郭雨菲 于會(huì)勇 秦欣欣 劉國(guó)星 劉 暢李 磊 聶天旸 劉蓮蓮 翟志光 王成祥△

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029；3.北京市隆福醫(yī)院，北京 100010；4.臨渭劉尊基中醫(yī)診所，陜西 臨渭 714000；5.北京市鼓樓中醫(yī)醫(yī)院，北京 100009；6.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700）

甲型流感病毒（IAV）是引起急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）的重要病原體，特別在免疫力下降的人群中具有起病急、進(jìn)展快、死亡率高的特點(diǎn)，給全球帶來(lái)嚴(yán)重的醫(yī)療與經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。最新研究顯示流感病毒感染人數(shù)約占冬春季節(jié)所有急性呼吸道感染的三分之一［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計(jì)，每年有近10%的世界人口受到流感的侵襲，29～65萬(wàn)人死于流感［2］。IAV 具有高變異性，易導(dǎo)致耐藥病毒株的出現(xiàn)、疫苗效力下降以及全球范圍的大流行，而抗流感病毒藥物研發(fā)的滯后、疫苗接種率低、藥物存在不良反應(yīng)和受耐藥性影響等，使得抗流感治療仍然面臨嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)［3-4］。

IAV 感染大多歸屬于中醫(yī)學(xué)“時(shí)行感冒”“溫病”“疫病”范疇［5］。升降散出自《傷寒瘟疫條辨》，由僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃4 味藥組成，具有升清降濁、清熱祛風(fēng)之功效?！皽匦吧鲜?，首先犯肺”，邪熱內(nèi)郁，肺氣不得清肅，氣機(jī)升降失常，因此絕大多數(shù)外感熱病是以熱郁不能透達(dá)為病機(jī)。升降散中以僵蠶為君，蟬蛻為臣，升浮宣透，透達(dá)郁熱，正合《黃帝內(nèi)經(jīng)》“火郁發(fā)之”之旨；用僵蠶、蟬蛻升清而入衛(wèi)氣之分以開(kāi)上焦，升陽(yáng)中之清陽(yáng)；姜黃、大黃降濁由氣而及營(yíng)血，理氣血由中而達(dá)下焦，降陰中之濁陰，以達(dá)到氣機(jī)升降調(diào)和之功?，F(xiàn)已有實(shí)驗(yàn)研究表明升降散具有抗流感病毒作用，但其作用機(jī)制仍不明確。本研究從細(xì)胞的層面，體外觀察升降散干預(yù)流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株（A/PR8/34/H1N1）所致細(xì)胞病變的影響，驗(yàn)證升降散體外對(duì)IAV 的抑制作用，并進(jìn)一步探索其抗病毒作用機(jī)制，為研發(fā)防治流感病毒感染的中藥新藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒及細(xì)胞株 病毒株：流感病毒亞甲型鼠肺適應(yīng)株（A/PR8/34/H1N1，以下簡(jiǎn)稱PR8），由中國(guó)病預(yù)防控制中心傳染病所饋贈(zèng)，病毒經(jīng)雞胚傳代后，紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)得血凝滴度為1∶128。細(xì)胞株：狗腎細(xì)胞（MDCK），由中國(guó)病預(yù)防控制中心傳染病所饋贈(zèng)。細(xì)胞用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 藥物 升降散顆粒劑：僵蠶6 g，蟬蛻3 g，大黃12 g，姜黃9 g。購(gòu)自北京康仁堂藥業(yè)有限公司，采用水煮工藝提取有效成分，質(zhì)量可控。磷酸奧司他韋膠囊（75 mg，國(guó)藥準(zhǔn)字H20065415，批號(hào)0221901015，宜昌東陽(yáng)光長(zhǎng)江藥業(yè)股份有限公司）。藥物稀釋后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌保存。

