388 只,隸屬1目6科,包括雀形目雀科1個種63只、梅花雀科1個種237只、畫眉科3個種824只、鵯科2個種152只、鴉雀科1個種39只、鶇科1個種73只;鼠類365只,隸屬嚙齒目鼠科;兔類25只,隸屬兔形目兔科。優(yōu)勢野生鳥類主要是灰眶雀鹛、白腰文鳥、栗耳鳳鹛、紅頭穗鹛,野生鼠類主要是黑線姬鼠,野生兔類僅發(fā)現(xiàn)華南兔。

2.2 野生動物腸道細菌群落

由表2可見:2個養(yǎng)雞場環(huán)境中的野生動物腸道細菌群落有一定相似性,在門水平主要是擬桿菌門、厚壁菌門、變形桿菌門,在綱水平主要是擬桿菌綱、梭狀芽孢桿菌綱、γ變形桿菌綱,在目水平主要是擬桿菌目、腸桿菌目、梭菌目,在科水平主要是擬桿菌科、腸桿菌科、毛螺菌科,在屬水平主要是擬桿菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬。這些環(huán)境野生動物腸道攜帶的細菌有可能污染林下生態(tài)養(yǎng)雞場,導致雞群感染發(fā)病。

2.3 野生動物腸道病毒群落

由表3可見:野鳥、野鼠、野兔腸道病毒種類均呈多樣性,其中:野鳥腸道病毒群落主要是二順反子病毒科、傳染性軟腐病病毒科、細小病毒科等,且存在與其食物習性有關(guān)的病毒,如魚皰疹病毒科;野鼠腸道病毒群落主要是細小病毒科、乳頭瘤病毒科、二順反子病毒科等;野兔腸道病毒群落主要是二順反子病毒科、細小病毒科、乳頭瘤病毒科等。在這些野生動物腸道存在能夠感染家禽的多種病毒,如細小病毒、冠狀病毒、圓環(huán)病毒、皰疹病毒、痘病毒、腺病毒等。可作為林下生態(tài)養(yǎng)殖家禽病毒性疾病的重點診斷、預防和控制對象。

3 討論

3.1森林植被特征影響野生動物種類組成與結(jié)構(gòu)特征。良好的森林生態(tài)系統(tǒng)為生活的野生動物,如野鳥、野鼠、野兔等提供了豐富的營養(yǎng)基質(zhì)。本次在林下生態(tài)養(yǎng)雞場周圍環(huán)境觀察和捕獲的野生動物中以野鳥最多,其中食蟲鳥種類占捕獲總數(shù)的70%以上。在威寧和羅甸2個林下生態(tài)養(yǎng)雞場周圍發(fā)現(xiàn)花果植物有一定量的分布,但食花果鳥類的捕獲率并不高,原因可能與霧網(wǎng)的高度限制了對林冠層鳥類的捕獲有關(guān)。在林下生態(tài)養(yǎng)雞場環(huán)境捕獲的野生鼠類中,僅有1目(嚙齒目)1科(鼠科)4種(黑線姬鼠、黃胸鼠、褐家鼠、小家鼠),其中以黑線姬鼠為優(yōu)勢種,占捕獲總數(shù)的45.88%,其次是黃胸鼠、褐家鼠、小家鼠,分別占24.45%、21.15%、8.79%,可能是由于貴州省氣候條件、地形地貌、植被種類、生態(tài)景觀的復雜多樣性決定。本次捕獲的野生兔類只有兔形目兔科華南兔1個種,捕獲數(shù)量較少,未能體現(xiàn)生態(tài)養(yǎng)雞場周圍野生兔類群落分布特征。

3.2本次調(diào)查發(fā)現(xiàn),野生鳥類腸道微生物種類繁多,主要包括變形菌、厚壁菌、擬桿菌、放線菌等,對于寄主鳥類的營養(yǎng)吸收、免疫、毒素降解和體溫調(diào)節(jié)方面具有重要功能。如:植食性鳥類腸道微生物以擬桿菌和厚壁菌為主,同時常存在一些與免疫和解毒有關(guān)的共生菌。野生鼠類和野生兔類均屬哺乳動物,雖在同一環(huán)境內(nèi),但腸道菌群的組成在門、屬和OTU(操作分類單元)水平均有差異,這可能是由于二者屬于不同物種,且食物結(jié)構(gòu)和生活環(huán)境不同所致:野生鼠類主要棲息于地下,以植物根、皮、莖、葉、果實、種子為食,而野生兔類主要棲息在地上,以植物葉莖、花、根、芽為食,較少攝入種子?？梢娨吧鷦游锓N類、飲食及生活環(huán)境差異可能導致其腸道菌群組成也有差異。

3.3林下生態(tài)養(yǎng)雞場環(huán)境野生動物腸道病毒群落也存在不同程度的差異。野生鳥類腸道病毒群落主要涉及16科,包括二順反子病毒科、傳染性軟腐病病毒科、細小病毒科、未分類RNA病毒等;野生鼠類腸道病毒群落主要涉及27科,包括細小病毒科、乳頭瘤病毒科、二順反子病毒科、未分類病毒等;野生兔類腸道病毒群落主要涉及19科,包括二順反子病毒科、細小病毒科、乳頭瘤病毒科、未分類病毒等。野生鳥類以無脊柱動物病毒來源為主,而野生鼠類和野生兔類以脊柱動物病毒來源為主,推測這些不同種類野生動物腸道病毒群落分布與其生活環(huán)境和進食習慣也有密切關(guān)聯(lián),即野生鳥類喜群居,在池塘、湖邊以進食魚、蝦、蟹為食,導致腸道病毒群落以水生動物病毒為主,而野生鼠類和兔類在棲息地與其他陸生動物存在密切接觸,導致腸道病毒群落以陸生動物病毒為主。

4 結(jié)論

本次調(diào)查研究表明,貴州林下生態(tài)養(yǎng)雞環(huán)境的野生動物主要是野鳥(灰眶雀鹛、白腰文鳥、栗耳鳳鹛、紅頭穗鹛)、野鼠(黑線姬鼠)、野兔(華南兔);其腸道細菌群落主要是擬桿菌屬、大腸桿菌屬、梭菌屬,主要病毒群落是細小病毒科、乳頭瘤病毒科、二順反子病毒科。調(diào)查結(jié)果可作為貴州林下生態(tài)養(yǎng)雞疫病防控參考依據(jù)。