1.3 試劑與儀器 PBS 緩沖液（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)20012043），DMEM 培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)11995065），青、鏈霉素母液（10 000 U/mL 青霉素G、10 000 μg/mL 硫酸鏈霉素，美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)15140122），HEPES（德國(guó)Sigma公司，貨號(hào)H4034-500 g），牛血清白蛋白組分V（7.5%溶液，美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)15260），胎牛血清（FBS，美國(guó)Gibco 公司，貨號(hào)10099141），EDTA 胰蛋白酶（0.05%胰酶，美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)25300062），TPCK 胰酶（美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)T8802-50MG），二甲基亞砜（DMSO，美國(guó)Sigma 公司，貨號(hào)506008），Cell Counting Kit-8（CCK8，北京翱擎生物科技有限公司，貨號(hào)AQ308），TRIzol Reagent［天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)DP424］，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)DBI Bioscience 公司，貨號(hào)DBI-2220）；熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)GeneCopoeia 公司，貨號(hào)AOPR-1200）。超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，型號(hào)BCN-1360），CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)NUAIRE 公司，型號(hào)NU-5510E），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，型號(hào)5810R），生物安全柜（Ⅱ級(jí)B2型，美國(guó)NUAIRE 公司，型號(hào)NU-425-600E），熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI 公司，型號(hào)7500）；微量核酸定量?jī)x（美國(guó)Merinton公司，型號(hào)SMA4000）。

1.4 病毒滴度測(cè)定 用病毒生長(zhǎng)液將流感病毒PR8原液稀釋成1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6、1×10-7各濃度梯度。將MDCK 細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種至96 孔板上，100 μL/孔，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2孵育至細(xì)胞基本長(zhǎng)滿單層，吸棄舊培養(yǎng)液，加入以上濃度梯度的病毒液，100 μL/孔，每個(gè)濃度梯度設(shè)置8 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置正常對(duì)照孔（只加入病毒生長(zhǎng)液），在CO2培養(yǎng)箱中吸附2 h 后棄病毒液，PBS 溶液洗滌后每孔加入100 μL 細(xì)胞維持液，繼續(xù)于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，同時(shí)記錄特征性細(xì)胞病變（CPE）的孔數(shù)。培養(yǎng)2 d 后，統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)病變孔數(shù)，按Reed-Muench 公式計(jì)算病毒的半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)感染劑量（TCID50）。

1.5 藥物對(duì)細(xì)胞的毒性測(cè)定 升降散顆粒和磷酸奧司他韋用細(xì)胞維持液分別從50 mg/mL和4 mg/mL對(duì)半稀釋成6 個(gè)濃度梯度，加入長(zhǎng)滿單層MDCK 細(xì)胞的96 孔板上，100 μL/孔，每個(gè)濃度梯度設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置正常對(duì)照孔（只加入細(xì)胞維持液）。96孔板在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2下孵育48 h 后，倒置顯微鏡下觀察CPE。吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液后用PBS 緩沖液洗滌3 遍，在每孔中加入100 μL 細(xì)胞維持液和10 μL CCK8溶液，并設(shè)置空白對(duì)照組（不含細(xì)胞，只加入維持液和CCK8 溶液），繼續(xù)在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h，在450 nm 波長(zhǎng)處對(duì)每個(gè)孔的吸光度值（A 值）進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算細(xì)胞的存活率，計(jì)算公式：細(xì)胞存活率=（A藥物組-A空白組）÷（A正常組-A空白組）×100%。以90%以上細(xì)胞存活率的藥物最小稀釋倍數(shù)為藥物的最大無(wú)毒濃度（TC0）；用Reed-Muench公式計(jì)算藥物的半數(shù)中毒濃度（TC50）。

1.6 升降散體外抗流感病毒PR8 的作用 升降散與磷酸奧司他韋稀釋至TC0，96 孔板上接種MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)至長(zhǎng)滿單層后，按照以下3 種不同給藥方式進(jìn)行干預(yù)給藥。1）預(yù)防作用：在孔內(nèi)加入藥物，100 μL/孔，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組，作用4 h 后吸棄并用PBS 緩沖液洗滌孔內(nèi)藥液，將100TCID50流感病毒PR8 接種于細(xì)胞，100 μL/孔，正常細(xì)胞對(duì)照組加入病毒生長(zhǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下吸附2 h 后吸棄并用PBS 緩沖液洗滌孔內(nèi)病毒液，換細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。2）直接作用：將100TCID50流感病毒PR8 和藥物混合，37℃下作用4 h，將混合液接種于MDCK細(xì)胞，100 μL/孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，正常細(xì)胞對(duì)照組加入細(xì)胞維持液與病毒生長(zhǎng)液的等量混合液，病毒對(duì)照組只加入病毒液，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下作用2 h 后吸棄并用PBS 緩沖液洗滌孔內(nèi)液體，換細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。3）治療作用：將100TCID50流感病毒PR8 接種于細(xì)胞，100 μL/孔，正常細(xì)胞對(duì)照組加入病毒生長(zhǎng)液，在CO2培養(yǎng)箱中37℃下吸附2 h后吸棄并用PBS緩沖液洗滌孔內(nèi)病毒液，在孔內(nèi)加入藥物，100 μL/孔，每組設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔，正常細(xì)胞對(duì)照組和病毒對(duì)照組加入細(xì)胞維持液，作用4 h后吸棄并用PBS 緩沖液洗滌孔內(nèi)藥液，換細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。按上述給藥方法，觀察并記錄各組CPE，待病毒對(duì)照組的CPE（++++）時(shí)，用CCK8 法測(cè)定并計(jì)算細(xì)胞存活率（測(cè)定和計(jì)算方法同1.5），并計(jì)算藥物對(duì)感染細(xì)胞的抗病毒有效率（ER）。計(jì)算公式：ER=（A藥物組-A病毒對(duì)照組）÷（A正常對(duì)照組-A病毒對(duì)照組）×100%。

1.7 流感病毒PR8 感染細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA 升降散與磷酸奧司他韋稀釋至TC0，96 孔板上接種MDCK 細(xì)胞培養(yǎng)至長(zhǎng)滿單層后，將100TCID50流感病毒PR8和藥物等量混合，37 ℃下作用4 h 后將混合液接種于MDCK 細(xì)胞，100 μL/孔，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，空白（正常細(xì)胞對(duì)照）組加入細(xì)胞維持液與病毒生長(zhǎng)液的等量混合液，病毒對(duì)照組只加入病毒液，在CO2培養(yǎng)箱中37 ℃下作用2 h 后吸棄并用PBS緩沖液洗滌孔內(nèi)液體，換細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)，在藥物處理后的12、24、48 h 收集細(xì)胞，用Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板，分別加入Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 引物進(jìn)行擴(kuò)增，見(jiàn)表1，引物均由北京利科麗生物科技有限公司設(shè)計(jì)與合成。PCR 反應(yīng)為20 μL 體系，含cDNA 2 μL，2× All-in-One qPCR Mix 10 μL，上下游引物（2 μmol/L）各2 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，雙蒸水3.6 μL。反應(yīng)條件：95℃10 min，95℃10 s，55℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后所得到的數(shù)值獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 的相對(duì)表達(dá)量（QR）：QR=2-ΔΔCt，ΔΔCt= （Ct待測(cè)樣本，目的基因-Ct待測(cè)樣本，內(nèi)參基因） -（Ct對(duì)照樣本，目的基因-Ct對(duì)照樣本，內(nèi)參基因）。

表1 actb、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS28.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，多組樣本間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)，用LSD 進(jìn)行多重比較，方差不齊采用非參數(shù)因子Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。兩組間比較，滿足正態(tài)性采用t檢驗(yàn)，不滿足正態(tài)性采用Mann-Whitney秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 病毒滴度測(cè)定結(jié)果 培養(yǎng)48 h 后，倒置顯微鏡下可以觀察到隨著稀釋倍數(shù)的增加，細(xì)胞病變程度逐漸降低。統(tǒng)計(jì)細(xì)胞出現(xiàn)病變的孔數(shù)后，根據(jù)Reed-Muench 公式計(jì)算病毒的TCID50，得到TCID50=10-5.20。本實(shí)驗(yàn)將采用100TCID50作為攻毒濃度。

2.2 藥物對(duì)細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果 磷酸奧司他韋和升降散的濃度增加，對(duì)MDCK細(xì)胞產(chǎn)生的毒性隨之加重，鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)變圓、皺縮，胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞粘連、破裂、脫落死亡等。根據(jù)CCK8 法測(cè)得磷酸奧司他韋和升降散的TC0分別為0.25、6.25 mg/mL，TC50分別為0.76、19.69 mg/mL，即確定0.25、6.25 mg/mL 分別為磷酸奧司他韋和升降散體外抗流感病毒作用的最高允許濃度。

2.3 升降散體外抗流感病毒PR8的作用 3種給藥方式下病毒對(duì)照組細(xì)胞明顯病變，細(xì)胞拉長(zhǎng)、粘連，或細(xì)胞變圓、脫落，甚至碎裂、溶解等，而升降散組與磷酸奧司他韋組的CPE程度較輕，且吸光度值較高。CCK8法測(cè)得各組不同給藥方式下的細(xì)胞存活率和抗病毒有效率（ER）如表2、表3 所示。3 種給藥方式下升降散和磷酸奧司他韋組的細(xì)胞成活率均高于病毒對(duì)照組（P＜0.05），升降散組的細(xì)胞存活率不如磷酸奧司他韋組，其中直接作用下，升降散的抗病毒有效率最高（ER=52.37%），而通過(guò)預(yù)防病毒侵入細(xì)胞來(lái)抗病毒的ER 較低，表明升降散具有一定的抗流感病毒PR8 株作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)即以直接作用為給藥方式。

表2 各組不同給藥方式下細(xì)胞存活率比較（%）

表3 不同給藥方式下藥物抗病毒有效率（%）

2.4 流感病毒PR8 感染細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA 表達(dá)水平 見(jiàn)表4。與空白組相比，攻毒12、24、48 h 后，病毒對(duì)照組的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9基因mRNA均有顯著上調(diào)（P＜0.05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)。磷酸奧司他韋組MDCK 細(xì)胞在12、24、48 h 的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 基因mRNA 表達(dá)明顯低于病毒對(duì)照組（P＜0.01）。與病毒對(duì)照組相比，升降散組MDCK 細(xì)胞在12、24、48 h 的Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 基因mRNA 表達(dá)均被顯著下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表4 各組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)比較（±s）

表4 各組細(xì)胞Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA相對(duì)表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，*P ＜0.05。

組 別空白組（n=3）病毒對(duì)照組（n=3）磷酸奧司他韋組（n=3）升降散組（n=3）時(shí)間12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h 12 h 24 h 48 h Caspase-3 1.00±0.12 1.06±0.04 1.08±0.06 4.92±0.07*6.41±0.16*8.03±0.48*2.06±0.17△△3.24±0.40△△4.17±0.42△△2.94±0.10△△4.37±0.18△△5.34±0.96△△Caspase-8 1.00±0.04 1.17±0.16 1.08±0.07 5.14±0.58*6.71±0.44*7.76±0.59*1.75±0.15△△3.06±0.31△△4.73±0.92△△3.53±0.38△△4.25±0.78△△6.26±0.94△Caspase-9 1.00±0.06 1.06±0.08 1.09±0.21 4.99±0.71*6.57±1.02*9.30±1.09*2.92±0.25△△3.86±0.61△△4.98±0.40△△3.81±0.20△△5.09±0.46△7.25±0.32△

3 討 論

流感病毒是造成呼吸道疾病的常見(jiàn)病原體之一，其致病性強(qiáng)、易變異、傳播能力強(qiáng)，因此具有強(qiáng)危害性。病毒進(jìn)入細(xì)胞后的增殖分為吸附、內(nèi)吞、脫殼、生物合成、組裝和出芽6 個(gè)過(guò)程［6］。現(xiàn)代研究表明流感病毒的致病機(jī)制主要有誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡/自噬/焦亡、造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和細(xì)胞因子風(fēng)暴等學(xué)說(shuō)。不同機(jī)制相互聯(lián)系、相互影響，形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。目前研究已發(fā)現(xiàn)多種中藥（如黃芩［7］、板藍(lán)根［8］、無(wú)毒干蟾［9］等）和中藥復(fù)方（如麻黃湯［10］、連花清瘟顆粒［11］等）、中藥活性成分提取物（如黃芩苷［12］、荊芥揮發(fā)油［13］等）具有體內(nèi)外抗流感病毒效果。由于流感病毒的變異性和耐藥性的增加，中藥抗病毒的多途徑、多靶點(diǎn)等優(yōu)勢(shì)逐漸顯現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)研究設(shè)計(jì)3 種給藥方式，分別觀察升降散是否具有對(duì)病毒的直接作用、對(duì)病毒侵入細(xì)胞的預(yù)防作用和對(duì)病毒穿入細(xì)胞后的治療作用，從而探索藥物對(duì)病毒的直接滅活、阻止病毒吸附及抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的生物合成等抗病毒作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，升降散在最大無(wú)毒濃度給藥時(shí)，3 種給藥方式下均能改善流感病毒PR8 誘導(dǎo)MDCK 細(xì)胞的細(xì)胞病變效應(yīng)，提高細(xì)胞存活率，表明其具有體外抗流感病毒的作用。且實(shí)驗(yàn)證明，升降散在最大無(wú)毒濃度給藥下，能夠通過(guò)直接滅活的方式抗流感病毒（ER＞50%）；升降散也能通過(guò)阻止病毒吸附及抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的生物合成而抗流感病毒，但作用效果較低（ER＜50%），結(jié)果表明其主要作用方式可能是對(duì)病毒的直接滅活作用，對(duì)于阻止病毒吸附及抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的生物合成作用相對(duì)較弱，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用直接滅活的給藥方式對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步探索。

流感病毒侵入宿主細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞產(chǎn)生凋亡反應(yīng)，屬于流感病毒致病機(jī)制之一。細(xì)胞凋亡受多因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控，有許多蛋白和細(xì)胞因子參與作用，如半胱天冬氨酸酶家族（Caspase）、Bcl-2 家族蛋白、Fas/FasL 等。細(xì)胞凋亡有多種途徑，最主要的3 個(gè)途徑是內(nèi)源性途徑（線粒體途徑），外源性途徑（死亡受體途徑）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［14］。線粒體介導(dǎo)的凋亡是通過(guò)線粒體膜透化促使細(xì)胞色素C 的釋放，最終導(dǎo)致Caspase-9的激活以及下游的執(zhí)行蛋白酶活化導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并與Bcl-2 家族蛋白的調(diào)控關(guān)系密切［15］。細(xì)胞膜表面的死亡受體及相應(yīng)配體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物并啟動(dòng)Caspase-8，Caspase-8 會(huì)激活其他執(zhí)行半胱天冬酶例如Caspase-3，使細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。可以說(shuō)Caspase-8和Caspase-9分別介導(dǎo)凋亡的外源性途徑和內(nèi)源性途徑［17-18］，而Caspase-3 是兩條途徑共同的下游效應(yīng)執(zhí)行蛋白酶［19］。近些年的研究發(fā)現(xiàn)多種中藥及有效物可以影響流感病毒感染細(xì)胞的Caspase家族蛋白的表達(dá)，從而抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。盧春化等［20］用黃芪多糖干預(yù)甲型流感病毒小鼠肺炎模型，發(fā)現(xiàn)中藥活性成分能下調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的表達(dá)，從而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡及保護(hù)肺組織的作用。劉曉婷［21］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷組的Caspase-3、Caspase-8 的mRNA 表達(dá)較模型組均明顯降低，對(duì)病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有干預(yù)作用。鄧東沅等［22］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在體外環(huán)境下，木樨草能夠降低Caspase 相關(guān)家族蛋白的表達(dá)從而干預(yù)流感病毒H1N1感染細(xì)胞的凋亡。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用熒光定量RT-PCR 方法，檢測(cè)流感病毒PR8 感染細(xì)胞中凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)mRNA 的表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，模型組Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 表達(dá)水平較空白組均顯著上升，表明病毒感染后確實(shí)會(huì)通過(guò)多途徑誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡引起細(xì)胞病變，且隨著感染時(shí)間的增加凋亡越發(fā)顯著，而升降散以最大無(wú)毒濃度給藥后12、24、48 h均可顯著下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的mRNA表達(dá)水平，表明其可通過(guò)外源性和內(nèi)源性兩個(gè)途徑抑制病毒感染后宿主細(xì)胞凋亡；其中12 h 的差異性較24、48 h更明顯，提示中藥的藥效在感染早期效果更明顯，可用于流感的早期治療。

綜上所述，升降散具有一定的體外抗流感病毒作用，且能通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)Caspase家族蛋白的基因表達(dá)，從而抑制流感病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由于流感病毒干預(yù)機(jī)體的作用機(jī)制和涉及的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，而中藥具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用特點(diǎn)，因此升降散對(duì)流感病毒感染的干預(yù)作用機(jī)制有待深入的實(shí)驗(yàn)研究。